Artigo de método

Alta resolução de Microscopia Eletrônica da Helicobacter pylori Cag Tipo IV Secreção Sistema Pili Produzido em diferentes condições de Ferro Disponibilidade

DOI:

10.3791/52122

⸱

21 de novembro de 2014

 ,  , 
1Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University School of Medicine, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs

Neste artigo

Resumo

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Aqui descrevemos um método para visualizar a organela bacteriana oncogênica conhecida como Sistema de Secreção Cag Tipo IV (Cag-T4SS). Descobrimos que o Cag-T4SS é produzido diferencialmente na superfície de H. pylori em resposta a condições variáveis de disponibilidade de ferro.

Resumo

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Helicobacter pylori é uma bactéria gram-negativa de forma helicoidal que coloniza o nicho gástrico humano de metade da população humana1,2. O H. pylori é a principal causa de câncer gástrico, a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo3. Um fator de virulência que tem sido associado ao aumento do risco de doença gástrica é a ilha de patogenicidade de Cag, uma região de 40 kb dentro do cromossomo de H. pylori que codifica um sistema de secreção tipo IV e a molécula efetora cognata,4,5. O Cag-T4SS é responsável por translocar e peptidoglicano em células epiteliais do hospedeiro5,6. A atividade do Cag-T4SS resulta em inúmeras mudanças na biologia da célula hospedeira, incluindo regulação positiva da expressão de citocinas, ativação de vias pró-inflamatórias, remodelação do citoesqueleto e indução de redes de sinalização celular oncogênica5-8. O Cag-T4SS é uma máquina macromolecular composta por componentes de subconjuntos que abrangem a membrana interna e externa e se estendem para fora da célula para o espaço extracelular. A porção extracelular do Cag-T4SS é chamada de "pilus"5. Numerosos estudos demonstraram que os pili Cag-T4SS são formados na interface patógeno-hospedeiro9,10. No entanto, as características ambientais que regulam a biogênese dessa importante organela permanecem em grande parte obscuras. Recentemente, relatamos que condições de baixa disponibilidade de ferro aumentaram a atividade de Cag-T4SS e a biogênese do pilus. Aqui apresentamos um protocolo otimizado para cultivar H. pylori em condições variadas de disponibilidade de ferro antes da co-cultura com células epiteliais gástricas humanas. Além disso, apresentamos o protocolo abrangente para visualização do fenótipo hiper-piliado exibido em condições de restrição de ferro por análises de microscopia eletrônica de varredura de alta resolução.

Introdução

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A infecção por H. pylori é um fator de risco significativo para câncer gástrico1. No entanto, os resultados da doença variam e dependem de vários fatores, como genética do hospedeiro, diversidade genética de cepas de H. pylori e elementos ambientais, como dieta do hospedeiro11. Relatórios anteriores estabeleceram que existe uma correlação entre infecção por H. pylori, deficiência de ferro (medida pela diminuição das concentrações de ferritina e hemoglobina no sangue) e aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo a secreção de IL-8, o que acaba levando ao aumento da progressão da doença gástrica12. A infecção aguda por H. pylori também está associada à hipocloridria, que prejudica a capacidade do hospedeiro de absorver o nutriente ferro e, em última análise, leva a alterações na homeostase do ferro13. Esses achados clínicos sugerem que a disponibilidade de ferro no nicho gástico pode ser um fator importante no desfecho da doença. De fato, modelos animais de infecção por H. pylori demonstraram que o baixo consumo de ferro na dieta exacerba a doençagástrica 14. Os níveis reduzidos de ferro nesses animais exigem que o H. pylori induza uma resposta de aquisição de ferro para obter o ferro necessário para a replicação bacteriana. O H. pylori tem a capacidade de perturbar o tráfego de ferro dentro das células hospedeiras para facilitar a replicação bacteriana de forma dependente de15. Curiosamente, a ilha de patogenicidade cag demonstrou ser regulada pelo fator de transcrição responsivo ao ferro Fur16,17. Além disso, as cepas Cag+ estão associadas ao aumento da inflamação e doenças gástricas, como o câncer1. Esses achados apóiam um modelo pelo qual H. pylori altera a expressão de Cag-T4SS em um esforço para obter ferro de células hospedeiras que residem em um ambiente de pobre em ferro, resultando em resultados exacerbados da doença.

