Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

Resumo

Apresentamos um método que descreve o isolamento e a cultura de explantes cocleares da orelha interna embrionária de camundongos. Também demonstramos um método para transferência de genes em explantes cocleares por meio de eletroporação de onda quadrada. A cultura de explantes in vitro, juntamente com a técnica de transferência de genes, permite que os pesquisadores estudem os efeitos da alteração da expressão gênica durante o desenvolvimento.

Resumo

As células ciliadas auditivas localizadas no órgão do camundongo de Corti detectam e transmitem informações sonoras ao sistema nervoso central. As células ciliadas mecanossensoriais estão alinhadas em uma fileira de células ciliadas internas e três fileiras de células ciliadas externas que se estendem ao longo do eixo basal-apical da cóclea. A técnica de cultura de explante descrita aqui fornece um método eficiente para isolar e manter explantes cocleares da orelha interna embrionária de camundongos. Além disso, a morfologia e as características moleculares das células ciliadas sensoriais e das células de suporte não sensoriais dentro das culturas de explantes cocleares se assemelham às observadas in vivo e podem ser estudadas em seu ambiente celular intrínseco. Os explantes cocleares podem servir como importantes ferramentas experimentais para a identificação e caracterização de vias moleculares e genéticas que estão envolvidas na especificação e padronização celular. Embora os modelos de camundongos transgênicos forneçam uma abordagem eficaz para estudos de expressão gênica, um número considerável de mutantes de camundongos morre durante o desenvolvimento embrionário, dificultando assim a análise e interpretação dos fenótipos de desenvolvimento. O órgão de Corti de camundongos mutantes que morrem antes do nascimento pode ser cultivado para que seu desenvolvimento in vitro e respostas a diferentes fatores possam ser analisados. Além disso, descrevemos uma técnica de eletroporação de explantes cocleares embrionários ex vivo que pode ser usada para regular negativamente ou superexpressar gene(s) específico(s) e analisar sua potencial função endógena e testar se o produto gênico específico é necessário ou suficiente em um determinado contexto para influenciar o desenvolvimento coclear de mamíferos^1-8.

Introdução

O órgão mamífero de Corti é composto por um mosaico de tipos de células especializadas, incluindo dois tipos de células ciliadas mecanossensoriais, bem como pelo menos quatro tipos de células de suporte não sensoriais, tornando-o um sistema modelo ideal para estudar processos celulares normais, como proliferação, especificação de destino, diferenciação e padronização. Além disso, o desenvolvimento normal desses diferentes tipos de células é essencial para a função auditiva normal. Portanto, é crucial entender os fatores, tanto moleculares quanto celulares, que regulam seu desenvolvimento. No entanto, o pequeno tamanho da cóclea do camundongo, bem como sua inacessibilidade, representam um desafio particular para os estudos de expressão gênica. Além disso, a maioria dos eventos de especificação e padronização do destino celular ocorre durante períodos de tempo embrionários e são concluídos principalmente antes do nascimento. Portanto, a identificação e caracterização de eventos de sinalização durante períodos de tempo embrionários é essencial para obter informações sobre a base molecular da morfogênese coclear.

Aqui, demonstramos um método para cultivar cóclea intacta in vitro a partir de orelhas internas embrionárias de camundongos. A lógica por trás do uso dessa técnica é que as cócleas cultivadas mantêm suas características moleculares e morfológicas, fornecendo assim um modelo valioso para investigar potenciais genes candidatos e explorar os mecanismos envolvidos na morfogênese coclear. Embora camundongos transgênicos possam ser usados para estudos de expressão gênica, um sistema in vitro é frequentemente necessário para monitorar funções genéticas específicas. Além disso, as culturas cocleares podem ser estabelecidas a partir de embriões de camundongos transgênicos para que seu desenvolvimento in vitro e resposta a vários fatores solúveis e antagonistas possam ser estudados. Embora embriões no dia 13 (E13) sejam usados neste protocolo, culturas de E12 ou E14 até orelhas internas pós-natais precoces podem dar resultados semelhantes.

