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Artigo de método

Grande Escala da Purificação de suínos ou bovinos fotorreceptores Outer Segmentos para a fagocitose Ensaios sobre Retinal Pigment células epiteliais

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DOI:

10.3791/52100

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12 de dezembro de 2014

 ,  ,  ,  , 
1INSERM, U968, 2Sorbonne Universités, UPMC Paris 06, UMR_S 968, Institut de la Vision, 3CNRS, UMR_7210, 4Department of Biological Sciences, Center for Cancer, Genetic Diseases and Gene Regulation, Fordham University

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve o protocolo para a purificação de fragmentos do segmento externo (POS) fotorreceptores via ultracentrifugação de retinas suínas/bovinas usando homogeneização e centrifugação com gradiente de sacarose. Este protocolo permite a preparação de grandes estoques de alíquotas POS, rotuladas ou não, que podem ser armazenadas a -80 °C.

Resumo

Análise de uma das funções vitais do pigmento epitelial da retina (RPE) células, a fagocitose de fragmentos distais envelhecido gasto de segmentos externos de fotorreceptores (POS) pode ser realizado in vitro. Fotorreceptoras segmentos externos com pilhas de discos membranosos que contêm as máquinas phototransduction é continuamente renovado na retina. Passado POS são eliminados diariamente por células RPE. Roedor, suíno / bovino e células RPE humanas reconhecem POS a partir de várias espécies de um modo semelhante. Para facilitar a realização de uma grande série de experiências com pouca variabilidade, um grande stock de POS podem ser isolados a partir de olhos de porcos e armazenado congelado em alíquotas. Este protocolo tira proveito da característica de photopigments que exibem uma cor laranja quando mantidos no escuro. Sob a luz vermelha ofuscante, retinae são coletados em um buffer de viseiras abertas cortadas em metades. A suspensão de células da retina é homogeneizada, filtrada e carregado num gradiente de sacarose contínuo. Após centrifugation, POS estão localizados em uma banda discreta na parte superior do gradiente que tem uma cor laranja característica. POS são então recolhidas, centrifugadas, ressuspensas em tampões de lavagem sequencialmente, contadas e aliquotadas. POS obtidos deste modo podem ser utilizadas para ensaios de fagocitose e análise de activação da proteína, localização ou interacção em vários momentos após o desafio POS. Alternativamente, POS podem ser marcados com fluoróforos, e. G., FITC, antes de alíquotas para posterior quantificação de fluorescência de ligação de POS ou imersão. Outras aplicações possíveis incluem o uso de POS ou POS desafio modificado combinado com condições de estresse para estudar o efeito do estresse oxidativo ou envelhecimento sobre células RPE.

Introdução

Na retina, a visão é desencadeada por isomerização de moléculas fotossensíveis chamados opsinas, antes de ser transformado em um sinal que pode ser transmitido entre os neurónios para cima para as áreas visuais no cérebro. Estas moléculas são incorporados em pilhas de discos que se assemelham panquecas membranosas que constituem as partes segmentares exterior de células fotorreceptoras (RP). Sendo submetido a constante exposição à luz e, portanto, os níveis consideráveis ​​de estresse oxidativo, PRs renovar continuamente os seus segmentos externos para limitar o dano oxidativo potencial. Segmentos externos fotorreceptoras estão em contato próximo com microvilosidades apical das células do epitélio pigmentado da retina vizinhos (RPE). Células RPE constituem a parte exterior da barreira hemato-retiniana e garantir inúmeras tarefas que são cruciais para fotorreceptores saúde e função 1, como o que extingue os raios de luz através de pigmentos de melanina, re-isomerização do retinal componente opsina fotorreactivo, fornecendo nutrientes e gCRESCIMENTO fatores, participando de eliminação PR metabólito.

