Timectomia completo em ratos adultos com não-invasiva entubação endotraqueal

Resumo

A timectomia com roedores é uma técnica valiosa na pesquisa imunológica. Aqui, é descrito um protocolo para timectomia completa em ratos adultos usando uma miniesternotomia juntamente com intubação não invasiva e ventilação com pressão positiva para minimizar a morbidade e mortalidade perioperatórias.

Resumo

Timectomia em roedores neonatais é um procedimento estabelecido e confiável para estudos imunológicos. No entanto, em ratos adultos, complicações de hemorragia e pneumotórax de ruptura pleural pode resultar numa taxa de mortalidade significativa. Este protocolo é um método simples de thymectomy rato que utiliza um mini-esternotomia e entubação endotraqueal. Intubação é realizado com um método não-invasivo e de fácil reprodução e permite a ventilação com pressão positiva para evitar pneumotórax e uma via aérea controlada que permite tempo suficiente para a dissecção timo cuidado para minimizar a interrupção pleural. A 1,5 centímetros incisão esternal diminui o contato com os vasos do mediastino e pleura, enquanto ainda fornece a visualização completa do timo. Após a exposição do mediastino, o timo é removido por dissecção romba sob ampliação. O espaço pleural é então selado por fecho de sutura dos músculos pré-traqueal, seguido pela aplicação de cola cirúrgica. Otórax é então fechada por sutura de encerramento do esterno, seguido por fecho de sutura da pele. Todos os timectomias estavam completos como evidenciado pela imuno-histoquímica (IHQ) coloração de tecidos do mediastino, e ausência de células T naive por citometria de fluxo, e que o processo tinha uma taxa de sobrevivência de 96%. Esse método é apropriado quando a timectomia completa com o mínimo de complicações é desejado para mais estudos imunológicos em ratos atímicos adultos.

Introdução

Desde o início da década de 1960, o timo foi reconhecido o papel crítico no desenvolvimento da tolerância imunológica central. Roedor timectomia provou ser um processo essencial para definir o papel do timo na diferenciação de linfócitos, a auto-tolerância, e imunotolerância na definição de transplante aloenxerto e metástase do tumor. A remoção do timo do rato permite a estudos que envolvem a depleção de células T ou a transferência adoptiva de populações de células T definidos, sem o reaparecimento de células T naive nativas.

Timectomias em roedores neonatais pode ser realizada utilizando uma técnica de sucção com resultados fiáveis ^​​1. Em ratos adultos, esta técnica está associada com uma taxa de mortalidade de 20% e, frequentemente, resulta em uma timectomia ² incompleta. Para alcançar consistentemente thymectomy completo em ratos adultos, é necessária a exposição aberta do mediastino por esternotomia mediana. No entanto, esteprocedimento está associada a complicações que incluem lesão traqueal, hemorragia e pneumotórax levando a uma taxa global de mortalidade variando 1,5-6% ^{2- 4.}

Ao longo das duas últimas décadas melhorias nas técnicas de timectomia diminuíram complicações perioperatórias e melhoraram as taxas de sobrevivência. A entubação endotraqueal permitindo a ventilação com pressão positiva diminuiu as taxas de pneumotórax ^5. Métodos de intubação anteriormente descrito gama de exposição aberta ao traquéia para métodos menos invasivos, utilizando a visualização direta das cordas vocais. As complicações associadas ao procedimento de intubação traqueal incluem lesão, a ruptura das cordas vocais, intubação esofágica não intencional, e hemorragia decorrente da punção cardíaca ou laceração da veia cava superior. Além disso, a proximidade dos lobos do timo mais baixos para o revestimento pleural podem resultar em pneumotórax.

Aqui nós descrevemos uma técnica dethymectomy através de um minimamente invasiva dois centímetros da pele incisão na sequência de um método simples de entubação endotraqueal usando um angiocateter embotados-end e iluminação traqueal transcutânea. O thymectomy envolve um 1,5 centímetros sternotomy e um encerramento de três camadas com aplicação de cola cirúrgica para selar o mediastino e minimizar a incidência de hemorragia e complicações respiratórias. Este método resulta de forma fiável, timectomia completa, como evidenciado pelo desaparecimento das células T ingénuas CD4 ⁺ e CD8 ⁺ a seguir a timectomia e a ausência de tecido do timo de coloração IHC. Tempos operatórios e mortalidade peri-processual são mantidos a um mínimo.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos experimentais que envolvam a utilização de ratos foram feitas de acordo com os protocolos aprovados pelo cuidado e uso Comitê da Universidade de Duke Animal.

