Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

Resumo

A análise in vitro da recombinação de troca de classe em camundongos é desafiadora devido às moléculas de IgE citofílicas ligadas aos receptores Fc na superfície das células B. Descrevemos um método para detecção de IgE usando clivagem mediada por tripsina de IgE ligada à superfície antes da fixação e permeabilização para coloração de fluorescência citoplasmática.

Resumo

B imunoglobulina linfócitos cadeia pesada (HGI) recombinação mudança de classe (CSR) é um processo em que, inicialmente, expressa IgM muda para outros isotipos CMI, tais como IgA, IgE e IgG. Medição de IgH RSE in vitro é um método fundamental para o estudo de uma série de processos biológicos variam de recombinação e reparação do ADN de aspectos da imunologia molecular e celular. Ensaio in vitro RSE envolve a superfície de medição de citometria de fluxo a expressão de Ig em células B activadas. Embora a medição de IgA e IgG subclasses é simples, medição de IgE por este método é problemático devido à ligação de IgE a FceRII solúvel / CD23 expresso na superfície de células B activadas. Aqui, descrevemos um processo único para a medição precisa de IgE células B de ratinho produtora que tenham sido submetidos a RSE em cultura. O método baseia-se na clivagem mediada por tripsina de complexos IgE-CD23 na superfície das células, permitindo a detecção de células produtoras de IgE da linhagem B por cycoloração toplasmic. Este procedimento oferece uma solução conveniente para a análise de citometria de fluxo de CSR para IgE.

Introdução

Durante cadeia pesada de imunoglobulina (IgH) recombinação mudança de classe (CSR) em ratos e seres humanos, o IgH μ exons região constante (Cμ) são eliminados e substituídos por um dos vários conjuntos de jusante exons região constante (C _H s) (por exemplo, Cy, Cε, e Ca), resultando numa passagem da produção de IgM para a produção de outras classes de Ig (por exemplo, IgG, IgE, ou IgA). RSE ocorre dentro de regiões de troca (S), que são sequências de 1-10 kb localizado 5 'em cada conjunto de C _H ¹ s. A enzima Activação Induzida citidina-desaminase (AID) inicia RSE através da actividade de citidina de desaminação.

IgE é um mediador chave da doença alérgica ² e uma maior compreensão de como IgE é produzida e regulamentada pode abrir as portas para novas abordagens terapêuticas para a doença atópica. Em ratos e seres humanos, IgE é o isotipo Ig mais rigidamente controlado. IgE é normalmente detectada em níveis milhares de times menos do que outros isotipos de IgH ^3, mas pode ser muito elevado em estados de doença ^4. No entanto, a RSE para IgE é completamente compreendida. In vitro a activação de células B com IL-4 em combinação com anti-CD40 ou LPS, induz RSE para ambos IgG1 e IgE ^5. Células B ativadas expressar a baixa afinidade receptor IgE FceRII / CD23 ^2,6, que liga IgE solúvel secretada em cultura após CSR. Portanto, quando a análise por citometria de fluxo, as células B com receptor de IgE ligado a mancha de modo semelhante às células B expressando IgE ⁷ endogenamente. Embora se saiba que o mouse B células expressam a baixa afinidade IgG receptor FcγRIIB1 (CD32) ^8, em nossa experiência, não parece interferir com a medição da classe de comutação para IgG1. No entanto, quando se mede a IgE de comutação após a activação das células B em cultura, não específica ligada à superfície IgE pode obscurecer a análise. Com métodos de coloração comuns, as células não-IgE-expressando manchar positivamente para IgE.

Esboçado aqui é uma estratégia que tem sido utilizada para realizar ensaios de RSE e detectar células B expressando IgE verdadeiros de ratos ^9-11. O tratamento de células B activadas com tripsina, um reagente de laboratório comum para digerir a proteína, remove tanto cytophylic superfície e ligada à membrana de IgE. Permeabilização e subsequente coloração citoplasmática para IgE revela, assim, as células produtoras de IgE verdadeiros.

Protocolo

NOTA: Todas as experiências descritas aqui foram de acordo com as diretrizes Comitê Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) e aprovado pelo Animal Hospital Research para a Infância (ARCH), Boston, Massachusetts.

