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Research Article
Pierangela Giustetto1,2, Miriam Filippi2, Mauro Castano3, Enzo Terreno1,2
1Center for Preclinical Imaging, Department of Molecular Biotechnology and Health Sciences,University of Turin, 2Molecular Imaging Center, Department of Molecular Biotechnology and Health Sciences,University of Turin, 3Bracco Research Center,Bracco Imaging SpA
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Erratum Notice
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Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
O presente trabalho descreve um novo protocolo para realizar ultrassom não invasivo de alta frequência e imagens fotoacústicas no cérebro de ratos, para visualizar com eficiência regiões subcorticais profundas e seus padrões vasculares, direcionando sinais nos forames cranianos naturalmente presentes no crânio do animal.
A fotoacústica e o ultrassom de alta frequência se destacam como ferramentas poderosas para aplicações neurobiológicas que permitem imagens de alta resolução no sistema nervoso central de pequenos animais. No entanto, a neuroimagem transdérmica e transcraniana é frequentemente afetada por baixa sensibilidade, aberrações de imagem e perda de resolução do espaço, exigindo a remoção do couro cabeludo ou mesmo do crânio antes da imagem. Para superar esse desafio, um novo protocolo é apresentado para obter informações significativas sobre hemodinâmica cerebral por meio de imagens fotoacústicas e ultrassons de alta frequência com a pele e o crânio do animal intactos. O procedimento depende da passagem de ondas de ultrassom (US) e laser diretamente através das fissuras que estão naturalmente presentes no crânio do animal. Ao justapor o dispositivo transdutor de imagem exatamente em correspondência com essas áreas selecionadas onde o crânio tem uma espessura reduzida ou está totalmente ausente, pode-se adquirir imagens profundas de alta qualidade e explorar regiões internas do cérebro que geralmente são difíceis de descrever anatômica ou funcionalmente sem uma abordagem invasiva. Ao aplicar este procedimento experimental, dados significativos podem ser coletados nas modalidades sonora e optoacústica, permitindo a imagem do parênquima e da anatomia vascular muito abaixo da superfície da cabeça. Características cerebrais profundas, como convoluções parenquimatosas e fissuras separando os lobos, eram claramente visíveis. Além disso, a configuração de vasos sanguíneos grandes e pequenos foi fotografada a vários milímetros de profundidade, e informações precisas foram coletadas sobre fluxos sanguíneos, velocidades do fluxo vascular e o estado químico da hemoglobina. Esse repertório de dados pode ser crucial em vários concursos de pesquisa, desde estudos de doenças vasculares cerebrais até técnicas experimentais envolvendo a administração sistêmica de produtos químicos exógenos ou outros objetos dotados de propriedades de aprimoramento de contraste de imagem. Em conclusão, graças ao protocolo apresentado, as técnicas de US e PA tornam-se um meio atraente e não invasivo de desempenho competitivo para imagens cerebrais corticais e internas, mantendo um potencial significativo em muitos campos neurológicos.
Estratégias para descrever minuciosamente características da hemodinâmica do cérebro no sistema nervoso central de animais pequenos são necessários para fazer avançar o campo de neuroscience 1-3. A técnica apresentada demonstra como executar acústica não-invasivo e de imagem fotoacústica no cérebro pequeno animal a fim de examinar a biologia vascular, arranjo e função.
Técnicas de imagem Optical permitir a localização de eventos relacionados com a atividade neural 2,4-5 e adquirir simultaneamente os sinais gerados pela hemoglobina, tanto em estados oxigenada e não oxigenados 6. No entanto, devido à absorção e espalhamento fotônico, imageamento óptico puro sofre de baixa resolução espacial e tecido limitada profundidade de penetração 7-8. Por outro lado, a acústica oferecem a oportunidade de realizar imagem mais profunda com maior resolução espacial espaço, mas é impedido por salpico e limitado contraste 9-11. Através da combinação de características de fotônica with ultra-som, técnica fotoacústica melhora tanto de imagem e potencialidades de diagnósticos de métodos únicos 12-16.
Imaging Fotoacústica do cérebro tem o potencial para elucidar questões de múltipla em neurobiologia, no entanto, a calota craniana que naturalmente protege o encéfalo, dramaticamente limita tanto a 17-19 penetração nos tecidos fotônicos e ultra-som. Além disso, os ossos promover dispersão de luz e som, resultando em perda de sensibilidade e de imagem aberrações 17-18. Como conseqüência, ultra-som e de imagem fotoacústica cérebro pode ser facilmente realizada em animais recém-nascidos antes de ossificação 20, mas a anatomia profunda e fisiologia do cérebro adulto são claramente acessível apenas após craniotomia 21,22. Infelizmente, a cirurgia necessária para a remoção do crânio é tecnicamente difícil e os seus efeitos podem ser prejudicial para alguns fins experimentais, tornando assim difícil para monitorar a progressão da doença neural nomesmo animal ao longo do tempo. Portanto, um método não-invasivo para a imagem biologia cerebral profunda em pequenos modelos animais é altamente desejável. Na literatura o método de fotões reciclador 17 é relatado como uma forma de reduzir a perda de telefone e aumentar a transmissão através do crânio intactos, melhorando o sinal fotoacústico para ruído (SNR) e o contraste do alvo.
