Um método para investigar a estrutura de um fotorreceptor de proteína usando microscopia de força atômica (AFM) é descrito neste artigo. O Mapeamento Quantitativo de Propriedades Nanomecânicas PeakForce (PF-QNM) revela dímeros de proteínas intactos em uma superfície de mica.
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Artigo de método
Microscopia de Força Atômica da Red-Light fotorreceptores Usando Mapeamento PeakForce Quantitative nanomecânicos Propriedade
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microscopia de força atômica (AFM) usa uma ponta piramidal anexado a um cantilever para sondar a resposta força de uma superfície. Os desvios de ponta pode ser medido para ~ 10 pN por um detector de laser e dividida em sectores, que pode ser convertido em imagem topografia. Modulação de amplitude ou AFM "modo de tocar" envolve a sonda fazer contato intermitente com a superfície, enquanto oscilando em sua freqüência de ressonância para produzir uma imagem. Usado em conjunto com uma célula de fluido, tocando-AFM modo permite a imagiologia de macromoléculas biológicas, tais como proteínas em condições fisiologicamente relevantes. Tocar de modo AFM requer sintonia manual da sonda e ajustes frequentes de uma infinidade de parâmetros de verificação que pode ser um desafio para usuários inexperientes. Para obter imagens de alta qualidade, esses ajustes são mais demoradas.
PeakForce Quantitative nanomecânicos mapeamento da propriedade (PF-QNM) produz uma imagem medindo a respon vigorcurva se para cada ponto de contato com a amostra. Com o software ScanAsyst, PF-QNM pode ser automatizado. Este software ajusta o set-point, a frequência da unidade, taxa de varredura, os ganhos, e outros parâmetros de digitalização importantes automaticamente para uma determinada amostra. Não só este processo de proteger ambas as sondas frágeis e amostras, que reduz significativamente o tempo necessário para obter imagens de alta resolução. PF-QNM é compatível para imagens AFM de fluido; portanto, ele tem uma vasta aplicação para geração de imagens materiais biologicamente relevantes.
O método apresentado neste artigo descreve a aplicação de PF-QNM para obter imagens de uma bacteriana fotorreceptor da luz vermelha, RpBphP3 (P3), a partir da fotossíntese R. palustris no seu estado adaptado luz. Usando este método, os dímeros de proteínas individuais de P3 e agregados de dímeros foram observados sobre uma superfície de mica na presença de um tampão de imagens. Com os ajustes apropriados para a superfície e / ou concentração da solução, este métodopode ser geralmente aplicada a outras macromoléculas biologicamente relevantes e materiais macios.
Introdução
Microscopia de força atómica (AFM), tornou-se uma ferramenta importante para investigar as propriedades estruturais e mecânicas, de superfícies de filmes finos, e as moléculas individuais desde sua invenção em 1986 (Figura 1). 1-3 Usando uma célula de líquido, o método possui tornam-se particularmente útil em estudos de macromoléculas biológicas e células, mesmo vivendo em um ambiente fisiologicamente relevante. 4-10 Tocar de modo AFM tem sido tradicionalmente usada para imprimir materiais macios ou moléculas frouxamente ligados à superfície, pois o contato de modo AFM é tipicamente inadequada devido para os danos causados pel....
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Protocolo
1 computador e microscópio Configurar
- Abrir a válvula de cilindro de N 2 e ajustar os botões para assegurar a tabela de ar é flutuante e nível.
- Ligue o computador, controlador e luz de fibra óptica por esta ordem.
- Configure o scanner para o modo / LFM AFM e centralizar a câmera sobre a cabeça AFM.
- Software aberto. Selecionar categoria experimento "Propriedades nanomecânicos", "Quantitative nanomecânicos Mapping" no grupo experimento, e "PeakForce QNM em Fluid" sob experimento. Clique em Carregar Experiment e depois Setup.
- Foque a câmara usando o objetivo Z para ver a superfície do palco. Usando o grosseiro....
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Resultados
Imagens AFM representativos de uma proteína de fotorreceptores, P3, no seu estado adaptado-luz são apresentados nas Figuras 3 e 4. Um substrato de mica clivada de fresco, (Figura 3A) é uma superfície adequada, plana para a adsorção de proteínas. Recolha de uma imagem de mica limpo como um controlo negativo é importante por várias razões. Em primeiro lugar, ele garante a célula líquido é limpo e sem materiais residuais de experimentos anteriores irá contaminar a superfíc.......
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Discussão
AFM é um método de microscopia de sonda de varrimento totalmente capazes de fornecer imagens de proteínas e outras macromoléculas biológicas em condições fisiologicamente relevantes. Em comparação com a cristalografia de raios-X e RMN, uma limitação da AFM é a sua incapacidade para alcançar a mesma resolução, particularmente resolução lateral. Quando utilizando AFM para analisar uma molécula em qualquer superfície, o impacto da superfície e da sonda na imagem da molécula também tem de ser considerado quando são analisad.......
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Divulgações
Não há interesses financeiros concorrentes ou conflitos de interesse.
Agradecimentos
O programa NSF-MRI (CHE: 1229103) é reconhecido para o financiamento da compra de novos produtos eletrônicos de controle, software, células líquidos e outros equipamentos necessários para montar uma dupla AFM / STM. Reconhecemos as instalações compartilhadas no The University of Chicago programa NSF-MRSEC (DMR-0820054) para obter assistência com a AFM instrumentação, treinamento e criação de imagens e de tempo de instrumentos disponibilizados pela Pesquisa de Materiais de Equipamentos (DMR-0820054). Agradecemos especialmente Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, e Prof Ka Yee Lee para acolher os nossos alunos antes do financiamento da proposta NSF-MRI, que trouxe a inst....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Orgânico | 7647-14-5 | ||
| MgCl2 | Acros dos orgânicos | 7791-18-6 | |
| Tris-HCl | Fisher | ||
| 8 Multimodo 8 | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipado com o controlador do nanoscópio V e |
| a ponta de | Bruker-Nano | SNL-10 do varredor de J, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Modo de rosqueamento Célula de fluido | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grau | SPI fornece | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Disco de suporte de amostra | nanoSurf | BT02236 | |
| placa de Petri | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipetadores | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Preparado de acordo com as referências citadas | ||
| Software | Nanoscope Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | Seringa de 12 mm |
| 1 ml | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf | Denville Scientific | C2171 | |
| O Sistema Gráfico Molecular Pymol v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
Referências
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, Available from: http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (19....
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Reimpressões e permissões