Além disso, as células de RPE eliminam gasto POS e reciclar seus componentes, uma ocupação diária, que é regulada pelo ritmo circadiano na retina de mamíferos 2,3. A folga de galpão POS é absolutamente necessário para a sobrevivência PR. Quando ele está completamente revogada, POS detritos se acumulam e PRs degenerar causando 4,5 perda de visão rápida. Se o perfil rítmico é perdida e substituída por uma actividade constante, defeitos PR e RPE acumular com 6 anos de idade. Portanto, é muito importante para caracterizar a regulação molecular de EPR fagocitose in vitro, a fim de compreender fenótipos ligados à sua disfunção. Curiosamente, a maquinaria molecular em células RPE é muito semelhante à utilizada pelos macrófagos para eliminar as células apoptóticas e ambos dependem do reconhecimento de fosfatidilserina exposta em detritos fagocítica 7-9. Ainda, as células de RPE e macrófagos regular o pHagocytosis de forma diferente, como macrófagos optar pela eliminação imediata das células em apoptose em tempo de encontro, enquanto as células RPE ritmicamente engolfar POS apenas uma vez por dia, apesar de estarem em contato permanente com segmentos externos. Isto sugere mecanismos de regulação específicos que ainda não são totalmente compreendidos.

Muitas das moléculas envolvidas na maquinaria de EPR fagocítica foram identificados e validados graças à utilização de POS isolado e ensaios de fagocitose de cultura de células. O receptor de integrina alphavbeta5 localizado na superfície apical de células RPE, em coordenação com o seu ligando MFG-E8, liga-se especificamente ao POS 10-12, que são então internalizado através do receptor tirosina-quinase MerTK 13-15. O scavenger receptor CD36 tem sido mostrado para participar na ingestão de POS e influenciar a sua velocidade de 16,17, e poderá servir como um sensor de fosfolípidos oxidados na superfície POS 18. Internalização precisa o recrutamento de F-citoesqueleto de actina-assproteínas, tais como a anexina ociated 2 19, 20 e miosina II miosina VIIA 21,22. POS Native ou oxidado in vitro também são utilizados para entender o envelhecimento fenótipos de células RPE in vivo ligados ao acúmulo de mal digeridos POS oxidado 23-28. A geração de células epiteliais pigmentares derivadas de células-tronco deu início a uma nova aplicação para o isolado POS que são usados ​​para provar a funcionalidade das células antes de serem transplantadas para animais ou pacientes 29,30,27.

Descrita pela primeira vez por Molday e colegas em 1987, 31, o protocolo para o isolamento de POS bovina combina um passo ultracentrifugação de homogeneizados de retina em gradientes de sacarose contínuas com observação da aparência laranja característico de fotopigmento retinal crus (levando 11- retinal cis). Nos últimos 10 anos, devido a precauções tomadas, a fim de minimizar o risco de doença da vaca louca, o uso de olhos de porco tornou-se increasingly proeminente. O protocolo aqui descrito mostra como obter grandes quantidades de POS de porcina ou bovina olhos que podem ser distribuídos em alíquotas e armazenados por longos períodos de tempo. Isto elimina a necessidade de preparar a partir de POS de roedores olhos, o que exige a utilização de um grande número de animais em cada preparação e ensaio de POS 32,33,21,22. Além disso, detalhes sobre rotulagem POS antes de armazenamento utilizando moléculas fluorescentes são dadas, para quantificar e visualizar POS de uma forma simplificada e comparáveis ​​para algumas aplicações, em comparação com a rotulagem POS após o ensaio de fagocitose 32,10. Portanto, estes grandes existências permitir a reprodutibilidade e facilidade de utilização, em muitos tipos diferentes de experiências.

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Protocolo

Este experimento isolamento POS é demorado e pode precisar de até 12 horas para ser concluído se POS são rotulados antes do armazenamento. O protocolo foi adaptado de um artigo publicado pelo RS Molday e colegas em 1987, 31 e modificado por SC Finnemann e colegas em 1997 10.

Os animais foram tratados de acordo com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research. Os protocolos foram revisados ​​e aprovados pelo Comitê de Charles Darwin Ética da Universidade Pierre e Marie Curie em Paris, 06 e Comitê Institucional Animal Care e Uso da Universidade Fordham.

