A instilação intratraqueal mediada por intubação (IMIT) de reagentes é um método excelente e não invasivo para estudar doenças respiratórias, bem como um método para instilar reagentes terapêuticos diretamente no pulmão. É um método rápido e altamente reprodutível, adequado para testes pré-clínicos.
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Intratraqueal (IMIT) instilação mediada por intubação: A não-invasiva, sistema de entrega Lung-specific
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estudos de doenças respiratórias envolvem tipicamente a utilização de sistemas de modelos murinos como substitutos. No entanto, existem diferenças fisiológicas significativas entre os sistemas respiratório humano e murino, especialmente em suas vias respiratórias superiores (URT). Nalguns modelos, estas diferenças na cavidade nasal de murino podem ter um impacto significativo sobre a progressão da doença e na apresentação do trato respiratório inferior (LRT) quando se utiliza técnicas de instilação intranasal, limitando potencialmente a utilidade do modelo de rato para estudar estas doenças. Por estas razões, seria vantajoso desenvolver uma técnica para instilar bactérias directamente para os pulmões do rato, a fim de estudar a doença de LRT na ausência de envolvimento do TRS. Temos chamado este específico intratraqueal técnica entrega intubação mediada (IMIT) instilação de pulmão. Esta técnica não invasiva minimiza o potencial para a instilação para a corrente sanguínea, o que pode ocorrer durante traditi mais invasivaonal abordagens cirúrgicas intratraqueais infecção, e limita a possibilidade de entrega do aparelho digestivo incidental. IMIT é um processo de duas etapas em que ratinhos são entubados em primeiro lugar, com um passo intermédio para assegurar a colocação correcta do cateter para dentro da traqueia, seguido da inserção de uma agulha romba para dentro do cateter para mediar a entrega directa das bactérias para o pulmão. Esta abordagem facilita uma eficácia de> 98% de entrega para os pulmões com uma excelente distribuição de reagente ao longo pulmão. Assim, IMIT representa uma nova abordagem para estudar a doença de LRT e entrega terapêutica directamente no pulmão, após a melhorar a capacidade de usar ratos como substitutos para estudar a doença respiratória humana. Além disso, a precisão e reprodutibilidade deste sistema de entrega também faz com que seja passível de Boas Práticas de Laboratório (BPL) Normas, bem como a entrega de uma ampla gama de reagentes que requerem a entrega de alta eficiência para o pulmão.
Introdução
Os ratinhos foram usados para modelar numerosas manifestações de doenças humanas, incluindo uma miríade de doenças respiratórias. Modelos de doenças substitutos são frequentemente incapazes de recapitular todos os aspectos de uma doença modelado, normalmente devido a diferenças fisiológicas importantes ou imunes nos dois modelos de acolhimento. Assim, o objetivo de melhorar os sistemas de modelos é desenvolver abordagens que permitem substitutos para espelhar mais de perto um processo de doença ou resposta do hospedeiro, como observado no sistema host original. Existem várias diferenças fisiológicas principais entre os ratos e os seres humanos no mecanismo pelo qual eles inspirar ar. Incluídos nestes diferenças são diferenças raciométrica significativas de tamanho entre a URT e LRT. Estimou-se que os ratos possuem> 100 vezes a área de superfície TRS relação aos seres humanos, normalizados contra 1,2 capacidade pulmonar total. Assim, os cornetos nasais do mouse permitem mais ampla filtragem do ar inspirado para facilitar uma maior taxa de breathing, o que pode ter um impacto significativo sobre os estudos de pneumonia se a infecção da cavidade nasal desempenha um papel significativo na progressão da doença.
