Artigo de método

Microscopia de Força Atômica da Red-Light fotorreceptores Usando Mapeamento PeakForce Quantitative nanomecânicos Propriedade

DOI:

10.3791/52164

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24 de outubro de 2014

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1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Chemistry, Northeastern Illinois University

Neste artigo

Resumo

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Um método para investigar a estrutura de um fotorreceptor de proteína usando microscopia de força atômica (AFM) é descrito neste artigo. O Mapeamento Quantitativo de Propriedades Nanomecânicas PeakForce (PF-QNM) revela dímeros de proteínas intactos em uma superfície de mica.

Resumo

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Microscopia de força atômica (AFM) usa uma ponta piramidal anexado a um cantilever para sondar a resposta força de uma superfície. Os desvios de ponta pode ser medido para ~ 10 pN por um detector de laser e dividida em sectores, que pode ser convertido em imagem topografia. Modulação de amplitude ou AFM "modo de tocar" envolve a sonda fazer contato intermitente com a superfície, enquanto oscilando em sua freqüência de ressonância para produzir uma imagem. Usado em conjunto com uma célula de fluido, tocando-AFM modo permite a imagiologia de macromoléculas biológicas, tais como proteínas em condições fisiologicamente relevantes. Tocar de modo AFM requer sintonia manual da sonda e ajustes frequentes de uma infinidade de parâmetros de verificação que pode ser um desafio para usuários inexperientes. Para obter imagens de alta qualidade, esses ajustes são mais demoradas.

PeakForce Quantitative nanomecânicos mapeamento da propriedade (PF-QNM) produz uma imagem medindo a respon vigorcurva se para cada ponto de contato com a amostra. Com o software ScanAsyst, PF-QNM pode ser automatizado. Este software ajusta o set-point, a frequência da unidade, taxa de varredura, os ganhos, e outros parâmetros de digitalização importantes automaticamente para uma determinada amostra. Não só este processo de proteger ambas as sondas frágeis e amostras, que reduz significativamente o tempo necessário para obter imagens de alta resolução. PF-QNM é compatível para imagens AFM de fluido; portanto, ele tem uma vasta aplicação para geração de imagens materiais biologicamente relevantes.

O método apresentado neste artigo descreve a aplicação de PF-QNM para obter imagens de uma bacteriana fotorreceptor da luz vermelha, RpBphP3 (P3), a partir da fotossíntese R. palustris no seu estado adaptado luz. Usando este método, os dímeros de proteínas individuais de P3 e agregados de dímeros foram observados sobre uma superfície de mica na presença de um tampão de imagens. Com os ajustes apropriados para a superfície e / ou concentração da solução, este métodopode ser geralmente aplicada a outras macromoléculas biologicamente relevantes e materiais macios.

Introdução

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Microscopia de força atómica (AFM), tornou-se uma ferramenta importante para investigar as propriedades estruturais e mecânicas, de superfícies de filmes finos, e as moléculas individuais desde sua invenção em 1986 (Figura 1). 1-3 Usando uma célula de líquido, o método possui tornam-se particularmente útil em estudos de macromoléculas biológicas e células, mesmo vivendo em um ambiente fisiologicamente relevante. 4-10 Tocar de modo AFM tem sido tradicionalmente usada para imprimir materiais macios ou moléculas frouxamente ligados à superfície, pois o contato de modo AFM é tipicamente inadequada devido para os danos causados ​​pelas forças laterais exercidas sobre a amostra pelo cantilever 11. de modo Tapping AFM reduz substancialmente estas forças por ter a ponta intermitentemente toque na superfície, em vez de estar em contacto constante. Neste modo, o braço de suporte é oscilado na ou perto da sua frequência de ressonância normal à superfície. Da mesma forma para entrar em contato de modo AFM, a topografia é analyzed locando o movimento do piezo-z, como uma função de xy (distância).

A dinâmica cantilever pode ser bastante instável em ou próximo da ressonância; portanto, eles são muito difíceis de automatizar fora de uma situação de "estado estacionário". Especificamente, estas dinâmicas dependem as propriedades da amostra e ambiente de digitalização. Para uma molécula macio adsorvido a um (er) superfície dura, um ciclo de feedback bem afinado para a molécula pode levar a oscilação feedback para a superfície. Operação no líquido complica ainda mais a sintonia do cantilever. Alterações nos níveis de temperatura ou de fluidos exigem reajuste constante de ponto de ajuste, ganhos, e outros parâmetros de imagem. Esses ajustes tendem a ser muito demorado e desafiador para os usuários.

