Visualizar e acessar o embrião de galinha durante o desenvolvimento pode ser um desafio. Desenvolvemos um método ex ovo que é simples, econômico e pode ser facilmente usado em sala de aula ou ambiente de pesquisa. Este método fornece acesso ao embrião em estágios finais do desenvolvimento embrionário (HH 40).
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Artigo de método
Otimizado Ex-ovo A cultura de Chick embriões para estágio avançado de desenvolvimento
Neste artigo
Resumo
Resumo
A pesquisa em anatomia, embriologia e biologia do desenvolvimento tem se baseado amplamente no uso de organismos modelo. Para estudar o desenvolvimento em embriões vivos, organismos modelo, como a galinha, são frequentemente usados. A galinha é um excelente organismo modelo devido ao seu baixo custo e manutenção mínima, porém apresenta desafios observacionais por estar encerrada em uma casca de ovo opaca. Para visualizar adequadamente o embrião à medida que ele se desenvolve, a casca deve ser janela ou removida. Ambas as técnicas de janela e ex ovo foram desenvolvidas para auxiliar os pesquisadores no estudo do desenvolvimento embrionário. No entanto, cada um dos métodos tem limitações e desafios. Aqui, apresentamos uma técnica simples e otimizada de cultura ex ovo para embriões de galinha que permite a observação do desenvolvimento embrionário desde o estágio HH 19 até os estágios finais de desenvolvimento (HH 40), quando muitos órgãos se desenvolveram. Essa técnica é fácil de adotar tanto em aulas de graduação quanto em laboratórios de pesquisa mais avançados, onde são realizadas manipulações de embriões.
Introdução
A cultura ex ovo tem desempenhado um papel importante no estudo do desenvolvimento do frango1, 2. Esse método de cultura tem sido usado para estudar doenças neurológicas, desenvolvimento de membros, desenvolvimento craniofacial e como modelo para investigar malformações associadas ao diabetes 3, 4, 5.
Existem muitas variações na técnica ex ovo. A abordagem mais comum é usar um copo de isopor6,7,8 ou uma tigela de vidro5. Nesses métodos, o copo ou tigela é forrado com filme plástico para embalar o embrião, uma tampa é colocada no copo e o embrião é então colocado em uma incubadora com umidade adequada6. Essa configuração, no entanto, pode ser tecnicamente desafiadora. O primeiro desafio é o filme plástico que é usado para embalar o embrião. Este envoltório é difícil de trabalhar e muitas vezes não adere muito bem ao copo. Para resolver esse problema, um elástico é colocado ao redor do copo para manter o envoltório no lugar. Apesar disso, o envoltório ainda pode escorregar, o que é fatal para o embrião. O filme plástico tem o potencial de rasgar ou ser perfurado por pinças ou agulhas que podem ser usadas durante manipulações e observações de embriões. Finalmente, essa configuração não é muito estável e os alunos podem facilmente derrubar os copos. A altura das xícaras também torna muito difícil colocar o embrião sob um estereomicroscópio, que tem um objetivo limitado à altura do palco. Esses desafios tornam difícil para os alunos de graduação trabalhar com embriões vivos de pintinhos em laboratórios de ensino, como cursos avançados de biologia do desenvolvimento.
Os desafios acima no método ex ovo significaram que os pesquisadores recorrem ao método de janela 9,10 para visualizar o desenvolvimento embrionário de pintinhos. Nesta técnica, um orifício ou "janela" é feito na casca do ovo que cobre o embrião. O orifício pode ser selado novamente com fita adesiva ou cera9 para permitir um maior desenvolvimento embrionário. Embora o método de janela tenha algumas vantagens, como a capacidade de visualizar o desenvolvimento embrionário e fácil manutenção, esse método também tem várias limitações. A primeira é que a janela precisa ser bastante grande para visualizar todo o embrião (especialmente nos estágios finais). Em segundo lugar, grandes janelas são difíceis de selar; Uma vedação inadequada levará a problemas de esterilidade e sobrevivência. Usar cera derretida como selante adiciona outra etapa inconveniente e confusa ao protocolo. Portanto, embora o método de janela possa ser ideal para embriões de pintinhos em estágios jovens (HH 11 – HH 27), a visualização de todo o embrião em estágios tardios não é facilmente realizada.
Aqui, descrevemos uma técnica de cultura ex ovo simples e aprimorada11 que evita a necessidade de equipamentos de alta tecnologia, é fácil de manusear sob um estereomicroscópio, dá ao embrião suporte suficiente para realizar manipulações microscópicas e permite que os pesquisadores visualizem o crescimento do embrião em sua totalidade até os estágios posteriores de desenvolvimento (até HH 40-41). Com esses avanços na técnica ex ovo, os indivíduos obtêm acesso a uma compreensão mais completa do desenvolvimento embrionário. Por exemplo, o crescimento em estágios posteriores permite que os indivíduos observem processos de desenvolvimento que não ocorrem até esse momento, como ossificação, desenvolvimento de penas e desenvolvimento avançado de membros e olhos. Todo o embrião e as membranas e vasculatura extraembrionárias são claramente visíveis. Pesquisas mais avançadas também podem ser realizadas, como manipulações embrionárias (ou seja, implante de esferas embebidas em inibidores ou inserção de barreiras entre as camadas de tecido), e os pesquisadores podem observar o efeito das manipulações em embriões em estágio posterior.