O protocolo apresentado tem como objetivo fornecer um método confiável para acústica cérebro subcortical e imagem fotoacústica em roedores de uso investigação (especificamente em ratos), sem qualquer cirurgia invasiva. O procedimento baseia-se no uso de dispositivos portáteis de transdução de ultra-som de alta frequência e de imagem fotoacústica. Em contraste com a tecnologia de imagens tomográficas 23, portátil e transdutores direcionais 24 permitem a seleção de regiões específicas do crânio com espessura naturalmente reduzido, denominado fissuras ou scissures. As fendas principais (forames) presentes no vertebrado umnimal crânio são necessárias para localizar os feixes de nervos, vasos ou outras estruturas que ligam os circuitos internos do encéfalo para outras partes do corpo. As fendas principais são encontrados em aberturas osso de diferentes tamanhos que podem ser explorados como passagens específicas para as ondas de ultra-som e de laser. Tal imagem alvo reduz efeitos de reflexão de ondas causados pelas interfaces de osso e aumenta a sensibilidade, aumentando a profundidade de penetração de imagem. Nesta perspectiva, o transdutor de imagem podem ser dispostos de modo a ser perpendicular às fissuras localizadas no temporal e occipital do lado do crânio (Figura 1), de modo a convergir maximamente o ultra-som e vigas fotónicas sobre estas áreas. Esta orientação aumenta tanto a qualidade do sinal e força o sinal para prosseguir através de uma camada de osso mais fino em relação a outras orientações cranianos. Assim, as ondas transmitidas e reflectidas sofrer um menor grau de espalhamento, permitindo recolha de sinais intensos provenientes de mais profundocamadas de tecido. Ao contrário dos procedimentos anteriores, esta configuração experimental requer que raspa a cabeça apenas animal, enquanto nenhuma outra cirurgia é necessária.
Com o protocolo proposto, a imagem latente é realizada a relativamente alta resolução espacial, revelando tanto, estruturas anatômicas de referência específicos e vasos sanguíneos mais profundos do que estado atual de métodos de arte, tudo ao mesmo tempo a pele do animal e do crânio permanecem intactos. Imagens coronais e axiais exclusivos podem ser adquiridos através da exploração de diversas modalidades de aquisição de imagens de ultra-som (B, Doppler, Doppler colorido, modo de onda pulsada) em paralelo à imagem fotoacústica. Um repertório extenso de parâmetros podem ser extraídos a partir dessas imagens, permitindo representação da anatomia vascular do parênquima e ao lado de um conjunto de características que afectam toda a dinâmica de circulação sanguínea. Este protocolo pode ser usado para imagem características básicas parênquima cortical em High Frequency modalidade Ultrasonic B Mode, as artérias carótidas basilar e internos (BA e ICA respectivamente) compondo o Círculo de Willis, a artéria cerebral média (MCA) e outros detalhes do aparelho circulatório. Além disso, o sangue quantificação do fluxo, a média de velocidades de transmissão, descrição direcional movimento e dados de saturação de oxigênio podem ser coletadas de cortical para regiões profundas do cérebro.
Esta nova estratégia tem um grande potencial para uma variedade de aplicações e satisfaz a necessidade urgente de procedimentos seguros para descrever características profundas do cérebro que são cruciais em várias patologias. Além disso, devido à sua capacidade de invasão mínima, o protocolo apresentado pode permitir estudos de imagem possíveis inúmeras sobre o sistema nervoso central, particularmente aqueles que necessitam de um acompanhamento a longo prazo ou envolvendo modelos animais patológicas delicados.
Experimentos necessários para desenvolver o protocolo foram realizadas de acordo com as normas nacionais e foram aprovados pelo comitê de ciência ética local (Comitato di Bioetica di Ateneo), operando dentro da instituição, da Universidade de Turim, Turim, Itália.
1. Preparação
2. Aquisição de Imagem de Temporal Point of View
3. Criação de Imagens do Point of View occipital
4. Fim da Aquisição e remoção de animais
NOTA: Adequadamente considerar todo o tempo dedicado ao processo de aquisição de imagem (a partir do passo 1 para o passo 3), o qual é sujeito a restrições principais relacionados com a dose do anestésico aplicado ao animal.