1. Geral Set Up

  1. Obter 80 frescas de suíno ou de vaca olhos tão fresco, logo após o abate quanto possível e mantê-los refrigerados no escuro. Fornecer instruções para o provedor para que a empresa procede da mesma maneira. Este protocolo é otimizado para 80 olhos. Paraprosseguir com mais olhos e obter estoques maiores (por exemplo, a partir de 160 olhos), o dobro das quantidades de solução e realizar duas rodadas de ultracentrifugação; amostras de piscina mais tarde, na etapa de coleta (veja o passo 2.2.2).
  2. Configure no banco a lâmpada safelight vermelho, absorventes, lenços (tabela de materiais). Prepare 15 centímetros pratos e sacos de risco biológico para a recolha de resíduos (partes do olho não utilizado, vítreo ...). Usar apertada labcoat, luvas, mangas de protecção e óculos de proteção.
  3. Precauções:
    1. Pré-chill todas as soluções, em seguida, mantê-los frio durante todas as etapas. Manter os olhos e gradientes refrigeradas em gelo tanto quanto possível.
    2. Manter os olhos e tecidos derivados no escuro, tanto quanto possível até que o passo de recolha após a ultracentrifugação a fim de evitar a fotodegradação de pigmentos visuais e perda da coloração laranja-rosa da forma activa dos photopigments.