Pico de força quantitativa nanomecânicos mapeamento da propriedade (PF-QNM), como tocar modo AFM, evita interações laterais por forma intermitente contactar a amostra (Figura 2). 12-15 </ Sup> No entanto, PF-QNM opera em modo não-ressonante e freqüências muito mais baixas do que pressionar de modo AFM. Isto elimina os desafios de ajuste de modo tapping-AFM, particularmente aqueles exacerbado pela presença de fluido. Com PF-QNM, as imagens são coletadas, tendo uma curva de resposta de força em todos os pontos de contato. Com a adição do software ScanAsyst, 15 de ajuste dos parâmetros de digitalização pode ser automatizado e uma imagem de alta resolução obtidas em questão de minutos, mesmo por usuários inexperientes. Uma vez que o utilizador se torna mais familiarizados com a AFM, qualquer ou todos os parâmetros automatizadas podem ser desactivado em qualquer altura que permita o experimentalista para aperfeiçoar a qualidade de imagem manualmente. Desde a sua criação, PF-QNM foi aplicada para mapear bacteriorhodopsin, uma proteína de membrana e outras proteínas nativas no nível submolecular 16-18 Para bacteriorhodopsin., Há uma correlação direta entre a flexibilidade da proteína e de raios-X estruturas cristalográficas. 12 PF -qnM tem sido utilizada para investigar as células vivas com alta resolução. 19,20 importantes ligações Além disso, os dados de FP-QNM elucidou entre estrutura e mecânica dentro da membrana dos eritrócitos que são essenciais para a integridade e a função da célula 21.

Nós empregamos microscopia de varredura por sonda (SPM) métodos, incluindo 22 AFM, 23 para estudar a estrutura de fotorreceptores de luz vermelha chamada bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 Eles consistem de um módulo de detecção de luz covalentemente ligados a um módulo de sinalização efetuador tais como histidina quinase (HK) 26. O módulo de luz de detecção normalmente contém um cromóforo bilin que passa por uma transformação estrutural mediante a absorção de um fóton, com uma série de mudanças estruturais que atingem o módulo de sinalização efetuador e levando a uma transformação global de toda a proteína . 24,27-29 Com base nesta transformação, existem duas cadeias leves distintas de absorção sstados de BphPs, uma luz absorvendo estado vermelho e vermelho-extremo, denominado Pr e Pfr. Pr é termicamente estável, o estado de adaptação ao escuro para a maioria dos BphPs. 28 A base molecular da Pr / Pfr fotoconversão não é totalmente compreendido, devido ao conhecimento limitado estrutural dessas proteínas. Com a exceção de uma estrutura de D. radiodurans, 30 todas as estruturas cristalográficas de raio-X publicados destas proteínas são no estado de adaptação ao escuro e carecem de domínio efector. Os BphPs intactos são demasiado grandes para serem eficazmente estudada por Ressonância Magnética Nuclear (RMN), e são difíceis de cristalizar na sua forma intacta (em particular no estado de luz adaptado) para a cristalografia de raios-X. BphPs foram recentemente projetado como marcadores de proteínas fluorescentes infravermelho (IFP). 31 Caracterização estrutural dessas proteínas pode ajudar ainda mais no design IFP eficaz. 32-36

O foco deste artigo é apresentar um procedimento paraimagiologia de BphPs utilizando AFM-célula através do líquido PF-QNM. O método é demonstrado pelos estudos de estado de luz adaptado do RpBphP3 bacteriophytochrome (P3) a partir da bactéria fotossintética R. palustris. O procedimento aqui apresentado é AFM abordagem conveniente e simples para a imagiologia de proteínas, bem como de outras macromoléculas biológicas. Com este método, os detalhes estruturais de moléculas individuais podem ser recolhidas num curto período de tempo, semelhante a um curso de ciência sessão de laboratório de nível superior. Através de medição secções transversais e completando mais análises dimensionais, os dados experimentais pode ser comparado a modelos computacionais úteis 37-42.