Dois fatores que aumentam a inflamação e a morbidade são a expressão de Cag e a baixa ingestão de ferro na dieta. Esses fatos apóiam a hipótese de que a redução da disponibilidade de ferro aumenta a produção de pili Cag-T4SS na interface patógeno hospedeiro, resultando em pior doença gástrica11-14. O objetivo do método fornecido neste manuscrito é estabelecer o papel do micronutriente ferro na regulação da biogênese do pilus Cag-T4SS. Em trabalhos anteriores, utilizamos duas abordagens para observar um aumento dependente de ferro na expressão de Cag-T4SS. Primeiro, as cepas de produção de animais mantidos em dietas com alto e baixo teor de ferro foram analisadas e revelaram que as cepas de produção de dieta com baixo teor de ferro produziram mais pili Cag-T4SS do que as cepas de dieta rica em ferro14. Em segundo lugar, o cultivo da cepa H. pylori 7.13 in vitro em condições repletas de ferro resultou na redução da formação de pili, enquanto as células cultivadas na presença de um quelante de ferro produziram significativamente mais pili.

Continuamos a investigar a regulação dependente de ferro do fenótipo Cag-T4SS pili e oferecemos o seguinte protocolo otimizado e resultados representativos realizados com uma cepa adicional de Helicobacter pylori, PMSS1. A lógica por trás do desenvolvimento desta técnica foi correlacionar o aumento da atividade do Cag-T4SS em condições de limitação de ferro com o aumento da formação de pilus Cag-T4SS. A implicação e o uso mais amplos dessa técnica fornecerão condições de cultura otimizadas que resultam em produção elevada do pili Cag-T4SS. Este ensaio será útil para pesquisadores que buscam determinar a composição e a arquitetura do Cag-T4SS, enriquecendo para esta importante característica da superfície bacteriana. O preparo e visualização da amostra por microscopia eletrônica de canhão de emissão de campo tem inúmeras vantagens sobre técnicas alternativas, como métodos de microscopia de luz para visualizar o Cag-T4SS e será apropriado para investigadores interessados em estudar a regulação dessa organela10.

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Protocolo

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1. H. Crescimento pylori em diferentes condições de Ferro Disponibilidade e Co-cultura com gástrico humano células epiteliais

  1. Selecione H. pylori PMSS1 tensão para estes estudos porque tem uma ilha cag patogenicidade intacta e expressa um sistema de secreção do tipo IV em funcionamento. Também utilizam uma gaiola mutante isogênico (PMSSI Δ Cage) como controle negativo. Cresça as bactérias em placas de TSA suplementadas com 5% de sangue de carneiro (placas de agar de sangue) durante 24 horas a 37 ° C na presença de 5% de CO 2.
    NOTA: Preparar reagentes e montar materiais, conforme descrito na Tabela de Materiais e Equipamentos. Concentrações finais para cada reagente é listado entre parênteses.
  2. Raspar as bactérias da placa, utilizando um aplicador com ponta de algodão esterilizado e inocular em caldo Brucella modificado preparado a partir de componentes (ver Materiais e Equipamento Tabela) e suplementado com colesterol. Incubar durante a noite a 37 culturas° C em ar ambiente enriquecido com 5% de CO 2 com agitação a 200 rotações por minuto (rpm).
    NOTA: O colesterol é utilizado em vez de soro fetal de bovino devido ao fato de que o soro é complexo; contendo numerosas fontes de nutrientes tais como ferro heme que faz com que a variabilidade nos resultados.
  3. No dia da cultura bacteriana, semear as células epiteliais gástricas humanas AGS (ATCC CRL-1739) para poli-D-lisina lamelas tratadas, em placas de 12 poços (cerca de 1 x 10 5 células por poço).
  4. No dia seguinte, dilui-se culturas bacterianas para um OD600 de 0,3 em caldo Brucella modificado sozinho ou suplementado com 100 | iM de FeCl3, 200 uM dipiridilo (um quelante de ferro sintético), ou 200 uM dipiridilo mais 250? M FeCl3. Incubar estas culturas durante 4 horas a 37 ° C em ar ambiente enriquecido com 5% de CO 2 com agitação a 200 rpm.
  5. Bactérias centrifugar a 1000 xg para coletar células e remover o sobrenadante antes de ressuspender in um volume igual de caldo de Brucella modificado fresco suplementado com colesterol. Medida OD600 da cultura (DO600 = 1.0 = 5.5 x 10 8 células / ml) e adicionar bactérias às células epiteliais de uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20: 1. Efectuar diluições em série e as células bacterianas placa em placas de agar de sangue para avaliar a viabilidade celular bacteriana.
  6. Incubar H. células epiteliais gástricas humanas pylori e AGS co-culturas durante 4 horas a 37 ° C na presença de 5% de CO 2 em condições estáticas, antes de realizar a microscopia electrónica de varrimento (MEV), a preparação da amostra.

