Baseada em imagem Técnica de Citometria de Fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos In Vitro

Summary

Este método demonstra uma técnica para avaliar a função dos granulócitos medindo simultaneamente a fagocitose de bactérias e a explosão oxidativa. A citometria de fluxo baseada em imagem permitiu a identificação de três subconjuntos distintos de granulócitos ativados que diferiam em sua capacidade funcional relativa.

Abstract

Os granulócitos desempenham um papel fundamental na resposta imune inata do corpo a infecções bacterianas e virais. Embora existam métodos para medir a função dos granulócitos, em geral eles são limitados em termos das informações que podem fornecer. Por exemplo, a maioria dos ensaios existentes fornece apenas uma porcentagem de quantos granulócitos são ativados após uma única incubação de comprimento fixo. Para complicar as coisas, a maioria dos ensaios se concentra em apenas um aspecto da função devido a limitações na tecnologia de detecção. Este relato demonstra uma técnica para medição simultânea de fagocitose de granulócitos de bactérias e explosão oxidativa. Ao medir essas duas funções ao mesmo tempo, três fenótipos únicos de granulócitos ativados foram identificados: 1) Baixa Ativação (fagocitose mínima, sem explosão oxidativa), 2) Ativação Moderada (fagocitose moderada, alguma explosão oxidativa, mas sem co-localização dos dois eventos funcionais) e 3) Alta Ativação (alta fagocitose, alta explosão oxidativa, co-localização de fagocitose e explosão oxidativa). Uma quarta população que consistia em granulócitos inativados também foi identificada. Usando incubações de ensaio de 10, 20 e 40 minutos, o efeito da duração da incubação do ensaio na redistribuição dos fenótipos de granulócitos ativados foi avaliado. Uma quarta incubação foi concluída no gelo como controle. Usando incubações em tempo serial, o ensaio pode ser capaz de detectar como um tratamento afeta espacialmente a função dos granulócitos. Todas as amostras foram medidas usando um citômetro de fluxo baseado em imagem equipado com uma opção de imagem quantitativa (QI), amostrador automático e vários lasers (488, 642 e 785 nm).

Introduction

Granulócitos representam um componente de sistema imune inata do corpo, o que proporciona a primeira linha de defesa contra antigénios invasores. Os métodos anteriores para avaliar a função de granulócitos focado em capacidade de fagocitose ou burst oxidativo utilizando métodos diferentes, o que torna difícil determinar coletivamente como granulócitos mudaram ^1-4. Os avanços no campo da citometria de fluxo ter resultado na produção de instrumentos de bancada capazes de alta-resolução, de imagens multi-cor das células de uma forma de alto rendimento ^5. A capacidade de combinar imagens com o fluxo tradicional representa citometria de um avanço que fornece a plataforma tecnológica necessária para inovar dentro de citometria de fluxo existente métodos e extrair novas informações sobre o sistema imunológico.

Ao longo dos últimos dez anos, o nosso laboratório, entre outros, tem sido intensamente focada sobre o efeito de vários tratamentos patte nutricional e exercíciorns sobre a função imunológica inata ^6-9. O método demonstrado neste manuscrito tem implicações práticas no campo da imunologia clínica. O presente método aproveita o poder da citometria de fluxo baseado em imagem para medir simultaneamente a fagocitose de partículas bacterianas e burst oxidativo. Usando essa abordagem, um é capaz de separar os granulócitos ativados utilizando variáveis ​​fornecidas pela parte baseada na imagem da análise. Estes subconjuntos eram identificáveis ​​apenas depois de avaliar as imagens celulares nos granulócitos individuais. Além disso o tempo de incubação do ensaio afectada a transição entre as três subconjuntos de activação ^10. Assim, é plausível que o uso de múltiplos tempos de incubação pode permitir um método para testar a mudança na função de granulócitos na sequência de um tratamento experimental específica. O objetivo deste artigo foi demonstrar um método de avaliação da função de granulócitos usando citometria de fluxo baseado em imagem para medir simultaneamente a fagocitose com oxidative estourar.