1. Preparação da intubação traqueal Cannula

1. Corte a ponta da agulha de um 2 polegadas 14 G angiocathether agulha com alicate de corte.
2. Comprima o lúmen da agulha fechado com alicate de bico.
3. Corte a parte comprimida para baixo à extremidade da porção de lúmen aberto com alicates de corte, e depois cortar as extremidades de ambos os lados da extremidade remanescente a 30 - 45 ° ângulo da borda da agulha.
4. Coloque a parte inferior 3 - 4 mm de comprimento da cânula para a área aberta do alicate deslizamento-conjunta rectas e puxar para cima até uma ligeira curva para cima foi formado no final.
   NOTA: Este irá facilitar a dirigir o cateter para dentro da traqueia (Figura 1).
5. Use lixa fina para alisar as arestas na extremidade da cânula.
6. Devolva o instrumento rombo na tubulação angiocateter. Certifique-se de que o tubo é ligeiramente mais curto do que a agulha embotada.

Procedimentos 2. Pré-cirúrgicos

1. Configure o local para o procedimento, colocando um microscópio cirúrgico definido como aumento de 10x sobre a área de operação.
2. Coloque uma almofada de aquecimento na área de operação e cubra com um pano absorvente limpo.
3. Configurar um monitor de frequência cardíaca e oxigenação do sangue perto do campo cirúrgico.
4. Pesar o rato para sistemas baseados em peso medicação dosagem (por exemplo, a analgesia pós-operatória, os antibióticos, ou anticorpo linfócitos esgotando).
   NOTA: Típico ratos adultos pesam entre 350-450 g.
5. Sedar o rato vaporizado com 3% de _{isoflurano-O2} (3 L / min) usando uma câmara de indução ventilada para um sistema de eliminação de resíduos de gás anestésico contendo carvão activado. Permitir 5 min para a indução anestésica para fornecer anestesia profunda necessária para entubação endotraqueal.
6. Administrar carprofeno ou Meloxicane (4,4 mg / kg) por via subcutânea a ratos antes de prosseguir com a intubação e cirurgia.
7. Use cortador elétrico para fazer a barba do pescoço e peito do rato anestesiado antes da intubação.

3. Intubation

1. Preparar a configuração intubação por fricção uma pequena quantidade de lubrificante (por exemplo, gel KY) na extremidade da cânula de intubação. Ligar o ventilador para iniciar o fluxo de gás através do tubo de isoflurano conector.
2. Transferir o rato para o aparelho de intubação e suspender o rato sobre a barra de metal por sua dentes incisivos superiores (Figura 2A).
   NOTA: Alguns aparelhos de intubação pode ser comprado online. O modelo mostrado aqui é caseiro usando uma folha de acrílico moldado em torno de seções de uma polegada pedaço 2 x 4 lombar usando um maçarico de butano, e reforços são presos com clorofórmio. O bar (ou fio de metal) é presa por fazer furos mais de fita adesiva colocados no side do acrílico para impedir uma fragmentação ou fissuras.
3. Trans-iluminar o pescoço do rato por posicionamento de uma fonte de luz de alta intensidade flexível 1 - 2 cm da superfície ventral do pescoço (Figura 2B).
4. Utilizar um par de fórceps estudante padrão normalizados para puxar a língua suavemente para cima e para o lado dos dentes de baixo. Aderência a língua entre o polegar eo dedo indicador de uma mão, enquanto coloca a superfície interior plana de um lado da pinça contra a extremidade inferior da língua. Pressione ventralmente para expor a epiglote e a abertura da laringe (Figura 2C).
5. Visualize as cordas vocais e orientar o arrebitado final, embotada da cânula de intubação anteriormente através da glote aberta na traquéia até o centro da angiocateter toca os incisivos.
6. Retirar o estilete metal, e conectar o tubo de anestesia para a abertura angiocateter para início da ventilação com isoflurano.
   NOTA: O flo típico de oxigêniotaxa de w para o ventilador é de 3 L / min, com 3% de isoflurano.
   1. Definir o ventilador a uma taxa de 60 respirações / min, em um modo de ventilador de volume controlado que atinge uma pressão de ~ 12 - 14 mmHg. Use uma pressão expiratória final positiva (PEEP) de 3 cm H ₂ O.
7. Observar a expansão da parede torácica bilateral em sincronia com o ventilador para assegurar a colocação adequada do tubo endotraqueal.
8. Aplicar recomenda-veterinário pomada para os olhos do rato para evitar o ressecamento e sob anestesia.
9. Aplicar veterinário pomada nos olhos do rato para evitar a secura e sob anestesia.
10. Prenda o tubo endotraqueal para a cabeça do rato com uma tira de fita de tecido. Garanta uma ligação sólida entre o tubo endotraqueal e a tubulação ingresso anestésico.
11. Fixe a oxigenação do sangue e monitor cardíaco para o pé do rato e iniciar o monitoramento. Confirme anesthetization adequada ao confirmar que não há reação ao quee-pinch.

