Artigo de método

Um método de extração de DNA híbrido para a Avaliação de comunidades bacterianas Qualitativa e Quantitativa de amostras de produção de aves de capoeira

DOI:

10.3791/52161

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10 de dezembro de 2014

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1Egg Safety and Quality Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 2Poultry Microbiological Safety and Processing Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 3Department of Biochemistry and Biophysics, Oregon State University, 4College of Public Health, University of Georgia, 5Department of Biological Sciences, Center for Microbial Genetics and Genomics, Northern Arizona University

Neste artigo

Resumo

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Um novo método de extração de DNA híbrido semiautomatizado para uso com amostras de produção de aves ambientais foi desenvolvido e demonstrou melhorias em relação a um método comum de extração mecânica e enzimática em termos de estimativas quantitativas e qualitativas do total de comunidades bacterianas.

Resumo

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A eficácia dos protocolos de extracção de ADN podem ser altamente dependente tanto do tipo de amostra a ser investigada e os tipos de análises realizadas a jusante. Considerando-se que a utilização de novas técnicas de análise da comunidade bacteriana (por exemplo, microbiomics, metagenómica) está se tornando mais prevalente nas ciências agrícolas e ambientais e muitas amostras ambientais dentro dessas disciplinas pode ser physiochemically e microbiologicamente único (por exemplo, fezes e amostras de maca / cama de o espectro de produção de aves), métodos de extração de DNA apropriadas e efetivas precisam ser cuidadosamente escolhido. Portanto, um novo método semi-automatizado de extração de DNA híbrido foi desenvolvido especificamente para uso com amostras de produção de aves ambiental. Este método é uma combinação dos dois tipos principais de extracção de ADN: mecânica e enzimática. A intensa etapa de homogeneização mecânica de duas etapas (usando talão batendo formulado especificamente para ambientesAmostras Tal) foi adicionado ao início do método "padrão de ouro" de extracção de ADN enzimático para as amostras fecais para melhorar a remoção de bactérias e ADN a partir da matriz da amostra e melhorar a recuperação dos membros Gram-positivas comunitárias bacterianas. Uma vez que a porção de extração enzimática do método híbrido foi iniciada, o restante processo de purificação foi automatizado usando uma estação de trabalho robótica para aumentar a produtividade de amostras e diminuir o erro de processamento da amostra. Em comparação com os rigorosos métodos de extração de DNA mecânicos e enzimáticos, este método híbrido novela proporcionou o melhor desempenho global combinada ao considerar quantitativa (usando 16rRNA qPCR) e qualitativa (usando microbiomics) estimativas do total de comunidades bacterianas ao processar fezes de aves e amostras de serapilheira .

Introdução

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Ao analisar amostras clínicas ou ambientais complexas (por exemplo, fezes, solos), existem duas metodologias principais usadas para a extração de DNA. A primeira é uma ruptura mecânica da matriz usando uma etapa intensa de batida de contas, enquanto a segunda é uma ruptura enzimática da matriz para liberar quimicamente células bacterianas e inibir os inibidores de PCR da matriz simultaneamente. Dados os diferentes meios pelos quais esses dois tipos de métodos de extração funcionam, não é surpreendente que estudos anteriores tenham demonstrado que o método de extração de DNA apropriado é altamente dependente da amostra e da análise. Estudos comparativos de extração de DNA mostraram anteriormente que alguns métodos são mais apropriados para melhorar a qualidade e a quantidade de DNA de amostras ambientais1-3, enquanto outros demonstraram melhorias para análises em nível de comunidade, como eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) 4-6, polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição terminal (T-RFLP) 7, análise automatizada de espaçador intergênico ribossômico (ARISA) 8 e microarrays filogenéticos9. Portanto, métodos apropriados de extração de DNA precisam ser usados, ou desenvolvidos, de acordo com os tipos de amostras ambientais e os tipos de análises que estão sendo realizadas nessas amostras, especialmente devido aos recentes avanços nas análises da comunidade bacteriana.