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Protocolo

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1 computador e microscópio Configurar

  1. Abrir a válvula de cilindro de N 2 e ajustar os botões para assegurar a tabela de ar é flutuante e nível.
  2. Ligue o computador, controlador e luz de fibra óptica por esta ordem.
  3. Configure o scanner para o modo / LFM AFM e centralizar a câmera sobre a cabeça AFM.
  4. Software aberto. Selecionar categoria experimento "Propriedades nanomecânicos", "Quantitative nanomecânicos Mapping" no grupo experimento, e "PeakForce QNM em Fluid" sob experimento. Clique em Carregar Experiment e depois Setup.
  5. Foque a câmara usando o objetivo Z para ver a superfície do palco. Usando o grosseiro para cima / para baixo piezos mover a fase aproximadamente, 1 mm abaixo da superfície da abertura de cabeça AFM.

2: Preparação de Superfície Mica

  1. Pressione uma etiqueta adesiva para o rosto de um disco limpo suporte da amostra (15 mm de diâmetro, 0,8 mm de espessura). Empurre a mica V-4disco de grau (25 x 25 x 26 mm) sobre o adesivo até firmemente fixada.
  2. Esfregue um pedaço de fita adesiva transparente sobre a mica assegurar que esteja totalmente aderida, sem bolhas de ar. Puxe a fita do mica de um lado para unir-lo uniformemente. Repita se necessário para garantir a mica é plana.
  3. Segure o disco de suporte, com o lado mica limpeza, com um par de pinças circulares (Garras de disco), e coloque no scanner. A mica deve estar abaixo do nível da abertura da cabeça de AFM.

Assembleia celular 3 Fluid and Imaging da Mica Superfície

  1. Lavar a célula de fluido, o O-ring, o adaptador de seringa, o adaptador de mangueira, e o tubo de ejecção, em etanol a 100%. Lavar a célula de fluido em água DI. Vamos todos peças de ar secar completamente.
  2. Empurre o adaptador de mangueira na porta da célula de fluido limpo. Pressione suavemente o anel de vedação no orifício central da célula de fluido usando uma pinça plana cabeças.
  3. Pressione a mola de leve sobre o grampo de retenção da sonda e transformá-lo longe do groove pela dica.
  4. Segure a sonda na extremidade longa distância da ponta com uma pinça chefiadas planas. Colocar a sonda na ranhura com a ponta virada para o centro da célula. Empurre a mola para dentro e ajustar o clipe de retenção sobre a sonda para prendê-lo (Figura 1B).
  5. Verifique se o grampo no AFM para garantir que está totalmente retraída (Figura 1C).
  6. Colocar a célula de fluido, o O-ring e sondar virada para baixo, no topo da amostra de mica. Permitir que a célula de fluido para descansar sobre os pernos da AFM. Diminuir a braçadeira para estabilizar a célula na fase fluida. Pressione o interruptor para baixo sobre o microscópio até a inspecção visual mostra o anel de vedação firmemente comprimida entre o disco de suporte e a célula de fluido.
  7. Enquanto observa o monitor, o foco do botão de ajuste macrométrico para visualizar a parte superior da célula de fluido na tela.
  8. Mova o microscópio até que haja uma clara imagem da ponta usando os X / Y e botões de ajuste do objetivo Z. A dica vai appouvido como, um triângulo dourado metálico. Mover a ponta mais perto da superfície da amostra, utilizando a alavanca de piezo-se no microscópio. Concentre-se na reflexão da ponta. Acompanhe o cantilever real em relação à sua reflexão. Nesta fase, devem ser estreitamente alinhados, mas não completamente sobrepostos.
  9. Conecte o adaptador de seringa a uma estéril seringa de 1 ml. Anexar uma extremidade do tubo de ejecção para o adaptador de seringa e colocar a outra extremidade do tubo no recipiente de solução tampão. Estenda completamente o êmbolo da seringa.
  10. Prenda a mangueira no adaptador de mangueira na célula de fluido. Pressione suavemente o êmbolo até que o fluido preenche plenamente a câmara central. Verifique o celular para garantir que não haja bolhas de ar. Verifique para ver que não há fluido derramando-se a partir da célula de fluido para o microscópio. Colocar a seringa sobre um suporte sólido levantada.
  11. Utilize a alimentação da câmera e os X / Y botões de tradução para localizar o laser na tela (um ponto vermelho difuso). Utilizando o laser de movbotões de controle ent, mova o laser na ponta.
  12. Ajustar finamente os controlos de laser e de espelho, até o sinal soma mostrado na microscópio é maximizada (valor = 4-6).
  13. Ajustar o ângulo do díodo quadrante usando os botões do lado esquerdo traseiro e o lado superior esquerdo da cabeça de leitura para reduzir os desvios verticais e horizontais mostradas no microscópio tão próximo de zero quanto possível (± 0,1).
  14. No software, selecione opções de aquisição. No mínimo, selecione altura (traço e retraço), erro força máxima e deformação. As outras opções são dependentes do usuário e pode ser adaptado com base na informação específica desejada pelo experimentalista.
  15. Selecione "linha" para RT Plane Fit em cada janela de aquisição. Selecione "none" para o OT Plane Fit nas janelas de altura. Defina o X e Y offset e ângulo de leitura para zero, se não tiver feito.
  16. Definir a taxa de varredura de 1 Hz, a amostra por linha 256, o controle automático ScanAsystpara indivíduo, eo limite de auto Z ScanAsyst para fora. Alterar o limite de Z a 500 nm. Defina o tamanho da digitalização para 1 mícron.
  17. Clique envolver. Neste ponto, a ponta se aproxima da superfície. Enquanto a ponta se aproxima, observar Z variação de tensão piezo no canto inferior esquerdo da tela. Se a dica vai para fora da faixa, retirar a ponta e re-aproximação. Se isso não for bem sucedida, a ponta pode precisar ser alterado, a fim de ter uma abordagem bem-sucedida. Uma vez que a ponta está envolvida, as linhas vão começar a aparecer em cada uma das janelas de aquisição que irão compor uma imagem.
  18. Tire fotos de mica em 1 x 1 mícron e zoom lentamente para garantir que a superfície de mica é limpo e liso. Clique captura contínua para salvar as imagens em que aparecem. Zoom e movimentar-se na superfície como desejado.

