Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para quantificar a fagocitose de partículas fluorescentes por linhagem celular de macrófagos aderentes usando um método fluorométrico. Este método facilita uma quantificação de alto rendimento da internalização de partículas, bem como a polimerização de actina resultante.

Resumo

O objectivo da análise fluorométrico é para servir como um custo eficaz, eficiente método de transferência, a análise de alta fagocitose e outros processos celulares. Esta técnica pode ser usada em uma variedade de tipos de células, tanto aderentes e não aderentes, para analisar uma variedade de propriedades celulares. Ao estudar a fagocitose, a técnica utiliza fluorométrico tipos de células fagocíticas, tais como macrófagos, e partículas opsonizadas marcados com fluorescência cuja fluorescência pode ser extinto na presença de azul de tripano. Após plaqueamento de macrófagos aderentes em placas de 96 poços, as partículas fluorescentes (verde ou vermelha) são administrados e células são deixadas a fagocitose por montantes variados de tempo. Após internalização de partículas fluorescentes, as células são lavadas com azul de tripano, a qual facilita a extinção do sinal de fluorescência a partir de bactérias que não são internalizadas, ou são apenas aderem à superfície da célula. Após a lavagem de tripano, as células são lavadas com PBS, fixadas, umand coradas com DAPI (marcador fluorescente azul nuclear), que serve para etiquetar os núcleos de células. Por uma quantificação fluorometric simples através de leitura de placas de nuclear (azul) ou partícula (verde / azul) fluorescência podemos examinar a proporção de unidades de fluorescência relativa de verde: azul e determinar um índice fagocitário indicativo de quantidade de bactérias fluorescentes internalizadas por célula. A duração do ensaio utilizando um método e multicanal 96 poços pipetas para a lavagem, a partir da extremidade de fagocitose ao fim de aquisição de dados, é inferior a 45 min. A citometria de fluxo pode ser usado de uma maneira semelhante mas a vantagem de fluorometria é o seu elevado rendimento, o método de avaliação rápida com o mínimo de manipulação de amostras rápida e quantificação da intensidade de fluorescência por célula. Estratégias similares podem ser aplicados para as células não aderentes, as bactérias marcadas vivo, a polimerização da actina, e essencialmente qualquer processo utilizando fluorescência. Portanto, fluorometria é um método promissor para o seu baixo custo, alta throughpcapacidades ut no estudo de processos celulares.

Introdução

Quantificação do sinal fluorescente tem sido amplamente utilizado em uma infinidade de métodos científicos que vão de PCR, citometria de fluxo, microscopia confocal, e se aflige análise multiplex ELISA. Imagens de fluorescência e quantificação tem uma ampla aplicação e pode ser uma ótima ferramenta para análise quantitativa de vários processos celulares. A utilização de marcadores fluorescentes e o seu sinal foi revolucionada na última década, e aparecimento de leitores de placas fluorescentes facilitou a elevada taxa de transferência de quantificação de fluorescência emitida durante processos celulares.

Análise Fluorometric pode servir c....

Protocolo

NOTA: Este protocolo pode ser utilizado para várias aplicações, tais como a quantificação de fagocitose e actina de polimerização tal como utilizado no nosso trabalho previamente publicado ^12. O protocolo presta-se a uma variedade de modificações, e tipos Tabela 1 apresenta a lista de células e partículas utilizado com sucesso em estudos anteriores. Uso padrão deste protocolo para a quantificação de fagocitose ou actina polimerização é ilustrado no diagrama 1.

Resultados

Duas formas principais de quantificar a fagocitose e a subsequente polimerização da actina, através da utilização deste protocolo é de observar fagocitose contínua ou sincronizada.

A análise microscópica (Figura 1B) ilustra imagens fluorescentes comparáveis ​​ao que o fluorometer está gravando (veja também o Diagrama 1). Na Figura 1B são fluorescência vermelha de actina, verde 268 fluorescência de FITC etiquetas HKOP E. coli, mancha.......

Discussão

As principais limitações da técnica são fluorométrico de variação experimental, bem como a perda de células associadas com a lavagem e a utilização de células não-aderentes extensa.

A variação é observada em grande parte devido à variação em partículas fluorescentes como pesagem e pipetagem durante a preparação da solução não é uma maneira exata de manutenção de números idênticos de partículas de experiência para experiência. Para resolver o problema da variação entre experiências, os dados .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 μ m Fluorescentes amarelo-esverdeadas Fluo-Spheres;	Sondas Moleculares	F8852	combinam 50μ l com 50μ l opsonizing reagente por 30 min a 37oC antes do uso
Calor matou E. coli BioParticles fluoresceína conjugado	Sondas Moleculares	E2861	reconstituem (5 mg) em 50 μ l de PBS e combinar com 50 μ l opsonizando reagente por 30 min a 37 & C antes do uso
Reagente de opsonização	Sondas moleculares	E2870
Rodamina faloidina	Sondas moleculares	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan blue	Gibco	15250-061
Os itens abaixo estão disponíveis em várias marcas, mas os itens que usamos neste estudo são dos seguintes fabricantes:
Meio de crescimento celular RPMI	Gibco		Suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina; quente em 37 ° C antes do uso
Leitor de placas fluorescentes - Fluostar Omega	BMG Labtech
Paraformaldeído (16%)	Fischer Scientific	AA433689M	diluir a 4% antes do uso
Placas de 96 poços	Greiner	655097	placas transparentes ou pretas ou transparentes Pipeta
multicanal (8 - 12 canais)
Reservatórios de
1x tubos PBS
Microfuge (0,6 ml)
Conículos (10 ml)

reagentes