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos de coleta de sangue descritos neste método foram realizados em conformidade com a Declaração de Helsinki e aprovado pelo Comitê de Ética UNT (IRB) para seres humanos. Todos os indivíduos deram consentimento por escrito para a recolha de sangue, o qual foi usado no presente método para garantir que eles eram aparentemente saudáveis, de peso corporal normal, e livre de doença.

1. Reagente Fonte e Planejamento

1. Uso CD66b-APC (clone # G10F5; DF = 1: 50) e CD45-APCeFluor780 (clone 2D1 #; DF = 1: 50) para este ensaio.
   NOTA: Antes do estudo, os anticorpos CD45 e CD66b foram titulados para determinar a diluição óptima que granulócitos claramente resolvidos (CD45 + / + 66b) a partir de outros leucócitos (CD45 + / 66b-) ^11. Após a adição do anticorpo diluído para a coloração da diluição final no tubo foi de 875.
2. Compra e descongelar estoque S. aureus biopartículas marcado com corante vermelho pHrodo. Suspender a uma concentração de 1 mg de biopartículas por ml em PBS estéril. Biopartículas diluídas e alíquotas armazenamento congelado a -20 ° C até ser utilizada no ensaio.
3. Dissolver dihydroethidium (DHE), a qual é convertida em brometo de etídio fluorescente a presença de radicais livres de oxigénio (isto é, o rebentamento oxidativo), em DMSO a uma concentração final de 10 g / ml.
4. Misturar N-etilmaleimida (utilizada para impedir a fagocitose adicional na sequência da duração da incubação ensaio especificado) com PBS estéril em uma diluição em 2 passos de 200 mg / ml e 17,5 mg / ml, respectivamente. No ensaio, usar uma concentração final de 15 mM. Quando o descongelamento N-etilmaleimida, utilizar uma temperatura de 37 ° C bloco de calor, tal como a N-etilmaleimida não permanece em solução.
5. Após o passo final da fixação, utilizar 7AAD para corar o ADN nuclear. Antes da adição, diluir estoque 7AAD 1:10 com PBS estéril.

2. Coleta de Amostras de sangue

1. Peça sujeitos a chegar ao laboratório após uma O / N rápido (> 8 h) e abstentino de actividade física (> 12 h).
2. Após a limpeza da pele com uma compressa embebida em álcool prep, inserir uma agulha estéril de coleta de sangue em uma veia periférica do braço.
3. Recolha de sangue em tubos de vácuo que são comercialmente cheios de heparina sódica.
4. Após a coleta, aplicar uma bandagem adesiva para o braço do sujeito.
5. Inverta tubos de sangue para misturar 10 vezes e, em seguida, colocar em uma cadeira de balanço até a análise.

Técnica 3. A fagocitose Assay

1. Descongelar biopartículas S.aureus (RT), de DHE (RT), e N-etilmaleimida (37 ° C).
2. Adicionar 20 L de biopartículas S.aureus 4 individuais 1,2 ml tubos, enquanto trabalhava no capô estéril.
3. Adicionar 40 L de DHE a cada tubo contendo as biopartículas.
4. Bater levemente os tubos sobre a superfície do banco para recolher os reagentes no fundo do tubo.
5. Adicionar 100 L de sangue total misturado a cada tubo, que foi preenchido com biopartículas e DHE.
6. Limpe a borda interior dos tubos com um aplicador de algodão cotado para remover qualquer vestígio de sangue contaminando.
7. Misturar o sangue e os reagentes com uma pipeta electrónica criada para misturar o sangue e reagentes para três ciclos, após a adição do sangue.
8. Coloque tubos de ensaio em um balde de gelo e tampa para proteger da luz.
9. Incubar tubos de ensaio durante 10, 20 e 40 min. Comece com o tubo 40 min para assegurar que todos os tubos de ensaio terminar ao mesmo tempo.
10. Thaw N-ethylmaleimide em 37 ° C banho de pérola.
11. Pipetar 15 L de N-etilmaleimida (descrito acima em 1.4) a cada tubo de ensaio, incubar durante 30 min.
12. Pipetar 10 l de CD66b-APC e 10 L de CD45-APCeFluor780 anticorpos diluídos (descritos acima em 1.1), incubar durante 60 min.
13. Pipetar 750 L de solução de lise correcção WBC / RBC em cada tubo de ensaio, incubar durante 60 min.
14. Centrífuga (10 min a 400 xg) tubos de ensaio para recolher o sedimento celular.
15. Vacuum aspirar a solução lise WBC / fix RBC, deixando um residual flvolume de uid (100 L) por cima do sedimento celular.
16. Pipetar 10 l de solução diluída 7AAD (descrito acima em 1.5) e 50? L de PBS em cada tubo de ensaio.
17. Adicione uma gota de contas de calibração (~ 25 L) para cada tubo de ensaio, coloque materiais em tubos de ensaio, tubos embrulhe em papel alumínio e coloque no frigorífico.
18. Coloque o tubo de amostra no fluxo baseado em imagem citômetro e coletar um mínimo de 3.000 eventos de granulócitos usando parâmetros pré-definidos: Autosampler, azul (488 nm, 60 mW), vermelho (640 nm, 100 mW),, SSC (785 nm; 8,5 mW) lasers (Figura 1).

