Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Resumo

Imagens ao vivo da cóclea de mamíferos embrionária é um desafio porque os processos de desenvolvimento na mão operam em um gradiente temporal, ao longo de dez dias. Aqui é apresentado um método para a cultura e, em seguida, imagiologia embrionário tecido de explante da cóclea retirado de um rato repórter fluorescente ao longo de cinco dias.

Resumo

Aqui apresentamos um método para longo prazo de imagem time-lapse de explantes embrionárias de rato cocleares ao vivo. O programa de desenvolvimento responsável pela construção da altamente ordenada, estrutura complexa da cóclea de mamíferos prossegue por cerca de dez dias. A fim de estudar alterações na expressão do gene ao longo deste período e a sua resposta a farmacêutica ou manipulação genética, a imagem latente a longo prazo é necessário. Anteriormente, imagens ao vivo tem sido tipicamente limitada pela viabilidade do tecido explantado numa câmara humidificada em cima de um microscópio padrão. Dificuldade em manter condições óptimas para o crescimento da cultura no que respeita à humidade e temperatura colocou limites no comprimento de experimentos de imagem. Um microscópio integrados em um incubador de cultura de tecido modificado proporciona um ambiente excelente para a imagem latente a longo prazo ao vivo. Neste método demonstramos como estabelecer rato embrionárias explantes cocleares e como usar um microscópio de incubadora para realizar lapso de tempo imaging utilizando tanto microscopia de campo brilhante e fluorescência para examinar o comportamento de um dia de desenvolvimento embrionário normal (E) e 13 de explante da cóclea Sox2, um marcador das células prosensory da cóclea, ao longo de 5 dias.

Introdução

A cóclea dos mamíferos é um órgão complexo altamente ordenada. No rato, entre o surgimento do ouvido interno primitivo da vesícula ótica no dia E11 e conclusão do programa de desenvolvimento em fases pós-natais, várias ondas de sinalização celular e mudanças coordenadas na expressão gênica ocorrem. Correndo de base para o ápice do ducto coclear é o som detectar epitélio sensorial, ou órgão de Corti. Desenvolvimento do órgão de Corti é primorosamente controlada de tal forma que até o final de desenvolvimento, ele será composto de uma única fileira de células ciliadas internas, três fileiras de células ciliadas externas intercaladas com cinco fileiras de células de suporte (duas fileiras de células pilares, três linhas de células de Deiters ') ^1. Desvio dessa ordem resultados precisos em perda auditiva, heighlighting a importância de studye ofthe gênese e padronização do epithemlium sensorial ^2.

Cultivo in vitro da coch embrionárias de ratolea é uma ferramenta essencial para o estudo dos mecanismos de desenvolvimento do órgão de Corti. Esta técnica foi estabelecido em 1974 e ao longo dos últimos 40 anos, tem sido utilizado para elucidar muitos dos mecanismos pelos quais o epitélio sensorial é especificado e o órgão de Corti estabelecidos ^3. A cóclea é um órgão complexo com processos de desenvolvimento dinâmicos; uma manipulação pode levar até sete dias para manifestar ^um. Por exemplo, quando a adição de inibidores de GSK 3β a uma cultura de explante da cóclea em E13, o período de incubação óptimo para observar um efeito robusto do que o composto é seis dias ^4.

Imagens ao vivo da cóclea desenvolvimento permite investigação sobre as mudanças na morfologia do órgão de Corti, mudanças na expressão gênica, acompanhamento de migração, proliferação ou células que morrem, e isso permite a observação em tempo real dos resultados dos agentes farmacêuticos e rompimento de sinalização percursos. Até agora, a imagem da cóclea viverfoi principalmente realizada usando microscopia confocal a imagem pequenas áreas do órgão de Corti ao longo de períodos de tempo curtos ^5-8, mas esta técnica tem limitações devido a viabilidade explante. Em imagiologia dos efeitos das manipulações de longo prazo sobre os processos de desenvolvimento lento, o ambiente de imagem é crucial. Normalmente, um sistema de imagem ao vivo confocal utiliza uma caixa de plástico umidificado que se senta no microscópio. O calor e humidade pode escapar através das aberturas na caixa de incubação onde se encontra com a tabela de microscópio, através das janelas de acesso, através das aberturas articuladas e através das lacunas em torno de várias partes do microscope- tais como o objectivo ou a fonte de luz. Este não é o ideal para a manutenção de explantes saudáveis ​​por mais do que dois ou três dias.