2. SEM Preparação de Amostras para Visualize H. pylori Cag-T4SS Pili

  1. Remover H. pylori e AGS co-culturas a partir do sobrenadante incubadora e decantar cultura (com exceção de IL-8 ELISA). Lavar cuidadosamente três vezes com tampão de 0,05 M de cacodilato de sódio (pH 7,4). Fix amostras para 2-4 horas à temperatura ambiente numa solução de 2,0% de paraformaldeído, 2,5% De glutaraldeido, e tampão de cacodilato de sódio 0,05 M. Após a fixação primária, lavar as amostras três vezes com tampão de cacodilato de sódio 0,05 M.
  2. Realizar fixação secundária usando 0,1% de tetróxido de ósmio em tampão de cacodilato de sódio 0,05 M em dois passos sequenciais de 10 min de fixação. Após a fixação secundária, lavar as amostras três vezes com tampão de cacodilato de sódio 0,05 M.
  3. Após a fixação primária e secundária, desidratar amostras por lavagem sequencial com concentrações crescentes de etanol conforme a Tabela 1.
  4. Após a desidratação de etanol, realizar três lavagens seqüenciais de dióxido de carbono líquido. Em seguida, as amostras secas em um ponto crítico, utilizando uma máquina de secar ponto crítico a uma temperatura de 31,1 ºC e pressão de 1073 psi.
  5. Monte lamelas em topos de amostra de alumínio SEM e pintar com uma linha fina de prata coloidal na borda da amostra para alcançar o aterramento adequado e evitar a cobrança durante SEM imagem.
  6. Amostras de revestimento com 5 nm deouro-paládio usando uma máquina de revestimento por pulverização catódica para aumentar sinal de elétrons secundários da amostra e efeito de borda.

3. Parâmetros de imagem para análises alta resolução MEV

  1. Ver amostras com um campo-Emission Gun Microscópio Eletrônico de Varredura (FEG-SEM).
  2. Imagem num modo alto vácuo a uma distância de trabalho de 5-10 mm.
  3. Defina a tensão de aceleração de 5 kV.
  4. Defina o tamanho do ponto de 2-2,5.
  5. Incline a amostra entre 15-25 graus para alcançar uma melhor visão da interface do patógeno-hospedeiro.
  6. Priorize imagiologia bactérias aderentes às bordas das células epiteliais para visualização de alta ampliação, uma vez que estas áreas de interacção hospedeiro-patogénio são enriquecidas para as bactérias formadoras de pili.

4. As análises estatísticas para avaliar as Pili quantificações

  1. Analisar H. pylori pili-Cag T4SS utilizando o software ImageJ para quantificar o número de pili / célula, bem como a percentagem de células que manifestam o piliated phenotype acordo com as instruções abaixo.
  2. Arquivos micrografia abertas em software ImageJ. Identificar pili como estruturas formadas entre a célula e célula hospedeira bacteriana, com largura uniforme (10-13 nm) e comprimento (60-150 nm).
    NOTA: A estrutura pilus está presente em cepas bacterianas WT, mas ausente em linhagens isogênicas como Δ gaiola cepas mutantes, que abrigam uma inativação no gene que codifica o principal ATPase que a montagem tipo poderes secreção IV pilus.
  3. Calibrar a ferramenta de medição por desenhar uma linha com a ferramenta de linha reta e em seguida, clicando na guia "Analisar". Selecione "Set Scale" no menu suspenso e digite o valor bar ampliação na caixa chamada "Distância Known" e defina a unidade de comprimento para a definição apropriada (nm). Clique em "OK".
  4. Meça Cag-T4SS pili usando a ferramenta de linha reta para desenhar sobre o comprimento ou a largura do pilus e pressione "Ctrl-M" para medir cada pilus. Observar uma caixa de diálogo com os valores medidos. Anote esses valores ou copiar e colar em um programa de planilha.
  5. Use o comprimento ea largura de parâmetros previamente estabelecidos 24, características da negligência que não se encaixam no perfil de CAG-T4SS. Em seguida, quantificar o número de pili com base em valores que estão dentro dos pontos de corte 10-13 nm de largura e comprimento de 60-150 nm.
  6. Analisar a quantificação dos pili estatisticamente pelo teste t bicaudal de Student utilizando o software GraphPad Prism.

