Desenvolvimento de um In vitro Sistema modelo para estudar a interacção de Equus Caballus IgE ao seu receptor de elevada afinidade FceRI

Resumo

O presente estudo descreve o desenvolvimento e as aplicações de um sistema de ensaio geneticamente modificado baseado na transfecção de células de leucemia basofílica de rato com o gene FcεRIα equino. As células transfectadas expressam um receptor funcional onde a liberação de mediadores da resposta alérgica pode ser ativada por IgE e antígeno.

Resumo

A interação da IgE com seu receptor Fc de alta afinidade (FcεRI) seguida por um desafio antigênico é a principal via nas reações alérgicas mediadas por IgE. Como consequência da ligação de alta afinidade entre IgE e FcεRI, juntamente com a produção contínua de IgE pelas células B, as alergias geralmente persistem ao longo da vida, atualmente sem cura permanente disponível. Os cavalos, especialmente os cavalos de corrida, que são comumente consanguíneos, são uma espécie de mamífero muito propensa ao desenvolvimento de respostas de hipersensibilidade, o que pode afetar seriamente seu desempenho. As respostas fisiológicas à sensibilização alérgica em cavalos refletem as observadas em humanos e cães. Neste artigo, descrevemos o desenvolvimento de um sistema de ensaio in situ para a avaliação quantitativa da liberação de mediadores da resposta alérgica pertencente ao sistema equino. Para este fim, o gene que codifica o FcεRIα equino foi transfectado e expresso na superfície das células parentais de leucemia basófila de ratos (RBL-2H3.1). O produto gênico da cadeia α equina transfectada formou um complexo receptor funcional com as cadeias endógenas de β e γ de ratos ¹. O sistema de ensaio resultante facilitou a avaliação da quantidade de mediador secretado de células RBL-2H3.1 transfectadas com FcεRIα equino após sensibilização com IgE equina e desafio antigênico usando liberação de β-hexosaminidase como leitura ^{2, 3}. A liberação do mediador atingiu o pico de 36,68% ± 4,88% a 100 ng ^ml-1 de antígeno. Este ensaio foi modificado a partir de ensaios anteriores usados para estudar respostas alérgicas humanas e caninas ^{4, 5}. Também mostramos que esse tipo de sistema de ensaio tem múltiplas aplicações para o desenvolvimento de ferramentas diagnósticas e a avaliação de segurança de possíveis estratégias de intervenção terapêutica em doenças alérgicas ^{6, 2, 3}.

Introdução

Alergia é conhecida há milênios. Um tratamento da asma foi descrita no texto médico egípcio antigo conhecido como o Papiro de Ebers (~ 1.550 aC) e discutido ervas remédios para tratá-la ^7.

Hoje alergia é classificada como uma resposta de hipersensibilidade do tipo I, em que o tipo de célula T helper 2 (TH ₂₎ o braço do sistema imunitário dirige a produção de (IgE) anticorpos imunoglobulina E em resposta a antigénios ambientais chamados alérgenos. Estes são diversas substâncias que normalmente interagem com as células do sistema imunológico e estimular a síntese e secreção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo a i....

Protocolo

1) Preparação de Linha de Células:

1. O desenvolvimento da linha celular RBL-2H3.1 expressando α FcsRI eqüinos:
   1. Usando técnicas básicas de cultura de tecidos para linhas de células em monocamada, transfectar células RBL-2H3.1 parental usando o plasmídeo pEE6, que transporta o gene equina FceRIa (GenBank: Y18204.1) ^28. Adicionar 2 ug ^-1 ul do DNA de plasmídeo a 0,8 ml de células a uma densidade de 1,2 x 10 ⁷ células mL ^{@ 1.} Electroporate as células a 250 V, 960 uF utilizando um 0,4 centímetros electrocuvette depois incubar imediatamente em gelo durante 10 min.
   2. Selecione as células transfor....

Resultados

As células RBL-2H3.1 parentais e as transfectadas com o gene do receptor de FceRIa equino foram sensibilizados primeiro com IgE de murganho anti DNP-HSA e desafiados com o antigénio DNP-HSA. Rato IgE se liga ao receptor endógeno de rato em ambas as linhas de células e, assim, actua como um controlo para testar a viabilidade de libertação de ambas as linhas celulares para libertar mediadores (Figura 1 A). Esta é uma verificação importante e deve ser levada a cabo rotineiramente desde cima prolongadas (&g.......

Discussão

Em resumo, os resultados desta investigação mostraram que, quando as células RBL-2H3.1 expressando FceRIa eqüinos são sensibilizados com IgE eqüinos e desafiado por um antígeno, eles dão um pico de liberação mediador de 36,68% ± 4,88% do montante total de mediador dentro do As células, em comparação com o RBL-2H3.1 células parentais não expressam eqüinos FceRIa.

Assim, este ensaio fornece uma ferramenta útil para investigar e estudar respostas alérgicas eqüinos in vitro. Sua permite.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RBL-2H3.1 Expressando Fc e épsilon equino; RI&alfa;	-	-	Produzido em laboratório
Equine IgE anti NIP-HSA	-	-	Produzido em laboratório
96 Well Plate	Sigma		CLS3595-Multi
Channel Pipeta	Anachem	-	-
Incubadora	Galaxy R	-	-
4Hidroxi-5-iodo-3-ácido nitrofenilacético	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH foi conjugado com albumina sérica humana para fazer NIP-HSA no laboratório
Dinitrofenil conjugado com albumina sérica humana	Sigma	A6661	DNP-HSA abreviado
	Anthos Labtec HT2	-
Tubos	Sigma	P1851-Cloreto	de
sódio	Sigma	S7653-Cloreto
potássio	Sigma	P9333-Cloreto	de
magnésio	Sigma	M2670-Cloreto	de
cálcio	Sigma	C1016-Triton
x100	Sigma	X100-4-nitrofenil
N-acetil-β-D-glucosaminada	Sigma	N9376	Solução de estoque chamada substrato β-hexosaminidase foi 50mM preparada em DMSO
Dimetil Sulfóxido Sigma		D2650-Ácido
Cítrico	Sigma		251275-Acetato de
Sódio	Sigma	S7670-Tris
	Sigma	T5941	-

Espectrofotômetro de placa de