Também apresentamos uma técnica de transferência de genes em explantes cocleares embrionários cultivados usando eletroporação de onda quadrada. Após o isolamento dos explantes cocleares, a eletroporação pode ser usada para expressar plasmídeos de DNA de gene(s) de interesse em células individuais dentro do ducto coclear. Essa técnica serve como uma abordagem complementar aos estudos que utilizam camundongos transgênicos para obter informações sobre as vias moleculares subjacentes ao fenótipo celular. Usando este método de transferência de genes, uma variedade de tipos de células epiteliais dentro da cóclea embrionária são transfectadas, permitindo assim análises de perda e ganho de função no nível de célula única. Além disso, estudos eletrofisiológicos também podem ser realizados em culturas de explantes^{cocleares 8}. Este método de eletroporação in vitro é relativamente simples e direto, combinado com danos mínimos ao tecido, resultou em uma rápida expansão desta técnica.

Protocolo

NOTA: Todos os protocolos que utilizam animais vivos devem ser analisados ​​e aprovados por um cuidado e uso de animais Comitê Institucional (IACUC) e deve seguir métodos para o cuidado e uso de animais de laboratório oficialmente aprovado. Todas as dissecações deve ser realizada utilizando uma técnica estéril em um banco de fluxo laminar limpo. Luvas e máscara, se desejado, deve ser usado durante este procedimento.

1. Dissecção da Orelha Embryonic Rato Inner

1. Configuração para órgão de Corti culturas de explantes:
   1. Esteriliza-se o fluxo laminar capuz de cultura de tecidos, ligando a luz UV durante cerca de 30 min e desinfectar a superfície com etanol a 70% antes da utilização. Além disso, esterilizar todos os instrumentos de dissecação, incluindo ferramentas de dissecação finos e pratos Sylgard-revestidos para dissecção embrião via autoclave ou por imersão em etanol 70% por pelo menos 20 min antes do uso. Deitar fora 70% de etanol e permitir que os pratos e instrumentos para ar seco em um fluxo laminar clea limpon bancada antes de usar.
   2. Prepare a Solução Salina Equilibrada de Hank estéril (HBSS) / (4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico) (HEPES) mistura por adição de 10% de HBSS 10x e 0,5% de HEPES e ajustar o pH a aproximadamente 7,2 e esterilizar o filtro solução final e armazenar a 4 ° C. Realizar todas as dissecações em refrigerados solução HBSS / HEPES a melhor preservação do tecido durante todo o procedimento.
   3. Pratos de vidro de fundo casaco com matriz da membrana basal por adição de 5 mL de água fria (4 ° C) estéril de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) a uma alíquota de 300 ul de matriz de membrana basal num tubo de polipropileno de 15 ml estéril. Misturar em vortex o conteúdo e adicionar 150 uL da mistura da matriz da membrana basal DMEM-a do centro de cada placa de cultura de modo a que cubra a totalidade da cultura assim presente no centro do prato. Cubra os pratos e armazenar em um 37 ° C incubadora por pelo menos 45 min antes do uso.