Este método permite à imagem tanto estruturas de referência anatômicos e vasos sanguíneos específico a relativamente alta resolução espacial, mais profundo do que a técnica atual com a pele do animal e do crânio intacto. Nas nossas condições experimentais, a profundidade do sinal PA é de 4,5 mm e a resolução axial é de 75 um, com um FOV 23 x 15.5 cm. Experiências com Fotoacústica Tomografia modalidade 19 mostrou um valor de resolução <1 mm. A gama de valores de SNR é de 21,6 dB para 23,8 dB (obtidos por 5 pontos diferentes, seleccionados aleatoriamente no tecido cerebral e fundo). Justapor o transdutor no crânio lado temporal, as imagens do cérebro pode ser adquirida como secções transversais ou mesmo coronais com base no ângulo de posicionamento seleccionado do transdutor com um ponto de imagem resultante de vista de lateral (Figura 4). Epidermis, ossos do crânio e material de parênquima estão bem representados na ultra-som B-Mode, uma vez que muito diferentes em termos de acimpendence oustic (Figura 10). Mesmo se sua configuração depende do ponto de vista escolhido, alguns sites de referência anatômicos sobre o parênquima são reconhecíveis, tais como fissuras que separam cérebro porção interna do córtex e do trato óptico característico em forma (Figura 10). Além disso, um grande número de navios são visíveis tanto nas modalidades de imagens de ultra-som e fotoacústica. Interseções característicos da carótida interna Artery (ICA) com outros principais navios de grande porte que funcionam ao longo da superfície lateral externa do cérebro do animal pode ser facilmente reconhecido. Rotas vasculares grandes, como o ICA, fornecer um suprimento de sangue maciça para satisfazer a necessidade neuronal consistente de energia e oxigênio. O ICA, originado na artéria carótida comum (CCA), é executado no lado lateral da cabeça em vários milímetros de profundidade, vai além de todos os seus locais de bifurcação e, finalmente, chega a parte frontal da cabeça. Este fluxo de sangue principal espalha entre intermedicomi porte navios, antes de ser canalizada em arteríolas sempre menores para finalmente nutrem os neurônios. Do ponto de vista temporal, é possível traçar o padrão da Artéria Cerebral Interno, que bifurca-se em embarcações voltadas para frente e lateral do cérebro lateral. Imagens coronais e transversais pode ser adquirido com inclinação diferente do transdutor em relação à direcção do eixo virtual juntando o olho e a orelha do animal (Figura 4). Ao inclinar o transdutor de acordo com as projecções descritas na Figura 4, é possível obter imagens resolvidos da Artéria Cerebral Média (MCA), que surge a partir de ACI e ainda se divide em dois ou mais ramos, que finalmente envolvente lobos corticais (figuras 11 e 12). Os melhores efeitos visuais foram obtidos para MCA com a inclinação da sonda como mostrado na Figura 4c e para ICA como mostrado na Figura 4-B.
Imaging acústico à base de Doppler revela pequenos ramos, enquanto a informação de direção da corrente sanguínea é disponíveis graças à aquisição Color Doppler (Figura 13). Recurso artéria MCA é confirmado por ultra-som pulsado Onda técnica (Figuras 14 e 15). Sinal fotoacústico de hemoglobina contida nos glóbulos vermelhos circulantes podem ser detectados e analisados para coletar dados sobre o seu estado oxidativo molecular e para calcular a saturação de oxigênio no sangue (Figuras 16 e 17). Teor de oxigénio hemáticas pode ser correlacionada com dados sonoros, a fim de confirmar a discriminação de sangue arterial do sangue venoso.
Ao apontar o transdutor em direção ao forame occipital, a visão é projetada na cabeça plano axial (Figura 9) e este plano de imagem pode ser liquidada em ângulos de inclinação variável. Neste caso, o ponto de vista posterior da imagiologia cerebral pode ser conotado por um de alta profundidade, por causa da entrada occipital maior. O círculo de Willis, uma configuração de recipiente característico no cérebro profundo, pode ser localizada e examinados através da aplicação de todas as técnicas acima mencionadas. Artéria basilar (BA), em execução no lado ventral do cerebelo, eventualmente, leva à encéfalo e simetricamente bifurca-se em dois ramos. Esses dois ramos no cérebro ventral espalhar-se e, em seguida, juntar-se de novo, portanto, a criação de uma estrutura em anel (Círculo de Willis). Este círculo profunda basal é o porão vascular a partir do qual surgem todos os vasos sanguíneos de médio porte, como as artérias posteriores, médio e anterior cerebral (PCA, MCA e ACA, respectivamente), que são os principais efetores de um suprimento de sangue maciço para o cérebro . No Modo Doppler a cores, a identificação dos ramos de tamanho médio é viável e permite a visualização clara dos segmentos vasculares curvas (como o PCA) que entra no Círculo de Willis (Figura 18).
nt "> O tecido do parênquima cerebral foi também registado com modalidade PA em projecção occipital (Figura 19) mostram a caracterização vascular na trama espectral (Figura 20). Com este espectro é possível distinguir o sinal obtido a partir de vasos arteriais e venosos.
Figura 1: Localização do forame crânio e respectivo ponto de vista para aquisição de imagem A cabeça de rato no perfil (a) e os locais onde o dispositivo transdutor de imagem podem ser colocados para ser justapostas em forame temporais (seta roxa) e sobre o forame occipital. (seta amarela) no perfil (b).