5. Opcional: Avaliação da secreção de IL-8 para correlacionar com Pilus Produção

  1. Usando sobrenadantes do Passo 2.1, realizar um ELISA de IL-8 de acordo com as instruções do fabricante, com o kit (Ver Materiais e Equipamento Tabela).
  2. Analisar a IL-8 segregada pelas células hospedeiras e calcular a percentagem de IL-8 com respeito à indução WT PMSS1 cultivadas em meio sozinho. Realizar a análise estatística usando bicaudal teste t de Student utilizando GraphPad Prism assimftware.

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Resultados

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Neste relatório, nós demonstramos que as condições de disponibilidade diferenciada de ferro tem a capacidade de modular H. pylori Cag-T4SS biogénese pilus na interface patógeno hospedeiro. Quando cultivados em meio sozinho, H. pylori constitui uma média de 3 pili / célula. Quando H. pylori é cultivada em condições de ferro esgotar (utilizando o quelante de dipiridilo sintética) que são sub-inibitório para o crescimento bacteriano (Figura 1), as bactérias produzem numerosos Cag...

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Discussão

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O ferro é um micronutriente essencial para a maioria das formas de vida, incluindo patógenos bacterianos. Num esforço para restringir a viabilidade dos microorganismos invasores, hospedeiros vertebrados sequestrar ferro nutriente num processo conhecido como "imunidade nutricional" 18. Em resposta a isso, patógenos bacterianos evoluíram para usar o ferro como uma molécula de sinalização global para sentir seu entorno e regular a elaboração de características de virulência, tais como sistemas de aquis...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Prêmio de Desenvolvimento de Carreira do Departamento de Assuntos de Veteranos 1IK2BX001701 e pelo prêmio CTSA UL1TR000445 do Centro Nacional para o Avanço das Ciências Translacionais. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do National Center for Advancing Translational Sciences ou dos National Institutes of Health. Os experimentos de microscopia eletrônica de varredura foram realizados em parte por meio do uso do VUMC Cell Imaging Shared Resource, apoiado por bolsas do NIH CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 e EY08126.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
brucella modificado
Peptona de caseína (10 g/L)Sigma70172
Digestão péptica de tecido animal (10 g/L)Sigma70174
Extrato de levedura (2 g/L)Sigma92144
Dextrose (1 g/L)SigmaD9434
Cloreto de sódio (5 g/L)Thermo FisherS271-10
Colesterol (250X) (4 ml/L)Life Technologies12531018
Cloreto férrico (100 ou 250 uM)Sigma157740-100G
Dipiridil (200 uM)SigmaD216305-100G
RPMI
RPMI+HEPES (1X)Life Technologies22400-121
Soro fetal bovino ( 100 ml/L)Life Technologies10438-026
Preparação para Microscopia Eletrônica
Paraformaldeído (2,0% aquoso)Microscopia Eletrônica Ciências15713
Gluteraldeído (2,5% aquoso)Microscopia Eletrônica Ciências16220
Cacodilato de sódio (0,05 M)Microscopia Eletrônica Ciências12300
Tetróxido de ósmio (0,1% aquoso)Microscopia Eletrônica Ciências19150
Etanol (absoluto)SigmaE7023
Tinta de prata coloidalMicroscopia Eletrônica Ciências12630
SEM esboços de amostraMicroscopia Eletrônica Ciências75220
LamínulasThermo Fisher08-774-383
secreção de IL-8
Quantikine IL-8 ELISA kitR& D SistemasD8000C
Caldo ModificadoAvaliação de