   4. Despeje 5/4 ml refrigerados HBSS em three pratos de Petri de poliestireno e deixe fechado na capa.
   5. Prepare meio de cultura num tubo de polipropileno de 15 ml estéril por adição de 9 ml de DMEM, 100 ul de suplementos de N2, 10 g / ml e Cipro 1 ml de FBS.
2. O isolamento de embriões:
   NOTA: Neste procedimento para a cultura de explantes cocleares embrionárias de camundongos, ouvidos internos colheita do dia embrionário (E) 13 ossos temporais, com o dia após a fertilização sendo considerado como E1 ^9. O protocolo também pode ser utilizado com rato embrionário começando ouvidos internos de E12 a E18.
   1. Euthanize um rato cronometrado-grávida de CO ₂ e sacrificar animais por deslocamento cervical ou protocolos aprovados adequados. Realizar eutanásia longe de de fluxo laminar de cultura de tecidos capuz para manter a esterilidade na sala cultura do tecido.
   2. Coloque o mouse sacrificados em papel toalha com abdômen para cima e desinfectar abdômen com etanol 70%.
   3. Abra a cavidade abdominal, agarrando pelecom uma pinça curva com uma mão e epiderme de corte e muscular ao longo da linha média com tesoura usando uma outra mão. Faça dois cortes perpendiculares em ambos os lados e retirar o útero cuidadosamente levantando cornos uterinos bilaterais com uma pinça e retirá-la da parte de baixo do tecido conjuntivo com uma tesoura.
   4. Coloque a cadeia embrionárias em uma placa de Petri contendo solução refrigerada dissecção (mistura HBSS / HEPES) e transferir para o de fluxo laminar bancada limpa.
   5. Remover cuidadosamente a partir de embriões placenta e colocá-los em uma das placas de Petri estéreis contendo solução de dissecção. Se a solução se torna sangrenta, movê-los para uma nova placa de Petri.
      NOTA: Neste ponto, os embriões podem ser encenado usando um guia de preparo Theiler.
   6. Decapitar embriões por beliscar na região do pescoço com um par de fórceps limpas ou tesoura e coloque as cabeças em um prato fresco Petri contendo solução de dissecção gelada.
3. Dissecção da orelha interna:
   1. Coloque ocabeça embrião ne em um prato Sylgard estéril contendo dissecação frio
   2. solução. Trabalhando sob um microscópio de dissecação com uma ampliação de 1.6X ~, imobilizar a cabeça do embrião, colocando Minutien pinos em torno ou mais próxima da região dos olhos (Figura 1A).
   3. Usando duas pinças estéreis cuidadosamente retire a pele e abrir o crânio no lado dorsal ao longo da linha média (Figura 1B). Remover cérebro de cavidade craniana e ouvidos internos localizados em ossos temporais podem ser identificadas nesta fase (Figura 1C, D). O forro do vaso sanguíneo, que normalmente está presente em torno das orelhas internas, pode ser utilizado como um ponto de referência para a identificação do ouvido interno, nesta fase (Figura 1D).
   4. Dissecar o ouvido interno dos ossos temporais, colocando a pinça debaixo do tecido e isolamento do ouvido interno a partir da base do crânio e a transferência de um novo prato de dissecação contendo solução fria (Figura 1E, F).