Figura 2: eliminação Animal para temporais acquisitio imagemn. (A) A disposição do animal sobre a bancada de aquisição de imagens: após a cabeça de barbear, o animal é colocado numa posição de bruços, com o corpo ligeiramente inclinada de um lado de forma a expor o lado temporal da cabeça. A bancada pode ser, possivelmente, dotado de um dispositivo de aquecimento para manter o corpo quente do animal durante a aquisição. Alguns rolos de algodão podem ser utilizados para obter esta posição, enquanto que os emplastros adesivos prender patas sobre os sensores para a monitorização de sinais vitais. (B) Uma camada de gel de ultra-som consistente cobre a área da cabeça em que o transdutor será posicionado durante o exame.

Figura 3: parâmetros de aquisição de imagem B-Mode. (A) Uma imagem ilustrativa que mostra o painel informando os parâmetros de aquisição importantes utilizados com imagens do cérebro em B-mode. (B) É importante ressaltar que a freqüência de transmissão foi definido em valores baixos (16 MHz) para melhorar a US penetração nos tecidos.

Figura 4: aquisição de imagem transversal do forame temporal (a) O eixo de referência virtual juntando a aurícula do olho e do movimento de inclinação (seta vermelha) para variar a inclinação transdutor e do plano de aquisição de imagem; (b) movimento anti-horário com relação a. eixo de referência orelha-a-olho e inclinação variável da posição do transdutor; c) o movimento no sentido horário em relação ao eixo de referência orelha-a-olho e inclinação variável da posição do transdutor.

Figura 5: profundidade do foco ideal para USe aquisição de imagem PA. Ao olhar para a área de interesse, a profundidade do foco de imagem (representada por um triângulo amarelo) deve ser fixado em cerca de 10 mm de profundidade a partir da fonte de laser / EUA, a fim de obter um desempenho ideal de imagem.

Figura 6: parâmetros de aquisição de imagem Modo Doppler a cores. (A) Antes de iniciar a aquisição de imagens no modo Doppler a cores, a opção portão respiração pode ser ligado, a fim de evitar o artefato gerado por movimentos respiratórios fisiológicas. (B) Uma tela exemplificando mostrando os parâmetros de aquisição importantes utilizados com imagens do cérebro em Doppler colorido Mode.

Figura 7: Aquisição parâmetros para a imagem latente modo Doppler de potência. Uma imagem ilustrativa mostrando os parâmetros de aquisição importantes utilizados com imagens do cérebro em modo Doppler de potência.

Figura 8: parâmetros de aquisição de imagem Modo Fotoacústica. (A) O painel relatando os parâmetros de aquisição importantes utilizados para imagiologia cerebral no Modo Fotoacústica. (B) A aquisição de um espectro fotoacústica, com base num laser de excitação varia de 680 nm a 970 nm, com um intervalo de comprimento de onda de 5 nm (referida como etapa tamanho). (parâmetros c) Aquisição de empregados para a onda único modo Fotoacústica em 750 nm e 850 nm, para a discriminação de sinais de-oxigenados e hemoglobina oxigenada respectivamente.
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Figura 9:. Aquisição de imagem transversal do forame occipital (a) posicionamento do transdutor no pescoço do animal (seta amarela) e o plano de imagem resultante transversal que praticamente seções da cabeça na direção caudo-rostral; (b) vista posterior do posicionamento do transdutor e imagem plano de aquisição.