Figura 1. Aquisição Method & Template. As amostras foram adquiridas em um fluxo com base em imagem citômetro (A). Durante a aquisição, gráficos de pontos de Campo brilhante Proporção vs. CD66b-APC foram gerados para granulócitos separados dos grânulos de calibração perfurantes usin100.2.292.0 software g INSPIRE v. (B). Um mínimo de 5.000 granulócitos foram adquiridos para cada amostra utilizando um amostrador automático, azul (488 nm, 60 mW), vermelho (640 nm, 100 mW),, SSC (785 nm; 8,5 mW) lasers. Por favor, note que um número de histogramas estão presentes durante a aquisição para monitorar as configurações de laser e outros aspectos da coleta de dados. Todos esses histogramas são opcionais e só precisava se os procedimentos operacionais padrão de laboratório exige-los como controle de qualidade. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Amostra de Aquisição e Análise

1. Use o assistente de compensação software automatizado do software IDEAS para aplicar uma matriz de compensação para arquivos de imagem RAW (RIF) e criar compensar arquivos clonados (CIF).
2. Carregar arquivos CIF individuais em software idéias e gerar os seguintes parcelas para identificar os subconjuntos de granulócitos:
Estabelecer portões iniciais para identificar as células que foram consideradas em foco usando um histograma para brilhantes RMS gradiente de campo (Figura 2A). Fazer essa determinação para cada amostra usando o controle unstimulated como padrão de referência.
3. Use parcelas secundárias às células singleto separadas de detritos e dupletos, utilizando um gráfico de pontos de campo brilhante relação de aspecto (relação entre a altura da célula versus largura) x área do campo brilhante (Figura 2B). Fazer essa determinação para cada amostra usando o controle unstimulated como padrão de referência.
4. Uma vez que uma população de células limpo havia sido identificado, estabelecer um gráfico de pontos de CD45 vs. CD66b (Figura 2C) para identificar positivamente granulócitos (CD45 + / 66b +). Criar um enredo filha (Figura 3) de intensidade detalhe brilhante para S. aureus (eixo x) vs. detalhe intensidade luminosa para o burst oxidativo (, eixo y-DHE) para identificar subconjuntos de granulócitos activados. Recolha brimagens de campo ight no canal 1 e 9, biopartículas no canal 2, DHE no Channel 4, 7AAD no Canal 5, CD66b no Canal 11 e CD45 no Canal 12.