Nós definimos 'incubadora microscópio' como um microscópio invertido vedado dentro de uma incubadora de CO ₂ padrão, em vez de uma incubadora construído em torno do microscópio. Uma incubadora microscópio extende a vida do experimento de tal modo que, em vez de imagem ao longo de dois ou três dias, as amostras podem ser visualizados por até duas semanas. Um microscópio incubadora oferece um excelente ambiente para o crescimento e diferenciação celular, com o mínimo de perturbação explantar culturas e condições padrão controlado. Em estudos que têm lugar ao longo de vários dias, é comum recorrer a amostras de imagem numa base diária, removendo-os da incubadora e levando-as a um microscópio de fluorescência invertido. Embora essa abordagem possa funcionar, de retirar os pratos da incubadora inflige estresse sobre o tecido em desenvolvimento sensível. Mudanças na acidez do meio de cultura e as flutuações na temperatura devido à remoção da incubadora pode resultar em desenvolvimento abaixo do ideal e do tecido saudável. Imagiologia da mesma região no mesmo plano focal e com a mesma orientação em cada ponto de tempo é extremamente desafiador. Ao utilizar um sistema automatizado dentro de uma incubadora, é possível manter saudáveltecido, para recolher imagens em mais pontos de tempo e para assegurar que a mesma área seja capturado em cada quadro. Nos últimos anos têm sido desenvolvidas várias incubadoras microscópio de tecido integrados, estes têm sido úteis não só na prática clínica ^9, mas também em células estaminais e cancro da investigação ^10,11.

Aqui apresentamos um protocolo para criação de imagens ao vivo de longo prazo de explantes embrionárias de rato cocleares. Usamos um sistema de microscopia automatizada dentro de uma incubadora de CO ₂ padrão que tem a capacidade de capturar imagens de várias amostras em pontos de tempo definido. O sistema consiste de um microscópio invertido definido dentro de uma incubadora. As amostras são colocadas num estrado rotativo que permite imagens de múltiplas amostras em cada ponto de tempo. Iluminação, captura de imagem e rotação do estrado são controlados por um sistema automatizado operado através de software Metamorph. Ao definir uma rotina de imagem usando o software operacional, podemos definir um experimento para funcionar por até twO semanas com mínima intervenção humana. Neste exemplo, vamos usar tanto de campo claro e fluorescência para mostrar crescimento em larga escala e rearranjo da cóclea e, especificamente, a região prosensory. Neste experimento, cóclea serão dissecados de ratos repórter Sox2 ^EGFP no dia embrionário E13. Será estabelecida culturas in vitro e depois trabalhada ao longo de cinco dias.

Protocolo

Tecido Mouse foi colhida a partir de Sox2 ^EGFP -reporter camundongos mantidos ¹² e sacrificados de acordo com o Canadian Council on Animal Care diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. A cultura embrionária cóclea

