Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra

Resumo

Aqui descrevemos um ensaio simples para a quantificação da resposta alimentar em hidra induzida pela forma reduzida de glutationa. Este ensaio baseia-se na medição da distância entre a extremidade apical do tentáculo e a boca da hidra.

Resumo

Hydra está entre os organismos mais primitivos que possuem um sistema nervoso e quimiossensação para detectar glutationa reduzida (GSH) para capturar a presa. O movimento dos organismos presas causa descarga mecanossensorial das células urticantes chamadas nematocistos da hidra, que são inseridas na presa. A resposta alimentar na hidra, que inclui o enrolamento dos tentáculos para trazer a presa em direção à boca, abertura da boca e consequente engolfamento da presa, é desencadeada pelo GSH presente no fluido liberado da presa ferida. Para poder identificar o mecanismo molecular da resposta alimentar em hidra que é desconhecido até o momento, é necessário estabelecer um ensaio para medir a resposta alimentar. Aqui, descrevemos um método simples para a quantificação da resposta alimentar no qual a distância entre a extremidade apical do tentáculo e a boca da hidra é medida e a razão dessa distância antes e depois da adição de GSH é determinada. Descobriu-se que a proporção, chamada de propagação relativa dos tentáculos, fornece uma medida da resposta alimentar. Este ensaio foi validado usando um modelo de fome no qual a hidra faminta mostra uma resposta alimentar aprimorada em comparação com a hidra alimentada diariamente.

Introdução

Hydra é o organismo mais primitivo que possui um sistema nervoso e quimiossensação para detectar glutationa reduzida (GSH) para capturar a presa¹. Alimenta-se de uma variedade de animais, como nematóides, crustáceos, larvas de insetos, girinos e peixes recém-nascidos¹. O movimento desses organismos de presa causa descarga mecanossensorial das cápsulas urticantes chamadas nematocistos da hidra, que são inseridas na presa². O GSH presente no fluido liberado da presa ferida subsequentemente ativa a resposta alimentar na hidra, que inclui o enrolamento dos tentáculos para trazer a presa em direção à boca, abertura da boca e consequente engolfamento da presa. Várias moléculas, como dopamina³, glutamato⁴, GABA, glicina⁵, receptores NMDA⁶ e alatotropina⁷, demonstraram estar envolvidas na resposta alimentar na hidra. Também foi demonstrado que a resposta quimiossensorial induzida pelo GSH é modulada pelo estado alimentar do animal, de modo que a hidra faminta exibiu uma resposta alimentar aprimorada¹. Esse aumento na sensibilidade do GSH é biologicamente relevante, uma vez que, sob a fome, a hidra precisa encontrar sua presa com maior sensibilidade.

Embora a resposta alimentar induzida pelo GSH possa ser claramente observada ao microscópio, os métodos normalmente usados para medir as observações da resposta alimentar não são quantitativos. Na maioria dos casos, o tempo durante o qual a boca da hidra permanece aberta foi tomado como medida da resposta alimentar^8,9; enquanto em outro caso, a quantificação foi baseada no número de hidras de uma população mostrando a resposta alimentar¹⁰. No entanto, observar o tempo de abertura da boca dos pólipos da hidra é complicado e sujeito a variações induzidas por parâmetros incontroláveis, como a direção da orientação da boca durante as observações. Da mesma forma, como a resposta alimentar é um parâmetro quantitativo, as abordagens de base populacional estão sujeitas a variações/erros causados pela opinião ou viés observacional do observador individual. Para contornar esses problemas, desenvolvemos um método para a quantificação relativa da resposta alimentar em hidra (Hydra vulgaris Ind-Pune¹¹) com base na distância da extremidade apical do tentáculo da boca do pólipo da hidra.