2. Geração de Órgão de Corti culturas de explantes

NOTA: Nesta fase de desenvolvimento, o tecido cartilaginoso é e pode ser facilmente dissecados com a pinça.

1. Oriente o ouvido interno para que o lado ventral está virada para cima (Figura 2A) e estabilizar o ouvido interno através da inserção suavemente a extremidade aguçada da Minutien pinos através da porção vestibular do ouvido interno (Figura 2B).
2. Usando fórceps ultrafinas cortar abrir a cartilagem sobrejacente, fazendo uma incisão utilizando uma ponta de pinça perto da janela oval e cuidadosamente remover a cartilagem da cóclea (Figura 2C).
   NOTA: É importante ter a certeza que os fórceps não são inseridos muito profundamente na cartilagem como cartilagem sobrejacente às vezes é fundido com o dueto coclear no caso em que é útil para utilizar uma pinça fechada para libertar cartilagem do ducto coclear subjacente por raspagem abaixo do surface da cartilagem. Nesta fase de desenvolvimento, a espiral da cóclea é de apenas três quartos de um turno de comprimento.
3. Em seguida, expor o epitélio sensorial, colocando a pinça na região preferida do ducto coclear, quer a base ou no vértice, e puxando para fora o telhado da cóclea (Figura 2D).
   NOTA: O telhado da cóclea deve ser removido completamente, uma vez que pode mascarar o epitélio sensorial impedindo a análise.
   NOTA: Este procedimento deve ser feito com cuidado, pois é fácil de rasgar o epitélio sensorial.
4. Como um último passo, cuidadosamente remover o tecido conjuntivo subjacente do epitélio sensorial exposta de modo que a base do explante coclear é uniformemente plana.
5. Isolar a cóclea dissecada da porção vestibular do ouvido interno com a pinça. Isto pode ser realizado antes ou após a etapa 2.4 (Figura 2E).
6. Transferir o epitélio sensorial da cóclea dissecado em uma membra porãopoço de cultura utilizando um cinzel estéril 1,5 milímetros (Figura 2F) ne-matriz revestida.
7. Oriente o explante da cóclea com a superfície luminal do epitélio virado para cima, e aspirar a solução de matriz de membrana basal DMEM para achatar cuidadosamente o tecido e substituí-la com 150 ul de meio de cultura fresco adicionando suavemente para o prato. Deve ser tomado cuidado para assegurar que cada explante adere bem à lamela de vidro revestido e não está a flutuar no meio de cultura. Certifique-se de que a ponta do fórceps, é apontado para cima, enquanto a fixação do poço de vidro para evitar danificar o explante da cóclea.
8. Suavemente transferir a placa de cultura estéril num prato de cultura de 150 milímetros e colocar numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante período de tempo desejado, normalmente 3-6 dias in vitro (DIV). Depois de 1 DIV, examinar as culturas sob um microscópio de dissecação para certificar-se que o explante da cóclea aderiu bem à placa de cultura.
9. Depois de emcubation in vitro para comprimentos desejados de tempo, as culturas são processados ​​para imuno-histoquímica.
   NOTA: As culturas de explantes geralmente são incubadas durante 6 DIV, que é equivalente a fase de desenvolvimento, P0. Após a incubação in vitro, as culturas podem ser processados ​​em aplicações a jusante, como imuno-histoquímica (Figura 3B), RT-PCR, a hibridização in situ, e / ou Western blot.

3. A electroporação mediada por Transferência de Genes

1. Configuração para eletroporação:
   1. Esterilizar um Sylgard 100 milímetros prato de vidro revestido por autoclavagem ou imersão em etanol a 70% durante cerca de 20 min e deixar secar ao ar numa bancada limpa antes da utilização.
   2. Prepare o DNA de um vector de expressão de escolha utilizando Maximiliano ou midi-prep kits adequados. Os vectores de expressão utilizados neste protocolo são pIRES2-Atoh1.EGFP e pCLIG-NeuroD1.EGFP. A concentração final de ADN deve ser de pelo menos 1 ug / uL de ADN estéril /Livre de RNAse água.
2. Electroporating ADN em explantes da cóclea embrionárias:
   1. Adicionar 10 ul de solução de ADN de plasmídeo para um novo Sylgard 100 milímetros revestida prato e transferir um explante da cóclea totalmente dissecados (obtido a partir do passo 2.5) para a solução de ADN.
   2. Com a superfície luminal do epitélio virado para cima, a cóclea inclinar ligeiramente de modo que é perpendicular ao plano do prato.
   3. Coloque as pás de eléctrodos em ambos os lados da cóclea com pá negativo (cátodo) para o epitélio sensorial e a pá positivo (ânodo) localizada adjacente à base da cóclea.
      Observação: Uma vez que o ADN tem carga negativa, que migra de negativo para positivo e do eléctrodo, colocando a extremidade do cátodo da sonda adjacente ao epitélio sensorial; o DNA principalmente ir através da superfície do epitélio sensorial.
   4. Usando electroporator, entregar 9-10 pulsos de 24 mV, 30 ms duração do pulso com o interruptor do pedal em tele electroporator, e em seguida, adicione 100 ml de meio de cultura quente para a cóclea electroporado.
   5. Repita os passos 3.2.1-4 para todos os explantes da cóclea e para o DNA de todos os genes de interesse e transferir as cócleas electroporadas na membrana basal revestida de matriz prato para o plaqueamento (passo 2.7). Cultura todas as cócleas electroporados em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora humidificada para comprimentos de tempo desejados, que serão depois processadas para imunocitoquímica.
      NOTA: A cóclea de uma ninhada inteira de CD1 rato (aproximadamente 8-12 filhotes) pode ser isolado, microdissecados, electroporado e banhado em <4 horas.