1. Suplemento de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) por mistura de 8,89 ml de DMEM, 1 ml de soro fetal bovino (FBS), 100 ul de 100x suplemento N2, e 10 ul de 10 mg / ml ciprofloxacina. Suplemento Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) por mistura de 495 ml de HBSS com 5 ml de 100% de HEPES.
2. Prepare vidro placas de cultura de fundo:
   1. Em uma câmara de fluxo laminar, ressuspender 200 ul porão substrato extracto de membrana em 5 ml de DMEM. Prepare 35 milímetros de vidro diâmetro placas de cultura de fundo com 10 poços mm. Pipetar 150 ul de substrato / DMEM para o centro de cada prato de vidro de fundo. Estes pratos podem ser utilizados depois de 40 min de incubação, ou pode armazenada num CO ₂ Incubadora a 35 ° C durante pelo menos uma semana.
      NOTA: O vidro de fundo pratos são utilizados para as seguintes razões: para assegurar que a base do prato é transparente e adequado para imagiologia, para criar um buraco no centro do prato que permite que os explantes para se estabelecer em uma área facilmente localizado e finalmente de modo que, depois de uma experiência, a amostra pode ser processado para imunocoloração e análise subsequente.
3. Prepare o posto de trabalho e ferramentas:
   1. Ligue o fluxo laminar banco limpo e lavar com etanol 70% para criar um espaço de trabalho limpo. Mergulhe pinças, colheres, e um preto 184 elastômero de silicone prato (uma mistura de 184 elastômero de silicone (10 partes), agente (1 parte) e carvão vegetal em pó (2,5 g) de cura) em etanol 70%.
4. Na estação de trabalho limpa, embriões colheita para o experimento. Coletar embriões de gestação apropriado no gelo frio HBSS suplementado com 1% de HEPES.
   1. Determinar um órgão externo ou visível que vai demonstraratividade repórter e examinar os embriões usando um microscópio estéreo fluorescente. Recolher os embriões que apresentam actividade repórter em gelo frio HBSS suplementado com 1% de HEPES como estes são o objecto da experiência.
5. Recolha ossos temporais:
   1. Trabalhando rapidamente, usando uma fonte de luz fria e uma pinça fina, recolher as cabeças dos filhotes. Tome cuidado para cortar na vértebra cervical e abaixo do queixo, para evitar danos aos ossos temporais.
   2. Abra cuidadosamente o crânio. Remover o cérebro, aparar a parte frontal da cabeça, e transferir o posterior do crânio para gelo HBSS frio fresco suplementado com 1% de HEPES em um prato limpo. Dissecar cuidadosamente os ossos temporais em forma de amendoim tendo o cuidado de manter o sistema vestibular no tato.
6. Dissecar a cóclea:
   1. Transfira os ossos temporais para um prato revestido de elastômero de silicone preto no gelo frio HBSS suplementado com 1% de HEPES, fixar a região vestibular do osso. Insira os pinos de insetos emum ângulo oblíquo, a fim de estabilizar o osso temporal e criar espaço para a pinça. Cravado é um passo crucial no processo como se o osso temporal pode se mover muito, é muito difícil para colher uma cóclea intacta.
   2. Cuidadosamente retire a cartilagem ao redor da cóclea. Inserir um dente do fórceps para a cartilagem na borda exterior da base da cóclea e cortar um furo para a cartilagem.
   3. Clipe uma aba para cima o lado, inserir o dente do fórceps e suavemente separar o telhado da conduta a partir da cartilagem. Clipe horizontalmente na parte superior e na diagonal, e com cuidado levante a parte da frente da cápsula. Insira um pino da pinça entre a cartilagem restante eo duto e gentilmente cortar fora a última seção. A superfície apical da cóclea está agora exposta.
   4. Começando na base, apanhar a área onde o telhado da conduta se encontra com o epitélio coclear e abrir o ducto coclear. Retire suavemente o telhado, aparandoquando necessário, até que esteja completamente removida. Apare fora qualquer porção de membrana esquerda no lado medial do duto. Limpe a conduta de excesso de tecido mesenquimal e retire o duto do sistema vestibular.
7. Cultura explantes:
   1. Coloque um explante, luminal superfície para cima, no centro de um substrato de vidro revestido cultura inferior prato, cuidadosamente desenhar fora todo o líquido e deixe por dois minutos. Adicionar 150 mL de DMEM suplementados gota a gota para o explante, tomando cuidado para não perturbá-la. Caso o explante flutuar livremente, reposicionar com uma pinça, mas tomar cuidado para que o explante deposita-se no fundo do prato de modo que ele pode anexar ao substrato.
   2. Coloque os pratos com fundo de vidro em uma profunda 12 centímetros de diâmetro prato de petri, com um pequeno prato de água estéril para manter a umidade. Coloque as culturas para uma incubadora a 35 ° C durante a noite para que o explante para anexar ao substrato e achatar.

2. Vivo Imaging

1. Selecione amostras de explante. Use um microscópio estéreo fluorescente para avaliar a condição de cada cóclea explante. Somente selecione explantes, onde o duto está intacta e anexado ao vidro da base ao ápice.
2. Definir a incubadora a 35 ° C com 5% de CO ₂ para cultura de tecidos coclear. Coloque as culturas no incubador microscópio:
   1. Gentilmente aspirar fora do DMEM suplementado e substituir com pelo menos 500 mL de mídia fresco. Para geração de imagens até 6 dias, 1-1,5 ml é melhor. Nos casos em que os explantes estão frouxamente ligados, pipetar um anel de meios de comunicação em torno da borda do prato. Este líquido extra vai fazer uma "câmara úmida" em miniatura, sem perturbar o explante, enquanto que continua a atribuir à matriz.
      1. Alternativamente, o uso articulado prato cobre para abrir as pálpebras, enquanto o prato permanece em sua instalação no microscópio se os reagentes precisam ser trocadas durante os intervalos entre coleções de imagens. Tampas articuladas prato permitir que as tampas para serabriu sem perturbar as amostras ou remover os pratos de suas configurações. Isso mantém a sua posição exata para captura de imagens subsequentes.
   2. Inserir os pratos de vidro de fundo contendo amostras adequadas no suporte do prato de amostras. O microscópio, neste exemplo, tem uma plataforma rotativa que contém oito pratos de 35 milímetros de amostra.
   3. Sob o capô fluxo laminar substituir as tampas de plástico com tampas de vidro e coloque os pratos no suporte do prato de amostras. Coloque o suporte do prato de amostras dentro da incubadora tomando cuidado para não desalojar os explantes a partir do fundo do prato ou perturbar os meios de comunicação.
3. Configure a rotina de imagem:
   1. Ligue o microscópio, lâmpada UV e câmera e abra o software de imagem.
   2. Localize as amostras, escolher uma área de imagem, plano de foco e ajustar os tempos de exposição para cada prato em sequência. Escolha do plano de foco em função não só a visão do explante no momento da partida, mas aiassim tendo em conta a forma como o tecido vai passar e quanto tempo o curso do tempo será executado.
   3. Definir uma pilha Z centralização em torno do plano focal selecionado no canal de fluorescência. Defina a frequência ea duração da amostragem para o experimento. A frequência de amostragem será limitado pelo tempo que leva para coletar imagens, de modo que este deve ser determinado após a seleção de campos de visão e definir uma pilha Z. Neste caso, a amostragem ocorre a cada 30 minutos durante cinco dias. A duração da experiência pode ser de até 14 dias.
4. Gerar um filme:
   1. No final do período de intervalo de tempo abrir os ficheiros de imagem. Neste caso, o software Metamorph que abre pontos de recolha sequenciais é utilizada. Quadro a quadro escolher o melhor plano focal para mostrar a população de células de interesse.
   2. Converter essas imagens para um arquivo .avi, ou exportá-los como uma montagem para gerar um conjunto de imagens que podem ser abertos e analisados ​​no software de processamento de imagem ou convertidos em forma múltiplats usando o software de processamento de vídeo.