Várias abordagens diferentes têm sido empregues para incutir bactérias nos pulmões de ratos para estudar a doença respiratória semelhante à humana. A mais comum destas abordagens é a inoculação intranasal, no qual uma suspensão líquida é aplicada em uma ou ambas as narinas de um rato. Embora relativamente simples, advertências como volume instilação e tipo de anestesia utilizada pode afetar a eficiência da instilação no LRT via intranasal inoculação 3-5. Especificamente, Miller et al. demonstraram que a instilação intranasal de Francisella tularensis em volumes de menos de 50 ul não resultou em instilação das bactérias no LRT 6. Eles observaram ainda melhor LRT instilação ao usar isoforane ao contrário de injetado cetamina / xilazina para anestesia. No entanto, o nosso experience com Yersinia pestis inoculação intranasal indica a inoculação mais consistente pode ser conseguida utilizando cetamina / xilazina, em comparação com isoflurano (MBL, dados não publicados). Estas diferenças podem ser atribuídas ao patógeno utilizado ou à variação nos procedimentos de laboratório, mas importante destacar a variabilidade potencial desta técnica. Além disso, os pulmões colhidos logo após a instilação intranasal mostram que uma percentagem relativamente baixa do inoculo bacteriano inicial atinge o pulmão (no caso de Y. pestis, apenas 10% foram recuperados 1 h após a instilação 7), sugerindo que um grande número de bactérias pode ser retida no TRS (ou engolido no tracto GI). Em certos modelos de doenças, esta deposição significativa de bactérias na mucosa URT pode confundir o nosso entendimento da progressão da doença, se o organismo é capaz de colonizar a cavidade nasal murino de forma incompatível com a doença humana. Por exemplo, usando in vivo </ Em> imagiologia, tem-se observado que Burkholderia pseudomallei, que não colonizar o TRS humano, provoca uma infecção oportunista esmagadora da cavidade nasal de murino quando entregue pelo método de instilação intranasal 8.
Outros métodos de instilação de bactérias nos pulmões de ratos também foram empregues na pesquisa de doenças infecciosas. No entanto, em comparação com instilação intranasal estes métodos tendem a exigir mais conhecimentos técnicos e / ou equipamentos caros, sem eliminar o potencial de iniciação infecção em vários locais (por exemplo, aerosol [URT e LRT]; transoral [trato digestivo e LRT]; e intratraqueal cirúrgico [LRT e sangue]). Dadas as potenciais complicações que poderiam estar associados com sites secundários de infecção, buscou-se desenvolver uma abordagem intratraqueal que ignora a URT e entrega patógeno diretamente para os pulmões de ratos anestesiados, mas também limita inoculat inadvertidaíon na corrente sanguínea ou do trato gastrointestinal. Para este fim, intratraqueal (IMIT) instilação mediada por intubação foi desenvolvido como um procedimento não-cirúrgico que garante LRT instilação de inoculo por inclusão de um passo intermediário para verificar a colocação do cateter adequado antes da instilação. Este método é descrito usando corante de instilação para demonstrar visualmente ampla distribuição do inoculo em todo o pulmão, e P. aeruginosa instilação para demonstrar a entrega altamente eficaz (> 98% do inoculo) do presente método para o pulmão. É importante ressaltar que, enquanto originalmente desenvolvido para entrega bacteriana, IMIT também oferece uma ferramenta eficaz para: i) a instilação de várias moléculas para o estudo de outros modelos de doenças respiratórias, ii) a entrega terapêutica específica do pulmão, e iii) os estudos de função pulmonar de base, incluindo alvo siRNA entrega ao pulmão.
Protocolo
NOTA: Todos os procedimentos descritos aqui foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Biossegurança da Universidade de Louisville (protocolo # 13-056) e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (protocolo # 13-064).
1. Preparação do corante
- Diluir 0,1% (p / v) de Coomassie Brilliant Blue em PBS e esterilizar por filtro usando um filtro de seringa de 0,45 μM.
2. Preparação da cultura de Pseudomonas aeruginosa
- 15 horas antes da instilação, inocular 3 ml de cultura em caldo com uma única colónia bacteriana.
- Cultive a cultura por 15 horas a 37 °C em um shaker (200 rpm).