2. Protocolo de Ações

  1. Preparar soluções e gradientes:
    1. Estoque taurina Thaw completamente através de um banho de água a 37 ° C.
    2. Prepare todas as soluções de soluções de estoque (Tabela 1, soluções de reserva) e misture bem a sacarose com outros ingredientes, usando um agitador magnético para cada solução.
      1. Preparar 15 ml da solução de homogeneização a uma concentração final de 20% de sacarose, 20 mM Tris pH 7,2 de etilo, 2 mM de MgCl 2, 10 mM de glicose e 5 mM de taurina.
      2. Preparar a solução de sacarose a 25% para uma concentração final de sacarose a 25% (utilizando 70% de sacarose estoque), 20 mM de acetato de tris pH 7,2, 10 mM de glicose e 5 mM de taurina.
      3. Preparar a solução de sacarose a 60% para uma concentração final de 60% de sacarose (usando pó de sacarose), 20 mM Tris pH 7,2 de etilo, glicose 10 mM e 5 mM de taurina.
      4. Preparar a solução de lavagem para uma concentração final de 20 mM de acetato de tris de pH 7,2 e 5 mM de taurina.
      5. Preparar a solução de lavagem 2a uma concentração final de 10% de sacarose, 20 mM de acetato de tris de pH 7,2 e 5 mM de taurina.
      6. Preparar a solução de lavagem de 3 a uma concentração final de 10% de sacarose, 20 mM de fosfato de sódio pH 7,2 e taurina 5 mM.
    3. Firmar o fabricante de gradiente com um agitador magnético e inserir uma barra de agitação na câmara mais próxima da saída, onde a solução de 60% será inserido. Usar uma pipeta de ponta P200 de corte colocado na saída da tubagem para alcançar velocidade de vazamento adequada.
    4. Fundido gradientes lineares delicadamente por diluição e agitação da solução de sacarose a 60% com o um, 25% a partir de 12 ml de cada solução (isto é, o total de 6 tubos de 80 olhos) em tubos de ultracentrífuga previamente arrefecidos. Mexa bem a solução de sacarose gradualmente-diluição de 60%. Firmar a velocidade do fluxo de gradiente, derramando a solução de forma suave e não muito rápido.
      NOTA: De modo a obter um gradiente contínuo, linear, manter a ponta da pipeta de abertura à direita na superfície da solução durante todo o gradiente formation.
    5. Deixe os gradientes de sentar no gelo por cerca de 1 hora para a estabilização. Mantenha os gradientes refrigeradas até carregado. Não agite os tubos para evitar a interrupção do gradiente.
  2. Coleta de tecido:
    1. Recolha tecidos sob luz vermelha ofuscante. Tome um olho em uma das mãos e picar a frente com borda de lâmina de barbear, mantendo o olho longe (para evitar respingos; Figura 1). Use a lâmina de barbear para cortar o globo ocular anterior em duas metades (córnea, além de pelo menos 5 mm no esclera). Retire a lente e virar o ocular dentro para fora, de modo que ele pode ser realizada através da ponta de um dedo expondo assim a retina.
    2. Usando a lâmina em ângulo, raspe a retina, separando facilmente e aparecendo como uma camada rosada, fora da superfície das células do tapete e cortado na cabeça do nervo óptico (Figura 1). Recolha todas as retinas em 2 x 50 ml bisnagas contendo 15 ml de solução de homogeneização sobre gelo.
    3. Homo Retinahomoge-:
      1. Agitar a suspensão vigorosamente à mão durante 2 minutos a fim de interromper as diferentes camadas de células, quebrar POS fora do resto da célula PR, POS fragmento e homogeneizar a suspensão retina.
      2. Filtrar através de um 3x dupla camada de gaze para remover os fragmentos de tecido grandes e recolher o fluxo de passagem em tubos de 50 ml limpos (Figura 1). A suspensão da retina de ser bastante espessa, para maximizar o rendimento, pressionar suavemente sobre a gaze para libertar restantes tecidos fragmentadas após cada filtração.
  3. Fotorreceptores exterior fragmento segmento (POS) de isolamento:
    1. Cuidadosamente, coloque o prep retina bruto, cerca de 6-7 ml por tubo, mais de 6 x 30 ml tubos de ultracentrífuga, cada uma contendo 24 ml de frescas, refrigeradas contínua 25-60% gradiente de sacarose (Figura 1). Equilibrar os tubos opostos, conforme apropriado para o rotor a ser utilizado. Ultracentrífuga a 106.000 xg durante 50 min a 4 ° C.
    2. Remover a maior parte da solução acima da banda laranja-rosa no terço superior do gradiente por aspiração (Figura 2A). Colher a faixa laranja-rosa com um P1000 ponta de corte para um copo. Descartar o resto depois neutralizar o uso de alvejante (resíduos biológicos).
    3. Dilui-se com ~ 4 - 5 volumes de gelado de lavagem uma solução. Separa-se em tantos tubos de 30 ml, conforme necessário. Centrifugar a 3.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante cuidadosamente.
    4. Ressuspender as pelotas em 10 ml de solução de lavagem 2 e centrifugação a 3000 xg durante 10 min como descrito acima. Ressuspender as pelotas em 15 ml Lavar 3 e roda de novo a 3000 xg durante 10 min. Combinar suspensões de vários peletes para reduzir o número de tubos necessários antes da centrifugação em 2 de lavagem e lava-se três soluções.
  4. POS alíquotas sem rotulagem:
    1. Ressuspender POS em 10-20 ml DMEM. Pré-diluir 10 ml em 490 DMEM ul (1:50) e contagem alongados, bem como POS girou em umcâmara de contagem celular (Figura 2B). Calcule o rendimento e concentração em partículas POS por mL.
      NOTA: O rendimento varia, dependendo principalmente da idade e da estirpe de porcos e vacas / tamanho dos olhos, por exemplo, uma boa preparação varia 5-8 x 10 9 a partir de POS 80 olhos de porco.
    2. Decidir sobre o volume final de DMEM (tipicamente 10 - 20 ml) e adicionar sacarose para se obter uma concentração final de 2,5% de sacarose.
    3. Preparar alíquotas do tamanho desejado, por exemplo, 5 x 10 7 POS por tubo para um volume de 2 ml para a ressuspensão de 96 poços de ensaio a 40 ul / poço. Gire uma alíquota de 5 min a 2.300 xg à temperatura ambiente e avaliar o tamanho da pelota. Prepare vários tamanhos alíquotas para diferentes volumes de aplicação como POS não devem ser congeladas e descongeladas duas vezes.
    4. Congelar alíquotas POS a -80 ° C até à sua utilização.
      NOTA: As aliquotas são estáveis ​​durante muitos meses. Em nossas mãos, sem rótulo ou rotulados POS podem ser armazenados por pelo menos um ano.
  5. Rotulagem POS e alíquotas:
    NOTA: De modo geral, utilizar FITC para marcar POS para a quantificação de ensaios de fagocitose, mas outros corantes podem ser usados ​​também em função das necessidades.
    1. Ressuspender 1 10 mg de FITC a um frasco de 2,5 mg / ml de concentração em 0,1 M de tampão de carbonato de Na de pH 9,5 por mistura de 2,6 ml de NaHCO3 0,1 M pH 8,4 com 1,4 ml de 0,1 M de Na 2 CO 3 pH de 11,5 (Quadro 2, soluções de reserva). Girar durante 1 hora à temperatura ambiente ao mesmo tempo proteger da luz e centrifugação durante 5 minutos à velocidade máxima, para sedimentar os sólidos não-FITC ressuspensas.
    2. Ressuspender o sedimento em 10 ml de POS de lavagem de solução de 3 (ou DMEM) e juntar 2 ml de solução de FITC para 80 olhos. Armazenar sobra FITC congelado a -80 ° C. Para rodar, pelo menos, 1,5 horas à temperatura ambiente. Proteger da luz usando papel alumínio.
    3. Lavar POS marcado duas vezes, utilizando solução de lavagem 3, como descrito na secção 2.3.4, em seguida, uma vez ou duas vezes em DMEM até quase nenhuma FITC livre é visto no sobrenadante frAction. Ressuspender POS em DMEM e proceder como para POS não marcado para contagem e alíquotas (seção 2.4).
  6. Usando POS em experiências:
    1. POS Thaw à RT, e mantê-los no escuro, tanto quanto possível, se eles são fluorescently marcado. Girar durante 5 minutos a 2300 xg à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante.
    2. Imediatamente ressuspender em volume apropriado de solução de ensaio como ditado pela experiência. Em caso de diferentes tempos de desafio POS, loja novamente suspensas no POS RT no escuro entre pontos de tempo por várias horas.

