Artigo de método

Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

DOI:

10.3791/52260

⸱

12 de janeiro de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, College of Medicine, 2Laboratory of Cochlear Development, NIDCD, NIH

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos um método que descreve o isolamento e a cultura de explantes cocleares da orelha interna embrionária de camundongos. Também demonstramos um método para transferência de genes em explantes cocleares por meio de eletroporação de onda quadrada. A cultura de explantes in vitro, juntamente com a técnica de transferência de genes, permite que os pesquisadores estudem os efeitos da alteração da expressão gênica durante o desenvolvimento.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células ciliadas auditivas localizadas no órgão do camundongo de Corti detectam e transmitem informações sonoras ao sistema nervoso central. As células ciliadas mecanossensoriais estão alinhadas em uma fileira de células ciliadas internas e três fileiras de células ciliadas externas que se estendem ao longo do eixo basal-apical da cóclea. A técnica de cultura de explante descrita aqui fornece um método eficiente para isolar e manter explantes cocleares da orelha interna embrionária de camundongos. Além disso, a morfologia e as características moleculares das células ciliadas sensoriais e das células de suporte não sensoriais dentro das culturas de explantes cocleares se assemelham às observadas in vivo e podem ser estudadas em seu ambiente celular intrínseco. Os explantes cocleares podem servir como importantes ferramentas experimentais para a identificação e caracterização de vias moleculares e genéticas que estão envolvidas na especificação e padronização celular. Embora os modelos de camundongos transgênicos forneçam uma abordagem eficaz para estudos de expressão gênica, um número considerável de mutantes de camundongos morre durante o desenvolvimento embrionário, dificultando assim a análise e interpretação dos fenótipos de desenvolvimento. O órgão de Corti de camundongos mutantes que morrem antes do nascimento pode ser cultivado para que seu desenvolvimento in vitro e respostas a diferentes fatores possam ser analisados. Além disso, descrevemos uma técnica de eletroporação de explantes cocleares embrionários ex vivo que pode ser usada para regular negativamente ou superexpressar gene(s) específico(s) e analisar sua potencial função endógena e testar se o produto gênico específico é necessário ou suficiente em um determinado contexto para influenciar o desenvolvimento coclear de mamíferos1-8.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O órgão mamífero de Corti é composto por um mosaico de tipos de células especializadas, incluindo dois tipos de células ciliadas mecanossensoriais, bem como pelo menos quatro tipos de células de suporte não sensoriais, tornando-o um sistema modelo ideal para estudar processos celulares normais, como proliferação, especificação de destino, diferenciação e padronização. Além disso, o desenvolvimento normal desses diferentes tipos de células é essencial para a função auditiva normal. Portanto, é crucial entender os fatores, tanto moleculares quanto celulares, que regulam seu desenvolvimento. No entanto, o pequeno tamanho da cóclea do camundongo, bem como sua inacessibili....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Todos os protocolos que utilizam animais vivos devem ser analisados ​​e aprovados por um cuidado e uso de animais Comitê Institucional (IACUC) e deve seguir métodos para o cuidado e uso de animais de laboratório oficialmente aprovado. Todas as dissecações deve ser realizada utilizando uma técnica estéril em um banco de fluxo laminar limpo. Luvas e máscara, se desejado, deve ser usado durante este procedimento.

1. Dissecção da Orelha Embryonic Rato Inner

  1. Configuração para órgão de Corti culturas de explantes:
    1. Esteriliza-se o fluxo laminar capuz de cultura de tecidos, ligando a luz UV durante cerca de 30 min e desi....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos um método para isolar a cóclea dos ouvidos internos embrionários e microdissecar para expor o epitélio sensorial. Uma vez dissecado, pode ser plaqueado e cultivado como um ducto coclear íntegro (Figura 3) e analisado por imuno-histoquímica. Os explantes cocleares cultivados fornecem um ensaio útil para examinar o efeito da variedade de fatores solúveis e drogas farmacológicas no desenvolvimento coclear. Após a dissecção de explantes cocleares, a técnica de eletroporação pode ser usada para ex.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todas as células dentro do labirinto membranoso do ouvido interno de rato, incluindo sensorial, não-sensorial e os neurónios do gânglio da espiral são todos derivados de placodally derivado otocyst localizado adjacente à parte posterior do cérebro da ectoderme, cerca de 10-14 E8. Em E11, a região ventral do otocyst estende-se para formar o ducto coclear e como desenvolvimento continua, um grupo de células epiteliais no interior da cóclea, bem como em outras regiões do otocyst, tornar-se como emplastros prosen.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Bradley Schulte pelos comentários sobre este protocolo. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health grant R00 (5R00DC010220). Este projeto foi realizado em um espaço de laboratório renovado apoiado por Grant C06RR014516.

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
HBSSGibco14065-056
HEPESGibco15630-080
Dulbecco' s Modificado MédioGibco12430-054
Soro fetal bovinoGibco10082
N-2 Suplemento (100x)Gibco17502-048
Cloridrato de ciprofloxacinaCellgro61-277-RF
Prato de vidro 60 mmKimble Chase23062-6015/23064-6015
Prato de vidro 100 mmKimble Chase23064-10015/23062-10015
Minutien pinosFine Science Tools26002-15
Dumont # 5 fórcepsFine Science Tools11251-10
Gerador de pulsoProtech International IncCUY21Vivo-SQ
Pratos de cultura de fundo de vidroMatTekP35G-0-10-C
Matriz MatrigelBD Biosciences356237
Placa de cultura, 60 x 15 mmBecton Dickinson353037
Placas de cultura de tecidosGreiner Bio-one639160
Solução salina tamponada com fosfatoGibco10010-023
OS-30Dow Corning4021768
FluoromountSouthern Biotech0100-01
Tubos cônicos, 15 mlGreiner Bio-one188261
Miosina 6Proteus Biosciences Inc25-6791
Miosina 7aProteus Biosciences Inc25-6790
TuJ1SigmaT2200

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. Organotypic development of the organ of Corti in culture. J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).
  2. Zheng, J. L., Gao, W. Q. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Cultivo de Explantes CoclearesC clea de Camundongo Embrion rioEletropora o para Transfer ncia de Genesrg o de CortiC lulas Ciliadas SensoriaisImagem ConfocalImagem de C lulas VivasImunohistoqu micaMatriz de Membrana BasalProtocolo de Eletropora o

Artigos relacionados