Isolamento e excisão de Murino Aorta; A técnica versátil no Estudo de Doenças Cardiovasculares

Resumo

A patologia da aorta pode levar a morbidade e mortalidade graves, portanto, a pesquisa da progressão da doença e possíveis terapias é necessária. Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e extirpar a aorta murina para auxiliar os pesquisadores na investigação de doenças cardiovasculares.

Resumo

Doença cardiovascular é um termo amplo que descreve doenças do coração e/ou vasos sanguíneos. O principal vaso sanguíneo que fornece sangue oxigenado ao corpo é a aorta. A aorta pode ser afetada em doenças como aterosclerose e aneurisma. Os pesquisadores que investigam essas doenças se beneficiariam da observação direta da aorta para caracterizar a progressão da doença, bem como para avaliar a eficácia de possíveis terapêuticas. O objetivo deste protocolo é descrever o isolamento e a excisão adequados da aorta para auxiliar os investigadores na pesquisa de doenças cardiovasculares. O isolamento e a excisão da aorta permitem que os investigadores observem as alterações morfométricas macroscópicas, além de preservar e corar o tecido para observar as alterações histológicas, se desejado. A aorta pode ser usada para estudos moleculares para avaliar a expressão de proteínas e genes para descobrir alvos de interesse e mecanismos de ação. Essa técnica é superior às modalidades de imagem, pois têm limitações inerentes à tecnologia e ao custo. Além disso, células isoladas primárias de uma aorta recém-isolada e excisada podem permitir que os pesquisadores realizem mais ensaios in situ e in vitro. O isolamento e excisão da aorta tem a limitação de ter que sacrificar o animal, porém, neste caso os benefícios superam os malefícios, pois é a técnica mais versátil no estudo da doença aórtica.

Introdução

A aorta desempenha um papel crucial na função cardiovascular fornecendo o corpo com sangue oxigenado e outros semelhantes para partes do corpo, é susceptível à doença. Doenças da aorta comuns incluem aterosclerose e aneurisma, que são o resultado de fatores genéticos e ambientais, incluindo dieta, tabagismo e sedentarismo ^1. A aterosclerose é a deposição de cálcio e uma placa à base de lípidos para a parede da aorta, tipicamente encontrados em pacientes com hiperlipidemia crónica ^2. Os aneurismas são caracterizadas por degradação de componentes estruturais da aorta e adelgaçamento da parede do vaso, seguido por um aumento do diâmetro que poderia levar à ruptura ^3.

Os modelos animais são importantes instrumentos para estudar o mecanismo da doença e da eficácia de tratamentos potenciais. Modelos animais comuns utilizados na investigação cardiovascular, pesquisar especificamente investigar distúrbios vasculares e metabólicosincluem camundongos geneticamente modificados para alterar os níveis de lipídios, como knockout gene apolipoproteína E e lipoproteína de baixa densidade camundongos knockout gene receptor ^4. A maioria dos métodos para avaliar os mecanismos de doenças e a eficácia da terapia incluem o isolamento e a excisão da aorta.

Uma vez que a aorta é localizado e isolado, a análise morfométrica pode ser determinada, tal como a presença de aneurisma, tipicamente definido como um aumento superior a 50% no diâmetro de ^5. Depois necessário análise in situ é completa, a aorta pode ser excisado para análise posterior. Um aorta pode ser excisado flash congelados para conduzir estudos moleculares, tais como proteínas e / ou ensaios de expressão de gene ou fixo utilizando 4% de paraformaldeído e depois incorporado, seccionados e corados para análise histológica. A análise histológica da aorta pode demonstrar características comuns de doenças da aorta, como a degradação estrutural, a formação de placa, e infiltração de leucócitos ^{6,7. Além disso, uma aorta excisado pode ser utilizado para isolar as linhas de células primárias, incluindo células do músculo liso e endoteliais que podem posteriormente ser utilizados para uma variedade de estudos in vitro 7.}

Atualmente, não existem outros métodos para fornecer essa caracterização aprofundada das doenças da aorta, bem como fornecer aos pesquisadores ferramentas para estudar mais a doença cardiovascular. Modalidades de imagem, como ressonância magnética, tomografia computadorizada e ultra-sonografia são os métodos mais próximos para avaliar morfologicamente a aorta, no entanto isso é difícil em pequenos animais e na obtenção de um dispositivo com tecnologia adequada é caro ^8. As linhas celulares imortalizadas pode ser comprado a investigar potenciais mecanismos da doença e da eficácia de terapias, no entanto, a natureza artificial destas células são limitantes no estudo dos efeitos sobre o ciclo de vida celular e apoptose ^9.

O objetivo geral doeste manuscrito é demonstrar a excisão e isolamento estéril da aorta de murino para a investigação de doenças cardiovasculares.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados com a aprovação do Cuidado e Uso Comitê da Universidade de Cincinnati animal Institucional e de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revista em 1996).