Figura 2. Modelo de Análise. Este número da série de tramas que foram gerados para identificar as células que estiveram em foco (A), células individuais (B), de granulócitos (C). Parcelas adicionais foram utilizados para identificar os três subconjuntos de granulócitos activados granulócitos vs. inactivos. Toda a análise de arquivos de imagem adquiridos foi completada com software IDEAS v.6. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Results

Usando citometria de fluxo baseado em imagem permitiu separar uma população homogênea de granulócitos ativados em três subgrupos de ativação diferentes (Figura 3). Neste método, a forma mais eficaz de resolver as três subconjuntos de activação é brilhante através da representação gráfica da intensidade detalhe para a fagocitose (S. aureus) versus o burst oxidativo (DHE) (Figura 3; Figura 4). Além disso, o uso do assistente de co-localização de software ideias irão permitir a quantificação da presença simultânea de fagocitose e burst oxidativo, que é um sinal típico de granulócitos altamente activadas.

Figura 3. Identificação da Contato granulócitos Subconjuntos. Após a identificação dos granulócitos utilizando marcadores de superfície celular (CD45 + / 66b +), um enredo filha foi gerado com brilhante detalhe intensidade para a fagocitose vs. intensidade detalhe brilhante para burst oxidativo. Usando essa abordagem, o percentual de inativos (roxo), low-ativo (vermelho, A), moderado-ativo (azul, B) e (C) amarelo, granulócitos altos-ativo foi determinada. Esta técnica de propagação também foi usada para avaliar o efeito do tempo de incubação do ensaio sobre a abundância relativa dos diferentes subconjuntos de granulócitos activados. O maior percentual de granulócitos "high-ativo" estava presente após a 40 min de incubação. Toda a análise de arquivos de imagem adquiridos foi completada com software IDEAS v.6. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Além de demonstrar a presença de três subconjuntos distintos de granulócitos activados, demonstrou-se que o tempo de incubação do ensaio influenciaram a abundância relativa de cada subconjunto granulócitos activados. Especificamente, a 40 min incubation resultou no maior percentual de granulócitos "high-activa". Com a inclusão de, pelo menos, três períodos de incubação do ensaio que pode ser possível determinar a forma como um determinado tratamento clínico altera o estado de activação temporal dos granulócitos. Este é o primeiro método publicado pela citometria de fluxo com base em imagem para identificar diferentes subconjuntos de granulócitos activados como uma função de medições simultâneas de fagocitose e burst oxidativo.

Figura 4. Imagens representativos de marcadores celulares. Uma galeria de imagens de células classificados como de alto-ativa (A), moderado-ativa (B), e de baixo ativo (C) é apresentado nesta figura. Biopartículas S.aureus estão em CH03 , burst oxidativo está em CH04, 7AAD para o núcleo está em CH05, dispersão lateral está em CH06, CD66b está emCH11 e CH12 em CD45 é. Além disso, uma imagem de fusão co-localizada de fagocitose (CH03) vs. burst oxidativo (CH04) é exibido. Áreas de amarelo na imagem merge denotar que a fagocitose e oxidativa explosão estão ocorrendo no mesmo espaço anatômico ao mesmo tempo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O presente método representa um refinamento dos métodos existentes para a avaliação da função de granulócitos utilizando citometria de fluxo ^1,3,4,12-14. Os passos críticos deste ensaio tendem a ser relacionada com uma mistura apropriada da amostra de sangue com as biopartículas e DHE. A mistura incompleta irá resultar em resultados imprecisos. Enquanto a mistura completa é crítico, o método de mistura deve ser de natureza suave. Sugere-se que a mistura ser realizada utilizando uma pipeta electrónica com uma função de mistura, em vez de um misturador de vórtice. Outro passo crítico no ensaio é para assegurar sempre que não há contaminação do sangue da metade superior do tubo de ensaio. Este sangue residual pode ser removido usando um aplicador com ponta de algodão estéril. A remoção completa é importante porque não fazer isso pode contaminar a preparação final do ensaio com hemácias lisadas-un.

Antes de usar este método controles de compensação apropriados devem ser adicionados para controlar spectral sobreposição entre os reagentes utilizados para identificar os vários aspectos da função de granulócitos. Por este método, os controles de compensação envolvem colher amostras de sangue que foram sugeridos no ensaio de incubação de 40 min e, em seguida, a rotulagem com um único marcador (por exemplo, E. coli, a DHE, etc). Após a marcação, eventos positivos individuais são recolhidos e uma matriz de compensação é gerado utilizando um assistente automatizado no software de análise de idéias. É fundamental que se este ensaio é utilizado, os controles de compensação apropriados sejam concluídas para garantir o desempenho adequado do ensaio.