1. Preparação dos Reagentes

1. 1.000x IL-4 Stock: Diluir citocina IL-4 a 20 ng / ml em _H2O ou 0,1% de albumina de soro bovino (BSA). Distribuir em alíquotas de 200 ul a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar a -20 ° C.
2. 1.000 vezes anti-CD40: obter do fabricante a 1,0 mg / ml, armazenar a 4 ° C.
3. Meios estimulação das células B: Para 425 ml de meio RPMI-1640, adicionar 75 ml de descongelado de fresco de soro fetal de vitelo (FCS), 10 ml de tampão HEPES 1,0 M, 5 ml de caldo de L-glutamina, 5 mL de Penicilina: stock de Estreptomicina, 5 ml essenciais Médio não-essenciais Aminoácidos jul (MAM-NEAA), e 3,5 mínimo de 2-mercaptoetanol. Mantenha o material a 4 ° C por até uma semana. Adicionar IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 ug / ml) imediatamente antes da utilizaçãoapenas com o volume de material necessário.
4. 2% de FCS em FACS Buffer: Adicionam-se 10 ml de FCS e 490 mL de PBS 1x. Mantenha a 4 ° C.
5. 2x solução de tripsina-EDTA: Diluir 5 ml de 10x solução estoque de tripsina-EDTA (tripsina 5,0 g, 2,0 g de EDTA por litro) em 20 ml de PBS 1x. Loja de tripsina-EDTA em 2x alíquotas trabalhando a 4 ° C. Deixa-se aquecer até à temperatura ambiente antes do uso.
6. Soro fetal bovino: Manter FCS descongeladas a 4 ° C por até duas semanas. Colocar em gelo 15 min antes do processo de coloração citoplasmática.
7. Neutro-tamponada de formalina: Prepare uma solução de formol a 10% (3,7% de paraformaldeído). Formalin é tóxico e, portanto, lidar com ele sob uma fume hood laboratório enquanto usava EPI adequado. Formalina loja à temperatura ambiente em um armário de armazenamento de produtos químicos.
8. Metanol: loja metanol absoluto (100%) a -20 ° C até as células estão prontas para ser permeabilizadas. Note-se que o metanol é inflamável e deve ser armazenado em freezer apropriado.

2.Purificação e activação de células B

1. A partir de um baço recém-colhida rato, preparar uma suspensão de células individuais, pressionando suavemente o órgão através de um filtro de células 70 um com o êmbolo de uma seringa de 3 ml. Num tubo de centrífuga de 15 mL cónico, recolher as células em 10 ml de PBS 1x e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
2. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de células vermelhas do sangue tampão de lise durante 5 min. Neutraliza-se com 13,5 ml de PBS 1x e centrifugar a 300 xg durante 5 min.
3. (Opcional) magneticamente separar as células B, utilizando anti-CD45R (B220) marcado com grânulos, seguindo o protocolo de purificação MACS acordo com as instruções do fabricante.
4. Estimular as células B purificadas a 1,0 x 10 ⁶ células / ml em meios aquecida a estimulação das células B contendo IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 ug / ml) durante 5 dias a 37 ° C. Comece com 8 ml de cultura divididos em dois poços de uma placa de cultura de 6 poços (4 ml cada).
5. Verifique culture diária para manter a 1,0 x 10 ⁶ células / ml. Ajustar a concentração através da divisão em outras cavidades e a diluição da cultura com meio de estimulação das células B fresco contendo IL-4 e anti-CD40.

3. A tripsinização, Fixação e permeabilização

1. Tripsiniza�o
   1. Recolhe-se a 1,0 x 10 ⁷ de células de cultura num tubo de 15 ml, centrifugar a 300 xg durante 5 minutos, e decanta-se o sobrenadante.
   2. Lava-se com 10 ml de PBS para remover a proteína residual a partir do suporte de recolha de células. Repetir o passo de centrifugação e decantar o sobrenadante.
   3. Ressuspender o sedimento de células no volume residual após decantação (cerca de 100 uL).
   4. Adiciona-se cuidadosamente 800 ul de 0,1% temperatura ambiente (2x) de tripsina-EDTA para as células. Dispensar lentamente num ângulo de 45 ° para o lado do tubo cónico.
   5. Fechar o tubo e misturar suavemente pela inclinação do tubo de modo que o líquido corre ao longo do comprimento do tubo de tempo 5-6s. Um precipitado pegajoso, branco pode formar-se na solução. Limite o tempo de tripsinização para menos de um min.
   6. Extingue-se a reacção tripsinização com 1 ml de FCS a frio. Dilui-se o FCS imediatamente por adição de 10 ml de PBS frio.
   7. Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, depois decanta-se o sobrenadante e devolver os tubos em gelo.
2. Fixação
   1. Ressuspender as células do volume residual, após decantação. Se necessário, levar o volume até 100 ml com PBS frio.
   2. Numa hotte, adicionar 800 ul de solução de formalina tamponada neutra a 10% para as células e pipetar para cima e para baixo. O tubo vai aquecer após a adição de formalina. Incubar a 37 ° C durante 10 min.
3. Permeabilização
   1. Configurar um misturador de bancada vortex a uma velocidade agitação suave.
   2. Desenhar 9 ml de frio (-20 ° C) de metanol em 10 ml de uma pipeta serológica.
   3. Segurar o tubo contendo as células ao longo do misturador de vórtice e suavemente começar tremendog das células.
   4. Adicionar metanol frio para o tubo assim que cai gota a gota sobre as células, enquanto o tubo está ainda agitação, de modo que o metanol é se mistura continuamente. Depois dos primeiros 2 ml de metanol a velocidade de distribuição pode ser aumentada para um caudal lento.
   5. Deixe o tubo de sentar em gelo durante 30 min para completar a permeabilização. Alternativamente, as células podem ser armazenadas a -20 ° C durante até um mês.