4. Análise das Culturas Coclear explantes

NOTA: As culturas são geralmente incubados durante 6 DIV, que é equivalente a fase de desenvolvimento, P0. Após a incubação in vitro, as culturas são fixadas e processadas para imunocitoquímica.

1. Depois de comprimento desejado de incubation, remover o meio de cultura e lavar rapidamente o explante da cóclea em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incuba-se em paraformaldeído a 4% (em PBS) durante 15 min à temperatura ambiente.
2. Lavar o fixador por adição de PBS e lavar três vezes em PBS durante 15 min.
3. Permeabilizar utilizando PBS-T (PBS + Tween a 0,5%) durante 30 min antes de bloqueio com PBS-T contendo 10% de soro de cabra.
4. Incubar em solução de anticorpo primário contendo o anticorpo primário em PBS-T com 1% de soro de cabra durante a noite a 4 ° C.
5. Lava-se a cóclea três vezes à temperatura ambiente utilizando PBS-T 15 min antes da adição de cada anticorpos secundários conjugados com Alexa adequadas.
6. Uma vez que o explante é cultivado sobre coclear lamela de vidro que pode ser tratado individualmente pelo isolamento da lamela do prato de montagem e sobre a lâmina. Isto pode ser conseguido por imersão da placa de cultura em OS30 solvente para pelo menos 1 hora à temperatura ambiente. Usando a lâmina estéril, retire a lamela do dish e montar em um slide e visualizar em um microscópio fluorescente.

Resultados

Descrevemos um método para isolar a cóclea dos ouvidos internos embrionários e microdissecar para expor o epitélio sensorial. Uma vez dissecado, pode ser plaqueado e cultivado como um ducto coclear íntegro (Figura 3) e analisado por imuno-histoquímica. Os explantes cocleares cultivados fornecem um ensaio útil para examinar o efeito da variedade de fatores solúveis e drogas farmacológicas no desenvolvimento coclear. Após a dissecção de explantes cocleares, a técnica de eletroporação pode ser usada para ex...

Discussão

Todas as células dentro do labirinto membranoso do ouvido interno de rato, incluindo sensorial, não-sensorial e os neurónios do gânglio da espiral são todos derivados de placodally derivado otocyst localizado adjacente à parte posterior do cérebro da ectoderme, cerca de ^10-14 E8. Em E11, a região ventral do otocyst estende-se para formar o ducto coclear e como desenvolvimento continua, um grupo de células epiteliais no interior da cóclea, bem como em outras regiões do otocyst, tornar-se como emplastros prosen...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
HBSS	Gibco	14065-056
HEPES	Gibco	15630-080
Dulbecco' s Modificado Médio	Gibco	12430-054
Soro fetal bovino	Gibco	10082
N-2 Suplemento (100x)	Gibco	17502-048
Cloridrato de ciprofloxacina	Cellgro	61-277-RF
Prato de vidro 60 mm	Kimble Chase	23062-6015/23064-6015
Prato de vidro 100 mm	Kimble Chase	23064-10015/23062-10015
Minutien pinos	Fine Science Tools	26002-15
Dumont # 5 fórceps	Fine Science Tools	11251-10
Gerador de pulso	Protech International Inc	CUY21Vivo-SQ
Pratos de cultura de fundo de vidro	MatTek	P35G-0-10-C
Matriz Matrigel	BD Biosciences	356237
Placa de cultura, 60 x 15 mm	Becton Dickinson	353037
Placas de cultura de tecidos	Greiner Bio-one	639160
Solução salina tamponada com fosfato	Gibco	10010-023
OS-30	Dow Corning	4021768
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01
Tubos cônicos, 15 ml	Greiner Bio-one	188261
Miosina 6	Proteus Biosciences Inc	25-6791
Miosina 7a	Proteus Biosciences Inc	25-6790
TuJ1	Sigma	T2200