- Centrifugue 1 ml de cultura em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml 12.000 x g por 30 segundos.
- Remova o meio e ressuspenda o pellet em 1ml de PBS.
- Diluir uma alíquota da suspensão bacteriana 1:10 em PBS e medir a DO600 da suspensão bacteriana diluída para determinar a concentração bacteriana.
- Diluir a suspensão de reserva bacteriana em PBS até à concentração desejada de inóculo bacteriano, utilizando um volume de administração de 50 μl para a inoculação IMIT.
3. Instilação de IMIT
- Coloque um grupo de camundongos na câmara de indução de anestesia com isoflurano e anestesiar usando uma mistura de isoflurano / oxigênio a 2 a 3%.
- No início inicial da sedação, raspe o camundongo, segurando-o na posição vertical, e administre 10 μl de uma solução de lidocaína a 2% por agulha de gavagem na parte de trás da garganta e deixe a solução escorrer para a epiglote. Retorne o mouse para a câmara de anestesia.
- Aguarde um mínimo de 5 minutos para permitir que a lidocaína faça efeito total como anestésico local.
- Quando os camundongos atingirem o nível desejado de sedação (taxa de respiração de ~ 60 bpm), reduza o isoflurano para 2% para manter a sedação.
- Pré-carregue o corante ou o inóculo bacteriano em uma seringa de precisão estanque a gás de 250 μl com uma agulha romba de 22 G de comprimento.
- Primeiro aspire 150 μl de ar, medidos pelo êmbolo de Teflon da seringa. Em seguida, extraia 50 μl de inóculo avançando o êmbolo de Teflon da marca de 150 μl para a marca de 200 μl no corpo da seringa.
NOTA: Quando a amostra é ejetada em um camundongo intubado, a suspensão de 50 μl será administrada primeiro, seguida por uma almofada de ar de 150 μl que distribuirá o inóculo por todo o pulmão.
- Primeiro aspire 150 μl de ar, medidos pelo êmbolo de Teflon da seringa. Em seguida, extraia 50 μl de inóculo avançando o êmbolo de Teflon da marca de 150 μl para a marca de 200 μl no corpo da seringa.
- Remova um camundongo da câmara de indução e deite-se em decúbito dorsal em uma plataforma de intubação. Prenda o mouse à plataforma enganchando seus incisivos com um O-ring preso à tira de Velcro e prendendo o Velcro à plataforma. Levante o mouse para uma inclinação de 45°.
- Usando um aplicador de micro algodão, retraia a língua com um movimento de rolamento, usando a mão dominante.
- Com a mão não dominante, use um otoscópio cirúrgico com um espéculo de intubação para manter a retração da língua e visualizar a glote.
- Com a mão dominante, use um fio-guia enfiado em um cateter de 20 G para intubar o camundongo, assentando o cateter a uma profundidade de 10 mm na traqueia do camundongo (o cateter é ajustado com uma luva de silicone com 10 mm de cateter exposto). Remova o otoscópio/espéculos.
- Confirme se o mouse foi intubado corretamente prendendo o cateter com a mão não dominante enquanto conecta brevemente um comprimento Luer conectado de tubo transparente de 1/16" contendo um corante colorido.
NOTA: O corante migrará rapidamente para frente e para trás em resposta à respiração. - Não prossiga com as etapas subsequentes se a confirmação da intubação não tiver sido estabelecida neste momento. Se a tentativa de intubação falhar, reinicie o cateter e o fio-guia para uma tentativa adicional de intubação.
NOTA: Não é aconselhável tentar mais de duas intubações de um camundongo em uma sessão sem causar trauma no camundongo. - Continue a prender o cateter com a mão não dominante enquanto insere a seringa de precisão/agulha romba contendo a suspensão líquida/almofada de ar.
- Dispense o líquido/ar diretamente no pulmão em um único movimento de fluido e remova imediatamente a agulha/cateter do mouse.