O sequenciamento de próxima geração, em conjunto com avaliações mais quantitativas da comunidade (por exemplo, PCR quantitativo (qPCR)), está se tornando mais prevalente nas ciências ambientais e clínicas, no entanto, muito pouca pesquisa foi realizada para determinar o efeito dos métodos de extração de DNA nesses conjuntos de dados. A maioria dos estudos de comparação de extração de DNA lidou com estimativas de comunidades microbiômicas de amostras humanas ou de modelos humanos10,11, não com amostras de animais agrícolas. Os poucos estudos de sequenciamento de próxima geração focados em aves lidaram com questões metagenômicasespecíficas 12,13 ou microbiômicas14; eles não discutiram o efeito do método de extração de DNA nas análises microbiômicas resultantes. Considerando a natureza complexa das amostras ambientais relacionadas à produção de aves (por exemplo, fezes, cama/cama, solo de pastagem), os métodos de extração de DNA precisam ser cuidadosamente selecionados. Sabe-se que amostras ambientais relacionadas a aves contêm um grande número de inibidores de PCR e diluições de extrato de DNA de até 500 vezes foram necessárias para PCR e subsequente análise a jusante15-17. Portanto, é essencial que os métodos de extração de DNA sejam otimizados para esses tipos de amostras, a fim de não apenas romper fisicamente a matriz, mas também para poder reduzir/eliminar o grande número de inibidores presentes.

O QIAamp DNA Stool Mini Kit, um método de extração enzimática, foi considerado o "padrão ouro" ao extrair DNA de amostras intestinais / fecais difíceis1,18,19 e foi aplicado com sucesso em amostras ambientais de aves8,14. A remoção enzimática de inibidores de PCR por meio do uso de uma matriz proprietária é uma das maiores vantagens do uso desse método para esses tipos de amostras ambientais, assim como a capacidade de melhorar significativamente o rendimento (e reduzir o erro de processamento de amostras) usando estações de trabalho automatizadas. Uma grande desvantagem é a falta de uma etapa de homogeneização mecânica para dissociar fisicamente as células bacterianas da matriz ambiental. Ao testar amostras intestinais e fecais de origem não avícola, a adição de uma etapa de batimento de esferas ou ruptura mecânica dentro de um protocolo de extração de DNA aumentou significativamente a eficiência de extração9, o rendimento / qualidade do DNA1,4,5 e melhorou significativamente as análises da comunidade a jusante em termos de riqueza, diversidade e cobertura5,6,11. Esses estudos compararam não apenas os métodos mecânicos de batimento de contas com o método enzimático "padrão ouro", mas alguns também adicionaram a etapa mecânica de batimento de contas ao protocolo enzimático para melhorar os resultados6,9,11.

De acordo com os resultados dos estudos acima, as análises da comunidade bacteriana (qualitativas e quantitativas) podem ser melhoradas a partir de amostras ambientais relacionadas às aves por meio da adição de uma etapa de homogeneização mecânica ao método enzimático. Portanto, o objetivo deste estudo foi duplo: (1) desenvolver uma nova técnica de extração de DNA que utilize os aspectos mais desejáveis dos métodos de extração mecânicos (poderosa etapa de homogeneização) e enzimáticos (remoção e automação de inibidores de PCR) e (2) comparar as avaliações quantitativas (via qPCR) e qualitativas (via microbiômica) da comunidade bacteriana deste novo método com métodos mecânicos e enzimáticos representativos.

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Protocolo

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1. Homogeneização Mecânica de Amostras de Produção Avícola Ambiental

  1. Antes da extração, regular o banho-maria a 95 °C e deixar que o tempo de banho-maria atinja essa temperatura.
  2. Pese 0,33 g de solo ou material fecal em um tubo Lysing Matrix E de 2 ml.
    1. Não exceda 0,33 g de amostra no tubo, pois isso fará com que as seguintes soluções excedam a capacidade do tubo.
    2. Descongelar as amostras congeladas em RT antes da pesagem.
    3. Para analisar um total de 1 g de solo/fezes, pesar 3 amostras repetidas de 0,33 g para cada amostra ambiental individual.
    4. Armazene as amostras a -20 °C dentro dos tubos de matriz cônica antes da extração, se necessário.
  3. Adicione 825 μl de tampão fosfato de sódio e 275 μl de solução PLS a um tubo de amostra. Misture usando um vórtice por ~ 15 segundos e, em seguida, centrifugue as amostras a 14.000 x g por 5 min.
  4. Transvase o sobrenadante e adicione 700 μl de tampão ASL. Misture usando um vórtice por 5 segundos.
    1. Certifique-se de que haja espaço livre (~ 10% do volume total) disponível no tubo cônico neste momento. Se não houver headspace, os tubos terão tendência a vazar durante a próxima etapa de homogeneização, o que pode levar à contaminação cruzada e/ou perda de amostra.
  5. Coloque as amostras em um instrumento FastPrep 24 e homogeneize as amostras a uma velocidade de 6,0 m/s por 40 segundos.
  6. Centrifugue a amostra homogeneizada a 14.000 x g durante 5 min. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml.
  7. Para maximizar a recuperação de DNA da amostra, repita as etapas 1.4 a 1.6, combinando os sobrenadantes no mesmo tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml.