Figura 10:. Aquisição B-Mode de forame temporais para a individuação de referências anatômicas da epiderme (a), crânio (b) e parênquima (c) podem ser facilmente distinguidas, mas também outras referências anatômicas podem ser detectados, como a fissura ( d) que envolve a porção ventral cerebral profunda e a forma característica do trato óptico (e).


Figura 12: aquisição Mode Power Doppler através do forame temporais para a individuação de referências vasculares MCA levantando do ICA no lado temporal do cérebro.. Para obter esse ponto de vista, imagem transversal foi adquirida pela apontando o transdutor sobre o forame temporais e girando-a no sentido horário.

Figura 14: Modo de aquisição onda pulsada através do forame temporais para a individuação de referências vasculares confirmação das propriedades arteriais de sangue que circula no interior dos vasos que foram hipoteticamente identificados como: artérias. Modo de onda pulsada fornece informações sobre a variação das velocidades de transmissão, que pode ser correlacionado para efeito da pulsação cardíaca (mais inteNSE em artérias do que nas veias).

Figura 15: aquisição modo pulsado Onda através do forame temporais para a individuação de referências vasculares Identificação por modo de onda pulsada dos vasos sanguíneos como veias, onde o efeito de pulsação cardíaca em velocidades de transmissão é insignificante..

Figura 16: Modo de aquisição Fotoacústica através do forame temporais para a individuação de referências vasculares. Vasos internos do parênquima no lado temporal do cérebro visualizado por B-Mode (esquerda) e de ondas Single Mode Fotoacústica (à direita). As cores da barra de escala refletem diferentes valores de intensidade de sinal fotoacústico, induzidas por uma excitação laser realizado em um comprimento de onda selecionado. Em order para individualizar as veias e artérias, comprimentos de onda de excitação pode ser fixado em 750 e 850 nm, representando os valores para se obter os picos de emissão fotoacústico de hemoglobina desoxigenada e oxigenado, respectivamente.

Figura 17: Modo de aquisição Fotoacústica através do forame temporais para oxigenado e oxigenado-de discriminação hemoglobina. Vasos internos no lado temporal do cérebro visualizado por B-Mode (à esquerda) e Modo Fotoacústica Oxy-Hemo (à direita). As cores da barra de escala refletem diferentes valores percentuais de saturação de oxigênio da hemoglobina no sangue.

Figura 18: aquisição Modo Doppler a cores através do forame occipital para a individuação de referências vasculares.Segmentos vasculares curvas criando a estrutura porão do Círculo de Willis, localizado no lado ventral do cérebro.

Figura 19: Fotoacústica e B-Mode aquisição através do forame occipital para a individuação de referências vasculares. Nell'immagine em modo-B si possono evidenziare le strutture Anatomiche individuabili con la proiezione occipitale e nella corrispondente acquisizione con modalità fotoacustica con rilevamento spettrale tra 670 nm a 980 nm (con passo di 5 nm).

Figura 20: Fotoacústica e B-Mode aquisição através do forame occipital para a individuação de referências vasculares. Em questa imaginar viene rappresentato lo Spettro corrispondente alle tre ROIs tracciate um livello del parenchima cerebellare; em particolare sono tracciate um livello di tre strutture vascolari, la cui tipologia si differenzia um livello dell'andamento spettrale (ROIs fuxia e celeste corrispondono um strutture vascolari venose; ROI Gialla corrisponde ad una struttura vascolare arteriosa).
Taxas de publicação deste artigo foram patrocinados pela Visual Sonics.
O presente trabalho descreve um novo protocolo para realizar ultrassom não invasivo de alta frequência e imagens fotoacústicas no cérebro de ratos, para visualizar com eficiência regiões subcorticais profundas e seus padrões vasculares, direcionando sinais nos forames cranianos naturalmente presentes no crânio do animal.
Os autores não têm agradecimentos.
| Estação de ultrassom e imagem fotoacústica de alta frequência (sistema VEVO LAZR 2100) | FUJIFILM VisualSonics Inc. | ||
| Sistema de Anestesia Dupla Compacto Vevo (Versão de Mesa) | FUJIFILM VisualSonics Inc. | http://www.visualsonics.com/anesthesiasystem#sthash.opODt Sht.dpuf | |
| Gel de transmissão de ultrassom (Aquasonic 100) | Parker Laboratories Inc. | 01-08 | http://www.parkerlabs.com/aquasonic-100.asp |
| ratos Sprague-Dawley | Charles River Laboratories | Três ratos Sprague-Dawley saudáveis de 6 semanas foram comprados da Charles River Laboratories e mantidos em alojamento padrão (ciclos claro-escuro de 12 horas) com ração padrão para roedores e água disponível ad libitum. Fornecido por: http://www.criver.com/ |