4. Thoracotomy e Timectomia

1. Siga técnica asséptica padrão para a totalidade do processo.
   1. Limpe a área e operacional a mesa de trabalho e desinfectar com uma solução de etanol a 70%.
   2. Use luvas cirúrgicas estéreis durante o procedimento, e autoclave todos os instrumentos e materiais utilizados durante o procedimento.
   3. Aplicar providone-iodo para a área de todo o peito e deixe-a secar. Em seguida, limpar a superfície da pele com etanol a 70% em gaze. Cubra o rato com filme plástico transparente cortar um buraco para expor o campo operatório estéril.
2. Identificar fúrcula na região torácica superior. Faça uma incisão na linha média 2 centímetros através da pele a partir 2-3 mm acima da fúrcula e estendendo-se distalmente linha média ao longo do esterno com uma tesoura Shea atraumáticas.
3. Realize uma sternotomy 1,5 centímetros mediana de fúrcula novamente usando uma tesoura Shea atraumáticas. KEEP da borda inferior das tesouras apenas por baixo do esterno e avançar lentamente.
4. Insira um pequeno afastador Alm logo abaixo do esterno separadas e aberto para revelar o pré-traqueal músculos cinta (esterno e músculos esternotireóideo). Separe os músculos cinta pré-traqueais usando uma pinça Graefe contundentes. NOTA: Neste ponto, a traqueia pode ser visto, o tubo de intubação e deve ser visualizada no interior da traqueia.
5. Coloque os dentes do pequeno afastador Alm debaixo dos músculos cinta separadas e esterno. Abra o retractor para expor a face superior do timo.
6. Use uma pinça Dumont finas para libertar as arestas laterais do tecido do timo e expor os lóbulos inferiores do timo.
7. Puxe o timo suavemente superiormente para o local da incisão aberta, tendo o cuidado de evitar o contacto com as veias cavas, subclávia e carótida vasos superiores, e para minimizar a interrupção do revestimento pleural delicado entre o timo e os pulmões.
8. Como tele thymic vasos são dissecados e revelou, usar micro-tesoura para dividi-los. Use um cotonete para manter a pressão sobre os vasos para hemostasia, se necessário.
9. Entregar os lobos do timo mais baixos na incisão e, em seguida, lisar acentuadamente os anexos posteriores. Retire o timo intacta e inspecione cuidadosamente o timo removido para quaisquer seções desaparecidas.
   Nota: Pequenas linfonodos torácicos pode ser visualizado em torno do timo e são muitas vezes difíceis de diferenciar de tecido do timo. Estes serão os nós redondas discretas com uma aparência semelhante a tecido tímico, mas não será em continuidade com o timo.
10. Retire o afastador Alm e fechar os músculos esterno hioideo e sternothyoid com dois interrompido 5-0 Maxon.
11. Aplique 2 gotas de aplicação de cola grau cirúrgico através das suturas para selar o mediastino sob ventilação com pressão positiva.
    NOTA: Isto irá diminuir a incidência de pneumotórax e hematoma.
12. Feche a sternum com dois interrompido fio de seda 4-0 em uma agulha de corte. Insira a agulha através de espaços entre as costelas, tendo o cuidado para guiar a agulha logo abaixo do esterno para evitar a camada muscular subjacente.
13. Fechar a camada de pele com uma sutura de nylon 4-0 execução. Descontinuar o isoflurano neste momento para encurtar o período de recuperação da anestesia pós-operatória.
14. Limpe o local da incisão e pele circundante com gaze embebida em soro fisiológico.
15. Aplique várias gotas de bupivicaína (0,25%) para a anestesia local, seguido por 1 - 2 gotas de cola de cianoacrilato sobre a incisão para selar a incisão.
16. Continuar a ventilar até o rato mostra sinais de esforço respiratório independente e começa a se mover suas extremidades. Extubação o rato e permitir que ele se recuperar sob observação em uma jaula colocada sobre uma almofada de aquecimento.
17. Administrar Buprenorfina (0,01-0,05 mg / kg) por via subcutânea ao rato imediatamente no pós-operatório e repetir a cada 8-12 horas para 48 horas post-operatório (normalmente 5 doses no total). Aos 24 e 48 horas de pós-operatório, administrar Carprofen ou Meloxicane (4,4 mg / kg) por via subcutânea (3 doses totais, incluindo a dose pré-operatório).
18. Continue a acompanhar até que o rato está se movendo ao redor da gaiola. Em quaisquer sinais de desconforto respiratório, realizar re-intubação e re-exploração do peito.
    1. Não deixe um animal sem supervisão até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
    2. Não devolva um animal que passou por uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
19. Retirar as suturas da camada da pele uma semana de pós-operatório.