2. Inibição enzimática de inibidores de homogeneizados de amostras

NOTA: Este protocolo usa o QIAamp DNA Stool Mini Kit.

  1. Incube o sobrenadante em banho-maria a 95 °C por 5 min para maximizar a recuperação de DNA de quaisquer células remanescentes dentro do sobrenadante.
    1. Incubar a 70 °C para amostras contendo principalmente organismos Gram-negativos. No entanto, se estiverem presentes organismos Gram-positivos (que é o caso das amostras fecais de aves), incubar a 95 °C.
    2. Use clipes de travamento de plástico nos tubos da microcentrífuga para garantir que os tubos não se abram e potencialmente percam o volume da amostra, pois a pressão pode se acumular nesses tubos de microcentrífuga selados.
  2. Abra cada tubo de microcentrífuga para liberar a pressão, tampe novamente os tubos de microcentrífuga e misture usando um vórtice por 15 segundos.
  3. Centrifugue a amostra a 14.000 x g por 1 min, remova 1,2 ml do sobrenadante e coloque-a em um novo tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml.
  4. Adicione 1 aba InhibitEx a cada amostra e misture usando um vórtice até que a amostra se torne um líquido uniformemente branco/esbranquiçado.
    1. Evite tocar na guia InhibitEx ao colocá-la no tubo de microcentrífuga que contém a amostra. Para isso, coloque o blister contendo a aba diretamente sobre o tubo de microcentrífuga aberto e empurre suavemente a aba para fora do blister e para dentro do tubo de microcentrífuga.
  5. Incubar a amostra por 1 min em RT (~ 25 °C) e centrifugar a 14.000 x g por 5 min.
  6. Transfira todo o líquido para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml e centrifugue a 14.000 x g por 5 min.
    1. Evite quaisquer partículas remanescentes que possam ter sido peletizadas no fundo do tubo da microcentrífuga no final da etapa 2.5 ao transferir o líquido.

3. Purificação automatizada de DNA usando a estação de trabalho robótica QIAcube

NOTA: O número de consumíveis plásticos, a disposição dos adaptadores do rotor de amostra dentro da centrífuga e os volumes necessários dos tampões/soluções dependem do número de amostras que estão sendo executadas.

  1. Adicione tubos de eluição e tubos de filtro às ranhuras apropriadas dentro dos adaptadores do rotor. Para cada amostra, adicione 400 μl à ranhura central do adaptador do rotor. Coloque os adaptadores do rotor na centrífuga da estação de trabalho no arranjo correto de acordo com o número de amostras a serem purificadas.
    1. Certifique-se de que todas as tampas do tubo da microcentrífuga estejam devidamente presas dentro do adaptador do rotor, pois uma falha em fazê-lo pode resultar em cisalhamento durante uma das etapas de centrifugação do protocolo de purificação.
  2. Adicione o número necessário de ponteiras de filtro de 1.000 μl e 200 μl à estação de trabalho e encha os frascos de tampão fornecidos com o volume necessário de tampões.
    NOTA: Os tampões necessários para este protocolo de purificação (AL, AW1, AW2 e AE) estão todos contidos no QIAamp DNA Stool Mini Kit. O usuário precisa fornecer o etanol 100% necessário para os tampões AW e como solução utilizada no processo de purificação.
  3. Adicione o volume necessário da solução de proteinase K fornecida em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml e coloque-o no slot A da estação de trabalho. Além disso, adicione o número necessário (igual ao número de amostras a serem purificadas) de tubos de amostra de microcentrífuga RB de 2 ml com trava segura à seção do agitador da estação de trabalho.
    1. Certifique-se de que as tampas dos tubos de amostra estejam bem colocadas nos slots apropriados na estação de trabalho, pois a falha em fazê-lo resultará em um erro quando a máquina escanear inicialmente a estação de trabalho para garantir que todos os plásticos e líquidos necessários estejam disponíveis para a execução solicitada.
  4. Usando a tela sensível ao toque na estação de trabalho, selecione o Protocolo de Detecção de Patógenos de Fezes Humanas – DNA Stool – e leia as telas subsequentes para garantir que a estação de trabalho foi carregada corretamente. Depois que todas as telas de verificação forem aprovadas, selecione Iniciar para executar este protocolo.
    1. Se estiver extraindo DNA de mais de 12 amostras, inicie o processo de homogeneização (Etapa 1) para o próximo conjunto de amostras, pois uma execução de 12 amostras leva ~ 72 minutos para ser concluída na estação de trabalho.
  5. Remova as amostras dos adaptadores do rotor, tampe-as e coloque-as a -20 °C até que sejam necessárias para análises subsequentes a jusante.
    1. Neste ponto, combine as 3 purificações replicadas para uma amostra individual (quantidade total analisada = 1 g) usando um sistema baseado em centrifugação/evaporação. Combinar os replicados e reeluí-los até obter um volume final de 100 μl de tampão Tris-ETDA.