- Retorne o mouse para uma gaiola e permita a recuperação da anestesia.
4. Caracterização da entrega do IMT
- Após a instilação do IMIT, eutanasiar o camundongo por asfixia por CO2 em um momento apropriado após a inoculação.
- Prenda o camundongo sacrificado em uma placa de dissecação e molhe o tórax e o abdômen com 70% de EtOH usando um frasco de esguicho.
- Se estiver avaliando a distribuição de um agente de imagem em todo o pulmão, remova os pulmões do animal usando técnica estéril e exiba os pulmões conforme apropriado para imagem.
NOTA: Os pulmões podem ser preparados para técnicas adicionais de coloração histológica por meio de fixação ou criopreservação apropriadas. - Se estiver avaliando a carga bacteriana do tecido pulmonar infectado, remova os pulmões do animal usando a técnica estéril. Coloque os pulmões em um saco de amostra estéril e pré-pesado de 1 onça. Pesar e registar o peso do saco de amostras + pulmões.
- Adicione 1 ml de PBS estéril 1x a cada saco de amostra + tecidos. Feche novamente o saco de amostra.
- Homogeneizar os tecidos rolando suavemente uma pipeta serológica de 25 ml sobre o saco de amostras + tecido.
- Gerar diluições seriadas do homogeneizado pulmonar em PBS estéril e placa em placa de ágar (LB, ou conforme apropriado para a espécie bacteriana em estudo):
- Realizar uma diluição de seis vezes em série numa placa de 96 poços com fundo em U por pipetador multicanal e, em seguida, triplicar amostras por multicanal na placa de ágar.
- Incubar placas de ágar-ágar durante a noite a 37 °C e enumerar as unidades formadoras de colónias no dia seguinte.
Resultados
Para visualizar a distribuição do material instilado pelo método IMIT, 50 µl de corante Azul Brilhante de Coomassie 0,1% foram instilados nos pulmões de um camundongo anestesiado. O camundongo foi eutanasiado imediatamente e os pulmões foram removidos por necropsia estéril. Figura 1 mostra que o corante foi entregue a todos os lobos do pulmão.
Para determinar a quantidade de bactérias administrada aos pulmões pelo método IMIT, três grupos de camundongos (n = 3) receberam três concentrações diferentes de P. aeruginosa (1,21 x 108, 1,21 x 107 e 1,21 x 106 unidades formadoras de colônia [UFC] por 50 µl). Imediatamente após a instilação pelo método IMIT, os camundongos foram eutanasiados, os pulmões removidos e o número de bactérias foi contado e comparado aos inóculos (Figura 2). A administração do inóculo é altamente eficiente por meio deste método, com recuperação de >98% do inóculo dos pulmões dos animais instilados. Além disso, a instilação pelo método IMIT foi altamente reprodutível, independentemente da concentração do inóculo (R2 = 0,9951).
Figura 1: A instilação por IMIT distribui o inóculo por todo o pulmão. Pulmões de camundongos instilados com 50 µl de Azul Brilhante de Coomassie a 0,1% mostram distribuição do corante azul em todos os lobos.
Figura 2: Instilação de bactérias no pulmão por IMIT. Camundongos receberam instilação de P. aeruginosa e a quantidade de bactérias instiladas nos pulmões (Log10 UFC – recuperadas) foi comparada ao inóculo estimado (Log10 UFC – entregue). Cada círculo representa a UFC/pulmão de um camundongo individual (n = 3 para cada dose bacteriana).
Discussão
A instilação IMIT oferece melhorias importantes para os modelos de doenças respiratórias existentes na capacidade de instilar reagentes de forma reprodutível diretamente no pulmão. É uma abordagem rápida que está idealmente situada para uma equipe de dois pesquisadores, um dos quais gerencia a logística de anestesia e enjaulamento, e o outro que executa a técnica IMIT. Grandes estudos podem ser conduzidos usando IMIT com um compromisso de tempo médio de 2 a 3 minutos por camundongo. Como a abordagem faz uso de isoflurano como anestésico, os camundongos se recuperam rapidamente da anestesia, reduzindo o tempo de criação do monitoramento dos animais durante a recuperação.