1. Preparar o mouse

1. Eutanásia por exposição do animal a uma dose supraterapêutica de anestésico, isoflurano inalado para o efeito. Verifique eutanásia principal via toe pitada como um estímulo nocivo. Método secundário da eutanásia, o corte de diafragma, irá ocorrer em uma próxima etapa. Métodos alternativos podem ser concedidos a eutanásia utilizado é obtido.
2. Sanitizie a superfície externa do rato por pulverização da pele ao longo da região abdominal, onde serão feitas as reduções iniciais, com etanol a 70% para o ponto de humidade de modo a que a pele é molhado com etanol e todos os cabelos secos soltas / não entram a região.
3. Coloque o mouse em uma surplaca cirúrgica em decúbito dorsal, com apêndices superiores e inferiores estendidos para fora.
4. Apêndices seguros ao Conselho, utilizando fita cirúrgica.

2. Isolamento do Coração e Aorta

1. Após o posicionamento adequado do mouse, utilize uma pinça para localizar e isolar a pele abdominal inferior apenas ao processo xifóide do esterno.
2. Criar tensão levantando a pele para cima e usar uma tesoura para remover a pele superficial, expondo a porção superior do peritônio e porção inferior da cavidade torácica.
3. Entrar na cavidade peritoneal, levantando o apêndice xifóide e fazer incisões laterais apenas inferior ao processo ao longo das margens subcostal.
4. Dissecar-se para dentro da cavidade torácica, passando pelo diafragma, sendo certo não lacerar o coração ou qualquer um dos principais vasos sanguíneos.
5. Estenda as incisões laterais feitas na etapa 2.3 cranial para remover a porção anterior da caixa torácica. Senecessário, libertar o coração da parede anterior do tórax usando dissecção romba.
6. Limpe a caixa torácica do sangue alheio e fluido, utilizando gaze estéril para absorver material. Uma vez que a área é mais visível, remoção dos pulmões para expor melhor o coração e aorta.

3. Perfusão de Coração e Aorta

NOTA: Para obter o sangue através de punção cardíaca, fazê-lo imediatamente antes desta etapa.

1. Encher uma seringa de 10 cc com 10 ml de gelo estéril solução tampão de fosfato frio 1x (PBS), e anexar uma agulha de calibre 25 para a seringa.
2. Inserir a agulha suavemente para o ventrículo esquerdo do coração.
3. Corte o átrio direito para aliviar o acúmulo de pressão de perfusão. Perfundir os conteúdos da seringa para dentro do rato de 2 - 3 minutos.
4. Use gaze estéril na abertura no átrio direito para absorver líquido de perfusão.

4. Isolamento e Excisão da Aorta

1. Após a conclusão da perfusion, utilizar gaze estéril para absorver qualquer fluido remanescente turvação do campo de visão dentro da cavidade torácica.
2. Expor os conteúdos gastrointestinais caudalmente cortando através da parede abdominal, que se estende da incisão para a região suprapúbica. Estender a incisão mais para os membros inferiores bilateralmente para criar retalhos de pele, que pode ser fixado para baixo ou excisadas.
3. Retire os lobos do fígado, pâncreas, estômago, baço e intestino para visualizar melhor a aorta. Tome cuidado ao dissecar perto da região perirrenal, como a aorta é superficial com os ramos das artérias renais.
   NOTA: Execute esta etapa em um preciso e matricular forma como o trato gastrointestinal é rica em bactérias, o que aumenta a propensão para a contaminação.
4. Lavar a área com 1x PBS e remover todo o fluido por absorção com uma gaze estéril.
5. Usando microtesouras e micropinças estéreis, separe a aorta do dorsal da coluna e do esôfago ventrally.É melhor utilizar a dissecção romba e utilizando um microscópio de dissecção para este.
   NOTA: Ao isolar a aorta, iniciar caudalmente na bifurcação ilíaca e mover-se cranialmente limpeza e separação da aorta a partir da superfície dorsal da cavidade cranial ou iniciar as carótidas e braquiocefálicos dissecação caudalmente. Qualquer método é apropriado e é até o conforto pesquisadores.
6. Remover o tecido adiposo perivascular usando microtesouras finas sendo certo não para remover uma porção da parede da aorta. Isto é essencial para minimizar o potencial de contaminação por fibroblastos quando a cultura de células musculares lisas da aorta.

Resultados

Após a conclusão do processo, haverá uma aorta intacta proveniente do coração, descendo para as cavidades torácica e abdominal, com as artérias renais ainda ligado (Figura 1A). A partir daqui, a aorta pode ser visualizado in situ para quantificar as alterações morfométricas que são de diagnóstico no estudo de aneurismas da aorta abdominal (Figura 1B e 1C). Subsequentemente, a aorta pode ser removidas, fixadas e coradas para olhar para mudanças histológicas. A m...

Discussão

A doença aórtica pode levar a patologia sistêmica significativa e possivelmente morte em casos graves. As opções de tratamento são atualmente limitadas, portanto, é necessária a continuação da pesquisa na área¹⁰. Os modelos murinos são ideais para estudar mais a progressão da doença e as opções potencialmente terapêuticas⁴. Portanto, a conclusão bem-sucedida do método descrito neste manuscrito fornecerá aos investigadores as ferramentas para medir a progressão da doença e a eficácia do medicamento. ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Isoflurano	Med-Vet International	#RXISO-250
70% etanol	Fisher	07-678-001
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Fita cirúrgica	3M	1527-1
Gaze estéril	Dukal Corporations	1312
Agulha de calibre	25 BD
seringa de 10 ml	BD	309604