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Resultados

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Para este estudo, excrementos fecais frescos e amostras de cama foram recuperados de um galpão comercial de frangos de corte (~ 25.000 aves) no sudeste dos EUA. Os frangos de corte (Gallus gallus) foram cruzados Cobb-500 e tinham 59 dias de idade no momento da amostragem. Amostras frescas de fezes e cama foram recuperadas de quatro áreas distintas dentro da casa (perto da almofada de resfriamento, perto das linhas de bebedouro / alimentador, entre as linhas de bebedouro / alimentador e perto de exaustores), e as...

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Discussão

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O método de extração de DNA utilizado efetuou as estimativas quantitativas e qualitativas da comunidade bacteriana total para as amostras fecais e de serapilheira, apoiando a natureza dependente das análises de amostras dos métodos de extração de DNA vistos anteriormente1,3,6. Para as amostras fecais e de serapilheira, a ordem de desempenho dos métodos de extração de DNA foi diferente para as estimativas quantitativas (Mecânica > Híbrida > Enzimática) e qualitativa (Enzimática > Híbrida > Mecânica) da comunida...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer a Latoya Wiggins e Katelyn Griffin por sua assistência na aquisição de amostras, bem como a Laura Lee Rutherford por sua assistência em amostragens e análises moleculares. Também gostaríamos de agradecer a Sarah Owens, do Argonne National Lab, pela preparação e sequenciamento de amostras microbiômicas. Essas investigações foram apoiadas igualmente pelo Serviço de Pesquisa Agrícola, Projetos CRIS do USDA "Redução de Patógenos e Parâmetros de Processamento em Sistemas de Processamento de Aves" # 6612-41420-017-00 e "Abordagens Moleculares para a Caracterização de Patógenos Transmitidos por Alimentos em Aves" # 6612-32000-059-00.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Matriz de lise E tuboMPBio6914-050Diferentes tamanhos disponíveis e os últimos 3 números do gato. Não. indicar tamanho (-050 = 50 tubos, -200 = 200 tubos, -1000 = 1.000 tubos)
Solução de Fosfato de SódioMPBio6570-205Pode ser adquirido individualmente ou também contido no FastDNA Spin Kit para fezes (Cat. Nº 116570200)
Tampão PLSMPBio6570-201
Tampão ASL (560 ml)Homogeneizador Qiagen19082
FastPrep 24MPBio11600450048 x 2 ml Adaptador HiPrep (Cat. Nº 116002527) disponível para dobrar o rendimento da etapa de homogeneização mecânica
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292Os resultados preliminares mostram que o QIAcube HT (Cat. Nº 9001793) pode ser usado para melhorar o rendimento, mas diferentes consumíveis são necessários para esta máquina e mais trabalho comparativo precisa ser feito.
Pontas de Filtro, 1.000 ml (1024)Qiagen990352
, 200 ml (1024)Adaptadoresde Rotor Qiagen 990332
QIAcube (10 x 24)Qiagen990394Para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml incluídos no kit adaptador de rotor, existe uma alternativa.  É Sarstedt Micro tubo 1,5 ml Tampa de segurança, Cat. Nº 72.690
Tubos de amostra RB (2 ml)Qiagen990381Alternativa: Eppendorf Safe-Lok micro tubo de ensaio, Cat. Nº 022363352
Pontas de Filtro

Referências

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