A análise é realizada usando o recurso de localizar e co-localização assistentes para identificar esse brilhante intensidade detalhe é a melhor variável para separar as populações e também identificar como existe muita sobreposição entre burst oxidativo e sinais de fagocitose. Especificamente, a utilização de citometria de imagem baseada em fornecida a capacidade de segregar granulócitos activados em três subconjuntos. Tseu colapso subconjunto foi determinada utilizando intensidade detalhe brilhante de fagocitose vs. burst oxidativo. Além de examinar estas funções celulares singulares, foram identificadas as células que exibiram dois eventos ao mesmo tempo no mesmo local anatómico (co-localização). Granulócitos que caíram no subconjunto "high-ativo" foram o único fenótipo que demonstrou co-localização consistente entre fagocitose e burst oxidativo. Esta identificação de subconjuntos de granulócitos ativados é a maior área em que é necessária solução de problemas. É muito importante para um novo usuário a tomar tempo para entender o fluxo de trabalho processo de amostra em idéias e entender a mecânica de modular os populações de células usando o componente de imagem. Outras modificações que um usuário pode procuram fazer incluem a seleção de vezes ensaio de incubação alternativas ou adicionais. O actual método sugere a utilização de durações de 10-40 min; No entanto, dependendo do modelo experimental em que este método épara ser utilizado, pode ser necessário seleccionar as durações mais ensaio. Tal modificação teria de ser avaliado numa base individual.

Além disso, foi determinado que a duração do ensaio de incubação tem um efeito significativo sobre a aparência dos três subconjuntos activados. A abordagem descrita neste relatório representa uma extensão do que a informação poderia ser obtido previamente sobre a função de granulócitos ^3,4,13,15. Outros laboratórios têm demonstrado a importância de avaliar as alterações na função de granulócitos como parte de uma avaliação abrangente da imunidade e doenças ^15-17. Apesar do potencial de este ensaio não é sem limitações. Uma das limitações principais é o custo e tempo de demanda associadas com o processamento elevado de amostras. Quando um desenho de estudo requer um grande número de amostras num determinado dia, estes podem ser difíceis de processar. Processing é simplificada pela utilização de pipetas eletrônicos e dispensadores,mas estes tendem a ser caros e não estão necessariamente disponíveis em cada laboratório.

Nossa área de pesquisa concentra-se em um estudo de como o exercício e hábitos alimentares influenciam a saúde do sistema imunológico e funcionar ^{6,8-10,18-20.} Estes objectivos têm implicações práticas importantes para uma variedade de áreas da saúde humana. Além do estudo dos efeitos do exercício e nutricionais o método fagocitose demonstrado neste manuscrito poderia ser útil em outras áreas da imunologia clínica onde a monitorização da função de fagocitose é fundamental para os resultados do tratamento. O presente ensaio é o primeiro de muitos ensaios imunológicos, que, com o potencial de ser re-inventado ao tirar vantagem da informação de imagem única que pode ser possível a partir de um fluxo com base em imagem citómetro.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ciências		Vacutainers	usadas para a coleção de sangue
Fixador de WBC/solução da lise de RBC
CD66b-APC	eBioscience
dihidroetídio	Sigma-Aldrich	D7008
N-etilmalemida	Sigma-Aldrich	4259
7AAD	EMD Analisador de hematologia Millipore
	Mindray	BC-3200
pipeta de 96 canais	Integra Biosciences	ViaFlo
Bead Bath Incubadora	LabArmour	Citômetro
	EMD Millipore	Amnis FlowSight
Software EMD	Millipore	Amnis Software INSPIRE
			Seladora
placas Piercable X-Pierce	Excel Scientific, Inc.	X-Pierce
Dell Precision	Workstation Dell Computadores	Vários	Usados para análise IDEAS