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Protocolo
Nota: Todas as fontes estão listadas na Tabela 1.
1. Armazenar o frango Embriões
- Incubar ovos de galinha da estirpe Gallus gallus horizontalmente a 37 o C, com aproximadamente 40% de umidade e virar ovos uma vez ou duas vezes por dia. Voltando ovos é importante para evitar o embrião de aderir a casca do ovo.
- Não para não transformar o ovo no 24 horas antes da criação da cultura de outra forma o embrião será localizado ventral à massa de gema e será danificado ao abrir o ovo no passo 3. Além disso, manter os ovos a 4 o C graus para não mais do que uma semana antes de incubação para o desenvolvimento "parada", mas isso não é o ideal.
2. Encenação de frango Embriões
- Fase, os embriões de galinha usando o Hamburger e Hamilton 12 de tabela de representação. O palco ideal para a criação da cultura ex-ovo é HH fase 19-20 (cerca de 3 dias de incubação) because este é logo após a cabeça gira em 53 hpf.
Nota: 19-20 HH fase caracteriza-se pelas seguintes características morfológicas: somitos são estendidas para a maioria da cauda, no entanto, a própria extremidade da cauda permanece não segmentada, o botão de cauda está enrolado, o alantóide é pequena e tem vasculatura limitado, as pernas-botões são maiores do que os de asa-botões e os olhos são unpigmented ou têm uma tonalidade acinzentada.
3. Retirar o embrião da Shell
- Antes de retirar o embrião a partir do shell, pulverizar o shell com etanol 70% e deixe-a secar. Não vire o ovo rapidamente pois isso irá danificar o embrião.
- Tomando cuidado para não alterar a orientação do ovo, cuidadosamente quebrar o ovo no lado inferior (ou seja, o lado que foi ventral durante a incubação) e libertar o embrião para um barco de pesagem estéril (88 x 88 x 23 mm). Limpe pesar barcos com etanol 70%. Inspeccionar o embrião para assegurar que o saco vitelino não está danificado. Se a gema hcomo quebrado, descartar o embrião, como ele não vai sobreviver.
- Observar o embrião para garantir que ele é viável; o coração está batendo, vasculatura parece normal, e não há anormalidades óbvias estão presentes. Certifique-se de que as bordas do barco pesar são secos.
- Usando uma pipeta, gota 40 mL de penicilina / estreptomicina (5000 unidades de penicilina, estreptomicina a 5 mg por ml) na parte superior da albumina para ajudar a prevenir a infecção.
4. Preparar a câmara de umidade
- Colocar uma pequena pilha de KIM-toalhetes e / ou uma almofada absorvente feita de algodão, no fundo de um recipiente de plástico estéril (12 x 12 x 6 cm) limpa com etanol a 70%.
- Adicione água destilada estéril para umedecer os KIM-toalhetes e / ou algodão (aproximadamente 150 ml de água).
5. Montagem do Ex Cultura Ovo
- Inserir o barco pesar contendo o embrião no topo da pe de enchimento húmido. Em seguida, coloque a metade de um estéril petri-prato quadrado (9.5 x 9.5 cm) na parte superior do tele pesam barco para formar uma tampa solta.
- Cobrir o recipiente de plástico com a sua tampa. Pressione para baixo dois cantos da tampa, garantindo uma vedação parcial que ainda permite uma boa circulação de ar no interior da câmara.
- Com cuidado, coloque a configuração para o 37 o C incubadora até estágio desejado.
- Coloque recipientes de água na incubadora para ajudar a controlar a humidade, se uma incubadora com humidade controlada não está disponível. Esteriliza-se toda a água nas câmaras de humidade e na incubadora e encher como for necessário durante o período de incubação. 40% de umidade é ideal.
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Resultados
Este ex ovo método permite a observação de embriões a partir de estágios iniciais de desenvolvimento (HH 19/20) para estágios finais de desenvolvimento (HH 40-41) (Figura 1A e 1B). Configurando a cultura no HH 19-20 aumenta a capacidade de sobrevivência dos embriões na cultura. Antes do giro (antes de 53 hpf) a capacidade de sobrevivência é muito baixa em cultura e após a etapa 21, o embrião tende a ficar mais para o shell sobre a remoção de modo são obtidas menos embriões inta...
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Discussão
Ex ovo cultura e de janelas ambos têm vantagens e desafios. Aqui vamos comparar as vantagens e os desafios do isopor cup ex ovo método eo método de janelas para o nosso ex otimizado ovo método mostrado aqui. Nosso método permite a manipulação e fácil observação do embrião de galinha em estágios finais de desenvolvimento e os nossos aperfeiçoamentos da ex tradicional ovo método 1, 2, 3 torná-lo também muito fácil de usar em aulas de graduação de laboratório...
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros competitivos em relação às informações apresentadas neste manuscrito.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Paul Poirier, o produtor de mídia, em Mount Saint Vincent University por seu trabalho em filmagem e edição de uma parte do vídeo deste manuscrito. Reconhecemos a Ciência Natural e do Conselho de Pesquisa em Engenharia do Canadá para financiamento.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Penicilina/Estreptomicina | Sigma | P4458 | Faça pequenas alíquotas para evitar eventos de congelamento/descongelamento |
| de Petri quadrada | 9,5 cm x 9,5 cm | ||
| Pesar Barco | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Recipiente Ziplock | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
Referências
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
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Reimpressões e permissões