4. A fluorescência de coloração para IgG1 e IgE Classe Switching

1. Amostra Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos e decantar a solução de metanol. Um precipitado branco podem sedimentar com as células.
2. Adicionar 10 ml de 1x PBS temperatura ambiente e centrifugar a 300 xg durante 5 minutos para lavar as células. Repetir uma vez. Nota: A lavagem do pellet com temperatura ambiente PBS dissolve precipitado extra que podem formar após o passo 4.1.
3. Realizar uma lavagem adicional com 10 ml de 2% FCS-tampão de FACS.
4. Distribuir amostras de 96 poços rodada placa de fundoe centrifugar a 300 xg durante 5 min. Decantar o sobrenadante e colocar a placa no gelo.
5. Mancha em 60 ul de tampão de 2% de FCS em FACS por poço com as seguintes diluições de anticorpos: anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-IgG1 de PE, 1: 600, FITC anti-IgE, 1: 100, Anti CD45R (B220), PerCP-Cy5.5, 1: 200
6. Após 5 min de coloração, lavar a placa com 150 ul de 2% de FCS-tampão de FACS e centrifugar durante 5 minutos a 300 x g.
7. Ressuspender em 400 ul de tampão de 2% de FCS em FACS e por meio de uma pipeta de 40 um coador de células de nylon para um tubo de 5 ml de FACS.

5. Use a Estratégia Gating seguir:

1. Isolar CD45R (B220) células positivas da população de linfócitos jateamento localizado no / parcela SSC FSC (Figura 1).
2. A partir das células positivas B220, utilizar o lote de IgE e IgG1 para revelar as populações correspondentes.

Resultados

Este procedimento foi implementado com sucesso para estudar CSR para IgE em células B de ratinho. Para demonstrar a eficiência na medição RSE, que estimulou as células B do baço de ratinho com anticorpo anti-CD40 e IL-4 como descrito anteriormente ^11. Depois de cinco dias de estimulação, as células foram recolhidas e processadas utilizando o protocolo descrito acima e coradas com fluorescência marcado IgM, IgG1, IgE, anticorpos e B220 (CD45R). Recolhidas em linfócitos de detonação (Figura 1),...

Discussão

A estimulação de células B do baço de rato em cultura com anti-CD40 e IL-4 irá simular tipo T helper 2 (T _H 2) interacções, troca de classe encorajador IgG1 e IgE ^5. As células B podem ser ativados para a RSE no âmbito do total esplenocitos ¹² ou células B do baço como purificados ^11. Como foi observado no protocolo (passo 2.3), o enriquecimento de células B é opcional, e fica ao critério do experimentador para determinar se seria benéfico. Separação magnética positiva de célu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-Mouse IgE FITC	BD Pharmingen	553415	clone R35-72
Rato Anti-Mouse IgG1 PE	BD Pharmingen	550083	clone A85-1
Metanol	BDH	BDH1135-4LP	Mantenha em -20 ° C
Falcon Cell Strainer 40 µ m Nylon	Corning	352340
Falcon Cell Strainer 70 µ m Nylon	Corning	352350
Anti-Hu / Mo CD45R (B220) PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-4052-82	clone RA3-6B2
anti-Rato / Rato CD40	eBioscience	16-0402-85	clone HM40-3
RPMI Médio 1640	Gibco	11875-093
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
MEM-NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Phosphate Buffered Saline (10x)	Lifetechnologies (Corning)	46-013-CM
MACS CD45R (B220) microesferas	Miltenyi Biotec	130-049-501
MACS	Miltenyi Biotec	130-042-401
IL-4	PeproTech	214-14	Reconstituir em água ou solução de formalina BSA a 0,1%,
tamponado neutro, solução de	Sigma Aldrich	HT501128-4L
(10x)	Sigma Aldrich	T4174-100 ml	5,0 g de tripsina, 2,0 g de EDTA• 4 Na por litro de 0,9% NaCl
Penicilina-estreptomicina	Sigma Aldrich	P0781-100 ml	10.000 U Penicilina; 10 mg/ml Estreptomicina (100x)
L-Glutamina 200	mM Sigma Aldrich	G7513
2-mercaptoetanol (99%)	Sigma Aldrich	M6250-100 ml
Tampão de lise de glóbulos vermelhos	Sigma Aldrich	R7757
Rato Anti-Rato IgM RPE/Cy7	SouthernBiotech	1140-17	clone 1B4B1
HyClone Fetal Calf Serum	Thermo	SH30910.03
B cell Estimulação media			B cell media consiste em RPMI com soro fetal de bezerro (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamina,  1x Penicilina-Estreptomicina (Penicilina: 100 U/ml, Estreptomicina: 100 µ g/ml), Beta-mercaptoetanol (7 µ L/L), IL-4 (20 ng/ml) e anti-CD40 (1 µ g/ml)

Coluna de purificação tripsina-EDTA 10%