O aspecto tecnicamente mais desafiador do método IMIT é a etapa inicial de intubação de camundongos. Os indivíduos que aprendem a realizar o IMIT são capazes de se concentrar nesta primeira etapa da colocação do cateter e garantir que a intubação tenha sido alcançada por meio da confirmação visual do movimento do corante. O benefício da abordagem é que a instilação específica do pulmão é garantida por meio do uso da confirmação da intubação, o que aumenta a confiança tanto do novo pesquisador quanto do especialista que tenta intubar um animal difícil. Os elementos-chave para otimizar a probabilidade de uma intubação bem-sucedida são: i) conseguir uma sedação profunda para permitir tempo de trabalho suficiente, ii) colocação correta dos espéculos na boca para permitir uma boa visualização da epiglote, iii) boa colocação em profundidade dos espéculos para que a língua permaneça retraída durante todo o procedimento, e iv) uso da plataforma basculante para apoiar as mãos do pesquisador para que o procedimento seja conduzido relaxado e com uma abordagem constante.
Uma das limitações do procedimento IMIT está relacionada à frequência de eventos de instilação do IMIT. Devido ao trauma potencial associado a uma intubação perdida, não é recomendado que mais de duas tentativas de intubação sejam realizadas em uma única sessão (até duas falhas). O IMIT tem um excelente potencial em sua capacidade de ser usado para administrar terapêuticas no pulmão murino, no entanto, regimes terapêuticos que fazem uso de administração muito frequente de reagente no pulmão podem não ser adequados para IMIT. Pode ser possível que o IMIT possa ser usado diariamente para administrar reagentes em um pulmão murino sem causar trauma significativo, mas apenas quando conduzido por um pesquisador altamente qualificado, já que a maioria dos traumas associados à intubação está associada a um evento de intubação perdido. Essa IMIT de alta frequência deve ser discutida com veterinários locais e IACUC.
Uma limitação potencial adicional do IMIT é o tamanho do camundongo que está sendo intubado. O procedimento IMIT descrito acima foi desenvolvido usando camundongos de aproximadamente 17 a 22 g, onde um cateter de 20 G foi considerado um tamanho adequado para a traqueia de camundongos nessa faixa de tamanho. Cateteres maiores foram usados com sucesso em camundongos mais velhos; o desenvolvimento inicial do IMIT fez uso de um cateter de 18 G em camundongos BALB/c com >20 g. É importante ressaltar que, se forem usados tamanhos alternativos de cateter, devem ser fornecidas agulhas rombas que se encaixem no lúmen do cateter e sejam aparadas em um comprimento que se estenda apenas 1 mm além da ponta do cateter. A intubação de camundongos menores que 17 g pode ser possível, mas não é recomendada devido à experiência necessária e exigiria o uso de cateteres e espéculos menores do que os descritos acima.
Usamos o IMIT para a entrega de vários patógenos respiratórios além de P. aeruginosa, incluindo B. pseudomallei9 e Klebsiella pneumoniae10. O modelo IMIT fez avanços importantes em nossos estudos de doença respiratória por B. pseudomallei , tendo identificado que a inoculação intranasal causa uma morbidade precoce relacionada à TRU em camundongos, em vez do desfecho da doença sistêmica observada na doença humana9. B. pseudomallei é um agente selecionado de Nível 1 de impacto de biodefesa e, como tal, modelos de doenças respiratórias estão sendo desenvolvidos para exposição a aerossóis que modelam uma potencial rota de entrada relacionada à biodefesa para patógenos armados. Como os modelos atuais de aerossol resultam em infecção do URT e do LRT, os mesmos fenótipos potenciais de morbidade precoce que identificamos para o modelo intranasal da doença respiratória de B. pseudomallei podem se aplicar ao modelo de aerossol. Uma adaptação futura do modelo IMIT poderia ser uma entrega de aerossol mediada por intubação (IMAD), na qual os camundongos são intubados para entrega de aerossol alvo apenas no pulmão. Ventiladores mecânicos estão atualmente disponíveis para manter a anestesia com isoflurano, que pode ser adaptada para fornecer um desafio de patógeno em aerossol, em vez de líquido.