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Resultados

A combinação do gradiente linear de sacarose e a ultracentrifugação permite a separação dos diferentes componentes da suspensão da retina por densidade. As células de RPE e detritos pesados ​​maior da retina para afundar ou perto do fundo do gradiente (Figura 2A). Isqueiro POS e células mais leves individuais ou detritos celulares a partir da retina migram como bandas distintas para alcançar o topo da metade do gradiente até ao final do período de centrifugação. Ao manter os olhos e as amostras no escur...

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Discussão

Três degraus ou condições são cruciais para uma purificação optimizado: qualidade da carcaça de gradiente e manipulação delicada tubos de gradiente, mantendo tecidos refrigerada e no escuro até que o passo de recolha, a força de agitação de homogenatos da retina para se obter o isolamento POS adequado do restante da PR célula. Se algumas questões surgem em ver a banda laranja corretamente, eles são provavelmente devido a uma das três razões acima (ver também o segundo parágrafo da seção Resultados). Alg...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesse financeiro conflitante.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs a EFN), Fondation Voir et Entendre e Fondation Bettencourt Schueller (Grants Jovem investigador EFN), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, posição permanente para EFN) e The National Eye Institute dos Institutos Nacionais de Saúde (R01-EY13295 para SCF). Além disso, o Institut de la Visão é financiado pelo Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre National de la Recherche Scientifique e do departamento de Paris.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Material/Equipamento Específico
2 Câmaras gradiente fabricantecom câmaras de 30 ml
Tubulação de silicone de 3 mm depara fundição gradiente
BarraBarra de agitação encaixando a câmara do fabricante gradiente
LâmpadaLâmpada inactínica para dissecção no tubos escuros
Ultra Clear 25 x 89 cmBeckman344058Tubos de ultracentrifugação
Tubos PP Oak RidgeNalgene3119-0050Tubos de centrifugação de 30 ml
Optima LE-80KBeckman Coulter365668Ultracentrifuge
SW 32Ti rotor de giroBeckman Coulter369694Rotor de giro para ultracentrífuga
Avanti J-26 XPCentrífuga 393124 Beckman Coulter
JA-25.50 rotorBeckman Coulter363058Rotor para centrífuga Avanti J-26 XP
Isômero FITC ILife TechnologiesF-1906Corante
Outros materiais/equipamentos
Câmara de contagem (como Neubauer ou Malassez)
Baldes de gelo escuro com tampas
Balanças
Agitador magnético e pólo
Microcentrífuga
37 ° C banho-maria-80
& C freezer
Consumíveis
LabcoatSaúde e segurança
Luvas
Protetores
Óculos Almofadas
absorventes Sacos
lixeiras
Lâminas Weck-Prep DissecçãoLâminas de barbear de 60 mm/2,25 polegadas de largura Prato
de plástico de 15 cm
gaze estéreis
Tubos de 15 e 50 ml Consumíveiscomuns
Microtubos Folha
de alumínio
diâmetro de agitação magnética de tamanho pequeno de luz de segurança vermelha fluorescentede sustentaçãorefrescadade manga e de risco biológicoFolhas de

Referências

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