Protocolo

1. Hydra Cultura e medição da resposta Alimentação

1. Manter pólipos hidra em cultura, alimentando-os com diária de artemia e mantendo-os num meio (tampão de 1 mM Tris-HCl, pH 7,6, NaCl a 1 mM, CaCl2 1 _mM, KCl 0,1 mM, e 0,1 mM de _MgSO4) contida em um tigela de vidro a 18 ° C sob ciclos escuros hr de luz 12 12 h, como descrito anteriormente ^12.
2. Para a medição da resposta de alimentação, transferir um pólipo amadurecer hidra tendo 5 a 6 tentáculos para um único poço de uma placa de 24 poços. Retirar o meio residual do bem, inclinando-lo, e em seguida, adicione imediatamente 500 mL de meio fresco.
3. Preparar a solução de glutationa 9 uM em meio de hidra. Uma vez que a solução de glutationa é propenso a oxidação, usar sempre a glutationa solução preparada de fresco para cada experiência.
4. Transferir a placa para a plataforma de imagem de um microscópio tendo disposições para a gravação da imagem. Usar um fundo escuro de tal modo que o comportamentof pólipo hidra pode ser claramente fotografada contra o fundo contrastante.
5. A sala utilizada para a observação e imagem do comportamento de hidra livre de luzes de intensidade flutuante, correntes de ar e de ruído. Tais perturbações podem também fazer com que o pólipo hidra para mostrar a contracção dos tentáculos - mesmo na ausência de glutationa.
6. Permitir que o pólipo para relaxar por 5 min.
7. Certifique-se de que o pólipo está localizado ao longo da região central da cavidade de tal modo que o comportamento pode ser trabalhada de forma clara. Se o pólipo está na borda do poço, trazê-la para o centro, através de lavagem do meio utilizando uma pipeta e novamente permitir que ele relaxe.
8. Capturar uma imagem da hidra no estado relaxado. Este será o ponto de observação de tempo zero.
9. Rapidamente adicionar 9 uM solução glutationa para alcançar uma concentração final de 3 uM no poço. Dependendo da finalidade da experiência e a resposta mostrada por hidra, testar uma gama de diferentes concentrações de glutationa e Chooif a concentração adequada e necessária.
10. Inicie o cronômetro imediatamente após a adição de solução de glutationa e capturar imagens após cada 15-30 seg para 4-5 min. Não altere as configurações de ampliação durante a imagiologia de lapso de tempo.
11. Adicionar a solução de glutationa suavemente e com um fluxo uniforme de tal modo que a posição do animal no poço seria minimamente perturbado no campo de visão do microscópio. No entanto, se o pólipo se move extensivamente após a adição de solução de glutationa, mover a placa muito suavemente para trazer o pólipo no campo de visão para a captura de imagem.
12. No experimento de controle, use meio sem glutationa, mantendo todos os outros parâmetros idênticos.
13. Certifique-se de executar todas as etapas experimentais acima durante a primeira metade do dia - antes de 13:00 para evitar o possível efeito do ritmo circadiano sobre a extensão da resposta de alimentação.
14. Abra cada uma das imagens capturadas usando o GNU Image Manipulation Program (GIMP). Use a ferramenta "Medida", disponível a partir de Menu> Ferramentas> Medida para determinar a distância entre a extremidade apical de cada um dos tentáculos e hypostome. Se a abertura boca é observado em qualquer uma das imagens, determinar a distância entre o centro da boca aberta e a extremidade apical do tentáculo. Consulte a esta distância como a propagação tentáculo.
15. Calcule o spread médio tentáculo para cada pólipo antes e depois da exposição a glutationa. Calcular a proporção de spread médio tentáculo no ponto de tempo zero para que em cada um dos pontos de tempo subsequentes. Esta relação será chamado propagação tentáculo relativa.
16. Repita as medições por pelo menos 20 pólipos.

2. método de validação usando oA fome Modelo

1. Para a fome, transferir alguns pólipos Hydra para uma tigela de vidro separada e não alimentá-los durante 5 dias. Alimente o grupo de alguns pólipos controle diário com artemia em uma tigela de tamanho similar. Mudar o meio de tanto experimental taças diariamente para evitar crescimento de fungos no meio.
2. No dia do experimento, alimentar o grupo de controle hidra com artemia por 1 hr e usá-los hidra para os experimentos posteriores após a remoção de todos artemia não consumidos e mortos a partir do meio.
3. Meça a resposta de alimentação da hidra fome em comparação com a hidra do grupo de controle pelo método descrito anteriormente na etapa 1. Para evitar qualquer viés devido ao tempo de observação, alternar as medidas de cada da fome e controlar pólipos hidra.

Resultados

A glutationa faz com que a hidra exibem ondulação dos tentáculos para a boca com a finalidade de engolindo a presa. Essa ondulação de tentáculos traz extremidades apicais dos tentáculos mais perto do hypostome. Isto resulta na redução da propagação tentáculo, ou a distância linear entre a extremidade apical do tentáculo e hipostoma (Figura 1). A propagação tentáculo parente, ou a proporção de tentáculo média espalhar antes e após a adição de glutationa, em média em vários pólipos reduz ao longo do tempo...

Discussão

Comportamento alimentar em hidra representa um dos sistemas de quimio mais ancestrais dos metazoários. Embora a presença de GSH no fluido crustáceo libertado após assistida-nematocyst captura de presa foi detectada há muito tempo ^1, nem a proteína GSHR nem o gene que codifica putativo / s têm sido caracterizadas a partir da hidra até à data. Poucas tentativas têm sido feitas para caracterizar as proteínas de ligação a GSH na hidra ^{8, 14, 15.} No entanto, a identidade destas proteínas receptoras puta...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Incubadora Refrigerada	Panasonic	Microscópio MIR-254-PE
	Leica	S8AP0
Câmera para microscópio	Leica	EC3
Glutationa reduzida	Sigma	G4251	Armazenado a 4 °C. Leve o frasco à temperatura ambiente antes de abrir para evitar oxidação
Programa de edição de imagem	GIMP	Versão 2.8