O IMIT foi desenvolvido inicialmente como uma abordagem para otimizar a entrega de bactérias ao pulmão, mas também tem aplicação para a entrega de outros reagentes no pulmão de camundongos. Como discutido acima, a entrega intranasal de compostos em camundongos resulta em uma entrega de reagentes de baixa eficiência e altamente variável no órgão-alvo do pulmão. A entrega intranasal de reagentes de imagem de tomografia por emissão de pósitrons (PET) ao pulmão murino produziu uma eficiência de entrega de 40%11, enquanto demonstramos que a IMIT oferece uma excelente alternativa a outras abordagens de entrega pulmonar com sua eficácia de entrega de >98% e distribuição multilobar. Essa melhora na entrega direcionada ao pulmão tem o potencial de aumentar a reprodutibilidade da entrega terapêutica para o tratamento da doença pulmonar. O IMIT também poderia oferecer benefícios aos estudos de: i) o impacto de irritantes pulmonares ambientais, ii) estudos fenotípicos de câncer de pulmão, iii) nocaute de siRNA específico do pulmão.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio do Centro de Modelos Animais de Medicina Predicativa (Carol Vanover, Ashley Biller e Jennifer Kraenzle) e Microbiologia (Daniel Cramer e Julie Sotsky) Core Facilities. Este trabalho foi apoiado por financiamento do NIH (HHSN272201000033I para MBL e JMW).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Roedor, Suporte de trabalho basculante | Hallowell EMC | 000A3467 | A base deve ser removida ao trabalhar em um |
| Otoscope Operacional | Head Welch Allyn | 21700 | |
| Otoscópio 3.5 V Li Bateria | Welch Allyn | 71900 | |
| Mouse Intubation Specula curto, autoclavável | Hallowell EMC | 200A3589S | |
| Incisor Loops | Hallowell EMC | 210A3490A | |
| Aplicador de ponta fina de algodão | Puritan | 871-PC DBL | Usado para retração da língua |
| Cateter IV, 20 G | Exel Int | 26741 | Opcional: encaixar uma manga de silicone com superfície de cateter exposta de 10 mm |
| Seringa estanque a gás, 250 ul | Hamilton | 81120 | Usado para administração de inóculo líquido por IMIT |
| Agulha romba, 22 G | Hamilton | 91022 | Corte no comprimento para sobressair 1 mm do cateter de 20 G |
| Fio-guia (fio de fibra óptica, 0,5 mm) | TheFiberOpticStore.com | FOF .50 | Corte para 6" de comprimento: usado como fio guia para intubação |
| Seringa tuberculina, 1 ml | Becton Dickinson | 309659 | Monte com fio de fibra óptica como fio guia |
| Tubo Brilliant Blue R (Coomassie) | Sigma | B0149 | |
| Tygon, 1/16" | Saint Gobain | ALC00002 | |
| Luer macho 1/16" farpa | Cole Parmer | 45503-22 | |
| Luer fêmea 1/16" farpa | Cole Parmer | 45500-00 | |
| Lidocaína, USP | Spectrum | LI102 | pH lidocaína em solução a 2% (p/v) pH7.0 |
| Saco de amostra, 1 oz | Whirl-Pak | B01067 | |
| Placa de 96 poços com fundo em U, | Greiner estéril 650161 |
Referências
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Reimpressões e permissões
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