Resultados

Aqui nós mostramos uma montagem (Figura 1) e um filme (Figura 2), demonstrando como um explante coclear organotípico típico vai crescer se banhado em E13.5. Um repórter do mouse Sox2 foi usado para visualizar a região prosensory. O filme ilustra que a cóclea sofre de crescimento e convergência e extensão, as células na região lateral do domínio Sox2 verde não parecem tão dividir o tecido circundante que se expande. Esta é uma característica do órgão de Corti; sobre o e...

Discussão

Há vários pontos técnicos a considerar quando as culturas são estabelecidas e na criação do microscópio de lapso de tempo, a fim de imagem a longo prazo.

Usamos matriz da membrana basal, como um substrato para a cultura de explantes de cóclea, mas o substrato deve ser compatível com o tipo de célula. Por exemplo, a imagem culturas neuronais, pode ser melhor para proporcionar um revestimento de fibronectina. A temperatura de incubação e composição do gás também deve ser escolhido de acordo co...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de Águia Modificado Dulbecco	Gibco	12430	Várias marcas fabricam este
extrato de membrana Basement	Corning	354230	Matrigel. Produtos similares alternativos estão disponíveis em outros fornecedores. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracelular+Matriz+Proteínas+ECMs+e+Fatores+Anexo%28Ciências da Vida%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29
Soro bovino fetal	Gibco	16000044	Várias marcas fabricam isso http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=
HEPES	Gibco	5630080	Várias marcas fabricam isso http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete =
100 x suplemento N2	Gibco	17502-048	Várias marcas fabricam isso http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage = 15& autocomplete=
Ciprofloxacina	Sigma Aldrich	17850-5G-F	Várias marcas fabricam isso http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA
A solução salina balanceada de Hank	Gibco	14170161	Várias marcas fabricam isso. Deve ser refidgerido antes do uso. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s
Fine Forceps	Fine Science tools	11254-20	Número do tamanho 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29
Cureta	Ferramentas de Ciência Fina	10080-05	tamanho 1 mm  http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118
Insect Pins	Fine Science Tools	26001-35	Deve ser de aço inoxidável http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124
pratos de plástico de 50 mm	Corning/Falcon	351006	Várias marcas fabricam este
carvão	Sigma Aldrich	05105-250G	Várias marcas fabricam itens semelhantes http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA
184 elastômero de silicone	Dow/Corning	KIT DE ELASTÔMERO DE SILICONE SYLGARD® 184 Os	pratos são feitos em casa com várias semanas de antecedência.  O elastômero de silicone pode ser de qualquer fornecedor.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291
Pratos com fundo de vidro	MatTek	P35G-0-10-C	As dimensões do prato são determinadas pelas especificações do sistema de imagem.  35 mm de diâmetro, 10mm bem, a lamínula número 0 se encaixa no Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15& products_id=2
Estereomicroscópio	Zeiss	495101-9804-000	Modelo Stemi 2000. várias marcas fabricam itens semelhantes http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html
Fonte de Luz Fria	Zeiss	000000-1063-182	Várias marcas fabricam itens semelhantes http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html
Estereomicroscópio Fluorescente	Leica microsystems	Entre em contato com a Leica microsystems	Leica M165-FC. Várias marcas fabricam itens semelhantes http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/
Incubadora Microscópio +software de imagem	Olympus	Contact Olympus	Microcope invertido selado dentro de uma incubadora de Co2. Microscópio de incubadora Vivaview FL com software de imagem Metamorpoh proprietário. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0
Bancada limpa	Thermo Scientific	51029701	Várias marcas fabricam itens semelhantes http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html
Incubadora de CO2	Thermo Scientific	3310	Várias marcas fabricam itens semelhantes http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html
Laminar Flow hood	Thermo Scientific	51026651	Várias marcas fabricam itens semelhantes http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html