4. deposição de proteína e Preparação de Amostra for Imaging

  1. Obter amostra de proteína purificada 38 e manter em gelo. Se armazenado em um freezer, descongelar amostra emgelo durante 5 min.
  2. Dilui-se a proteína a 0,0010 mg / ml de solução tampão de imagiologia utilizando refrigerado. O tampão de imagiologia usado aqui é 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), NaCl 150 mM, e MgCl2 15 mM.
  3. Encha uma câmara 4 (100 x 15 mm) Placa de Petri com solução tampão de imagem refrigerado. Encher cada câmara, com pelo menos 5 ml de solução. Misturar suavemente a solução de proteína diluída com a ponta ligada a micropipeta.
  4. Aplicar 200 l da solução de proteína diluída até a superfície de mica já preparado. Depois de 30 segundos, pegar superfície da proteína / mica com a pinça circulares (Garras de disco). Manter a amostra paralela à bancada do laboratório.
  5. Enquanto mantém a amostra, mergulhar imediatamente a amostra na solução tampão continha no primeiro quadrante da placa de Petri (passo 4.2), assegurando que a amostra é paralela à bacia da placa de Petri. Depois de 1 seg, retire a amostra.
  6. Continuando a manter a amostra paralela à baciada placa de Petri, repita o passo 4.5 para os outros três quadrantes.
  7. Coloque o disco em um pano de pó seco para absorver o excesso de umidade e transferir o disco para o palco do microscópio. Não toque na superfície real com o pano. Não permitir que a secagem da amostra.
  8. Repita os passos de 3,6-3,16.

5. de imagem Proteínas sobre mica

  1. Clique na caixa de seleção de parâmetros no lado esquerdo da tela. Tamanho da Primavera e raio da ponta deve ser definido com base na ponta que está sendo usado.
  2. Clique envolver. Da mesma forma que o processo de imagem mica (passo 3.17), observe a janela z-piezo como as abordagens de ponta.
  3. Permite que o scanner a imagem da mesma área há pelo menos dois passes consecutivos. Clique captura contínua para salvar cada imagem coletada.
  4. Mova o scanner para uma nova região e / ou alterar o tamanho da imagem conforme desejado.
  5. Depois que o software automatizado terminar de ajustar oparâmetros de digitalização para um determinado tamanho, rode o software fora.
  6. Ajustar manualmente velocidade de varrimento, z limite, o número de linhas, e tensão, a fim de afinar a focagem da imagem. Se a imagem fica muito fora de foco, gire software de volta para retornar a posição inicial. Para aumentar a resolução de uma imagem enquanto o zoom em uma proteína, diminua a velocidade de varredura e aumentar o número de linhas proporcionalmente.
  7. Após a experiência, limpar a célula-líquido com etanol a 100% e lavar com H 2 O. DI Permitir que o líquido celular para secar completamente.
  8. Abra o software de dados para processar imagens de dados brutos. Primeiro, achatar a imagem, clicando no ícone achatar. Selecione Zero ª ordem e clique em executar. Dependendo da imagem, de um plano de ajuste pode ser necessário para obter uma imagem de plano. Neste caso, selecione o ícone em forma de avião e desenhar um plano de uma área plana da imagem, usando o cursor. Clique executar. Repita conforme necessário
  9. Select o separador de secção transversal para medir as dimensões da proteína. Desenhar uma linha com o cursor mover-se-o ao longo da molécula ou à área a ser analisada. Repita o procedimento para várias áreas eo software irá gerar uma sobreposição. Exportar a imagem ou os dados utilizados para gerar imagem em um formato compatível com outros programas de software e de desenho.