Referências

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  1. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).
  2. Sycuro, L. K., et al. Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization. Cell. 141 (5), 822-833 (2010).
  3. Kodaman, N., et al. Human and Helicobacter pylori coevolution shapes the risk of gastric disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (4), 1455-1460 (2014).
  4. Tegtmeyer, N., Wessler, S., Backert, S. Role of the cag-pathogenicity island encoded type IV secretion system in Helicobacter pylori pathogenesis. FEBS J. 278 (8), 1190-1202 (2011).
  5. Fischer, W. Assembly and molecular mode of action of the Helicobacter pylori Cag type IV secretion apparatus. FEBS J. 278 (8), 1203-1212 (2011).
  6. Odenbreit, S., Puls, J., Sedlmaier, B., Gerland, E., Fischer, W., Haas, R. Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion. Science. 287 (5457), 1497-1500 (2000).
  7. Bourzac, K., Guillemin, K. Helicobacter pylori-host cell interactions mediated by type IV secretion. Cell Microbiol. 7 (7), 911-919 (2005).
  8. Bronte-Tinkew, D. M., et al. Helicobacter pylori cytoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo. Cancer Res. 69 (2), 632-639 (2009).
  9. Johnson, E. M., Gaddy, J. A., Cover, T. L. Alterations in Helicobacter pylori triggered by contact with gastric epithelial cells. Front. Cell. Infect. Microbiol. (2), 17(2012).
  10. Rohde, M., Puls, J., Buhrdorf, R., Fischer, W., Haas, R. A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system. Mol. Microbiol. 49 (1), 219-234 (2003).
  11. Cover, T. L., Peek, R. M. Jr Diet, microbial virulence and Helicobacter pylori induced gastric cancer. Gut Microbes. 4 (6), 482-493 (2013).
  12. Queiroz, D. M., et al. Increased gastric IL-1β concentration and iron deficiency parameters in Helicobacter pylori infected children. PLoS One. 8 (2), 57420(2013).
  13. Harris, P. R., et al. Helicobacter pylori-associated hypochlorhydria and development of iron deficiency. J. Clin. Pathol. 66 (4), 343-347 (2013).
  14. Noto, J. M., et al. Iron deficiency accelerates Helicobacter pylori-induced carcinogenesis in rodents and humans. J. Clin. Invest. 123 (1), 479-492 (2013).
  15. Tan, S., Noto, J. M., Romero-Gallo, J., Peek, R. M. Jr, Amieva, M. R. Helicobacter pylori perturbs iron trafficking in the epithelium to grow on the cell surface. PLoS Pathog. 7 (5), (2011).
  16. Danielli, A., Roncarati, D., Delany, I., Chiarini, V., Rappouli, R., Scarlato, V. In vivo dissection of the Helicobacter pylori Fur regulatory circuit by genome-wide location analysis. J. Bacteriol. 188 (13), 4654-4662 (2006).
  17. Pich, O. Q., Carpenter, B. M., Gilbreath, J. J., Merrell, D. S. Detailed analysis of Helicobacter pylori Fur-regulated promoters reveals a Fur box core sequence and novel Fur-regulated genes. Mol. Microbiol. 84 (5), 921-941 (2012).
  18. Cassat, J. E., Skaar, E. P. Iron in infection and immunity. Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).
  19. Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7 (8), 430-441 (2010).
  20. Brickman, T. J., Cummings, C. A., Liew, S. Y., Relman, D. A., Armstrong, S. K. Transcriptional profiling of the iron starvation response in Bordatella pertussis provides new insights into siderophore utilization and virulence gene expression. J. Bacteriol. 193 (18), 4798-4812 (2011).
  21. Mobley, H. L. Helicobacter pylori factors associated with disease development. Gastroenterology. 113 (6), 21-28 (1997).
  22. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. L. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined. J. Clin. Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
  23. Senkovich, O., Ceaser, S., McGee, D. J., Testerman, T. L. Unique host iron utilization mechanisms of Helicobacter pylori revealed with iron-deficient chemically defined media. Infect. Immun. 78 (5), 1841-1849 (2010).
  24. Shaffer, C. L., et al. Helicobacter pylori exploits a unique repertoire of type IV secretion system components for pilus assembly at the bacteria-host cell interface. PLoS Pathog. 7 (9), (2011).
  25. Barrozo, R. M., et al. Functional plasticity in the type IV secretion system of Helicobacter pylori. PLoS Pathog. 9 (2), (2013).

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