Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo otimizado para genotipar, corar e preparar fetos de camundongos para a imagem de projeções de axônios nociceptores periféricos em todo o animal, como um método eficaz para avaliar fenótipos de crescimento sensorial de axônios no desenvolvimento de camundongos geneticamente modificados.

Resumo

A visualização das projeções neuronais de corpo inteiro em embriões é essencial para ganhar uma compreensão de como mamíferos redes neuronais desenvolver. Aqui nós descrevemos um método para rotular in situ um subconjunto do gânglio da raiz dorsal (DRG) projeções axônio para avaliar suas características fenotípicas usando várias linhas de rato geneticamente manipulados. Os neurônios TrkA-positivos são neurônios nociceptores, dedicados à transmissão de sinais de dor. Nós utilizamos uma linha rato TrkA ^taulacZ para rotular as trajetórias de todos os axônios periféricos TrkA-positivos no embrião intacto mouse. Nós produzir ainda mais a linha TrkA ^taulacZ sobre um fundo nulo Bax, que essencialmente suprime a apoptose neuronal, a fim de avaliar as questões relacionadas com o crescimento, independentemente de possíveis efeitos das manipulações genéticas na sobrevivência neuronal. Posteriormente, os ratos geneticamente modificados, de interesse são criados com o TrkA ^TAULACZ / Bax linha nula e está então pronto para o estudo utilizando as técnicas aqui descritas. Esta apresentação inclui informações detalhadas sobre os planos de melhoramento do rato, genotipagem no momento da dissecção, a preparação do tecido, a coloração e de compensação para permitir a visualização de todo o comprimento trajetórias axonal em preparação todo o monte.

Introdução

Estabelecimento de redes neuronais precisas é um processo de desenvolvimento complexo essencial para a funcionalidade do sistema nervoso. Distúrbio neste processo leva à disfunção neuronal que tem sido implicado em doenças neurológicas humanas ^1-3. Para estudar os mecanismos moleculares subjacentes de crescimento do axônio e inervação alvo em mamíferos, nós desenvolvemos um protocolo para visualizar as trajetórias axonal de TrkA-expressando neurônios sensoriais usando uma combinação de duas linhas de rato geneticamente modificados.

TrkA é um receptor para o factor de crescimento dos nervos NGF e é um marcador funcional de neuró....

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos em conformidade com o Manual do NIH para o uso e cuidados de animais de laboratório. O protocolo animal foi aprovada pelo IACUC no Weill Cornell Medical College.

1. Preparação do Tecido

1. Eutanásia fêmeas cronometrado com a gravidez por deslocamento cervical ^15. Dissecar embrionárias E16 - E18 embriões de fêmeas cronometrado com a gravidez e embriões lugar individualmente em poços de uma de 6 poços prato, preenchidas com solução salina fosfato tamponada (PBS).
2. Enxágüe embriões em PBS frio.
3. Retirar uma pequena porção da membrana amniótica do embrião e no lugar de uma solu....

Resultados

Os genótipos de TrkA ^{WT / taulacZ:} Bax ^{- / -} e TrkA ^{taulacZ / taulacZ:} Bax ^{- / -} embriões pode ser determinada sem ambiguidades por genotipagem de PCR padrão (Figura 1). X-gal de coloração exibe detalhado mandris axonal periféricos por via subcutânea em embriões coradas convencionalmente (Figuras 2, 3A), e em todo o embrião após clearing tecido (Figuras 3b, 4).

Temos produzido a TrkA ^{WT / taul.......}

Discussão

O processo de coloração X-gal acima descrito de ratos embrionárias TrkA ^taulacZ permite a visualização rápida e detalhada de projeções axônio de longa distância no embrião fixa intacta. Por causa do fundo nulo Bax estes ratos permitir a sondagem de mecanismos de sinalização que podem contribuir para o crescimento do axônio e sobrevivência neuronal. O cruzamento com camundongos transgênicos ou knockout de interesse permite uma avaliação abrangente de fenótipos axonal e pode servir como guia ú.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
PFA	Sigma-Aldrich	P6418
PBS	Life Tech	10010-023
Solução de enxágue de tecido A	Millipore	BG-6-B
Solução de enxágue de tecido B	Millipore	BG-7-B
Solução de base de mancha de tecido	Millipore	BG-8-C
X-gal	Sigma-Aldrich	B4252
Frasco de cintilação de vidro	Kimble Chase	74500-20
Incubadora	Labline	Modelo 120
Pinos de insetos	FST	26000-30
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
prato de 6 poços	EUA Scientific	CC7672-7506
Primers	IDT	primers
Takara mistura dNTP	Takara	4030
Takara LA tampão	Takara	RR002A
Takara LA Taq	Takara	RR002A
Máquina de PCR	Bio-Rad	DNA Engine Dyad
Álcool benzílico	Sigma-Aldrich	B-1042
Benzoato de benzila	Sigma-Aldrich	B-6630
Microscópio de dissecação	Leica	M205A
Câmera	Leica	DFC310FX
Anel de luz	Leica	MEB110
Photoshop	Adobe	Photoshop 4.0

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