Resultados

Este procedimento foi realizado em ratos Lewis adultos (n = 26). O tempo médio de operação foi de 15 ± 3 min. Não houve mortalidade intra-operatória. O tempo de intubação média - de colocação de rato em cima do aparelho de intubação para o estabelecimento da ventilação - foi de 45 ± 5 segundos. 24 ratos tiveram uma recuperação completa da operação, sem evidência de dificuldades respiratórias ou hemorragia através dia de pós-operatório (DPO) 14. Um rato desenvolvido dificuldade respiratória em POD 4 e foram submetidos a ...

Discussão

O presente protocolo para thymectomy completa fornece uma abordagem minimamente invasiva com um fecho de incisão de três camadas com aplicação de cola cirúrgica projetado para minimizar as complicações. A remoção completa do timo foi demonstrado pela perda de células T naive e por IHC coloração do tecido linfóide do mediastino para citoqueratina.

O procedimento de thymectomy rato adulto tem sido complicada por taxas de mortalidade variando de 1,5 - 20% devido a complicações peri-operatórias,...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
			2 polegadas 14 G
Microscópio cirúrgico	Zeiss
Almofada
Monitor de frequência cardíaca e oxigenação sanguínea para roedores com sensores de pé	Aparelho Harvard	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (sensor de pé de rato)
Aparelho de intubação (plástico com barra de metal na parte superior)			Ver Figura 2
de anestesia para pequenos animais com caixa de indução, tanque de isoflurano e tanque de O2	Harvard Apparatus	ST1 72-6420
Ventilador para pequenos animais com tubulação	CWE	12-02000 (ventilador) e 12-04000 (conjunto de válvula externa para camundongos/ratos)
Iluminador de fibra óptica de alta intensidade	Dolan Jenner	EEG 2823M
Pinça de padrão padrão do aluno	Ferramentas de Belas Ciências	91100-16
Tesoura reta fina	Ferramentas de Ciências Finas	14060-09
Tesoura de karité de ponta romba	Ferramentas de Ciências Finas	14105-12
Afastador de Alm Pequeno (para esterno)	Ferramentas de Ciências Finas	17008-07
Pinça de Graefe sem corte	Ferramentas de Ciências Finas	11050-10
Pinça Dumont Fine	Ferramentas de Ciências Finas	11254-20
5-0 Suturas Maxon	Ethicon
4-0 Suturas de seda (com agulha cortante)	Sutura de nylon Ethicon
6-0	Cola
(Endermil)
Gel de lubrificação	Akorn Animal Saúde	NDC 17478-162-35

Angiocateter de de aquecimentoSistema de cianoacrilato Ethicon