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Resultados

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Imagens AFM representativos de uma proteína de fotorreceptores, P3, no seu estado adaptado-luz são apresentados nas Figuras 3 e 4. Um substrato de mica clivada de fresco, (Figura 3A) é uma superfície adequada, plana para a adsorção de proteínas. Recolha de uma imagem de mica limpo como um controlo negativo é importante por várias razões. Em primeiro lugar, ele garante a célula líquido é limpo e sem materiais residuais de experimentos anteriores irá contaminar a superfíc...

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Discussão

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AFM é um método de microscopia de sonda de varrimento totalmente capazes de fornecer imagens de proteínas e outras macromoléculas biológicas em condições fisiologicamente relevantes. Em comparação com a cristalografia de raios-X e RMN, uma limitação da AFM é a sua incapacidade para alcançar a mesma resolução, particularmente resolução lateral. Quando utilizando AFM para analisar uma molécula em qualquer superfície, o impacto da superfície e da sonda na imagem da molécula também tem de ser considerado quando são analisad...

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Divulgações

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Não há interesses financeiros concorrentes ou conflitos de interesse.

Agradecimentos

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O programa NSF-MRI (CHE: 1229103) é reconhecido para o financiamento da compra de novos produtos eletrônicos de controle, software, células líquidos e outros equipamentos necessários para montar uma dupla AFM / STM. Reconhecemos as instalações compartilhadas no The University of Chicago programa NSF-MRSEC (DMR-0820054) para obter assistência com a AFM instrumentação, treinamento e criação de imagens e de tempo de instrumentos disponibilizados pela Pesquisa de Materiais de Equipamentos (DMR-0820054). Agradecemos especialmente Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, e Prof Ka Yee Lee para acolher os nossos alunos antes do financiamento da proposta NSF-MRI, que trouxe a instrumentação necessária para o nosso campus. Reconhecemos o financiamento de uma bolsa Título III STEM (ID: P031C110157) atribuído à Northeastern Illinois University, que ofereceu remuneração de pesquisa de verão para alunos e professores, bem como suporte para produtos de consumo. Finalmente, reconhecemos Bruker-Nano, Inc. para suporte instrumental continuou e permissão para reproduce um gráfico que mostra o mecanismo de PeakForce QNM e para utilizar a palavra ScanAsyst para descrever o software automatizado.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Orgânico7647-14-5
MgCl2Acros dos orgânicos7791-18-6
Tris-HClFisher
8 Multimodo 8Bruker-Nano492-008-011equipado com o controlador do nanoscópio V e
a ponta deBruker-NanoSNL-10 do varredor de J, ScanAsyst-Fluid+
Modo de rosqueamento Célula de fluidoBruker-NanoMTFML
Mica V-4 GrauSPI fornece115050325 x 25 x .26 mm
Disco de suporte de amostrananoSurfBT02236
placa de PetriPlasta-Medic, Inc.100 mm x 15 mm 
micropipetadoresDenville ScientificXL 3000i
RpBphP3Preparado de acordo com as referências citadas
SoftwareNanoscope Bruker-Nano
Fiber Optic LightDigital Instruments Inc.F0-50
Pelco AFM Disc GripperTed Pella Inc1668Seringa de 12 mm
1 mlMcKesson102-ST1C
EppendorfDenville ScientificC2171
O Sistema Gráfico Molecular Pymol v.1.5.0.1Schrodinger, LLC
científico de prova tubos

Referências

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