Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

Resumo

Os níveis de proteína em células e tecidos são muitas vezes fortemente regulada pelo equilíbrio da produção de proteínas e de apuramento. Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP), a cinética de apuramento de proteínas pode ser medida experimentalmente in vivo.

Resumo

A estabilidade da proteína influencia muitos aspectos da biologia, e medir a cinética limpeza de proteínas pode fornecer importantes insights sobre sistemas biológicos. Em experiências FDAP, o apuramento das proteínas nos organismos vivos podem ser medidos. Uma proteína de interesse é marcado com uma proteína fluorescente photoconvertible, expressa in vivo e photoconverted, e a diminuição do sinal photoconverted ao longo do tempo é monitorizada. Os dados são então equipado com um modelo de depuração adequada para determinar a meia-vida da proteína. Importante, a cinética de depuração de populações de proteína em diferentes compartimentos do organismo pode ser examinado separadamente aplicando máscaras compartimentais. Esta abordagem tem sido utilizada para determinar os intra- e extracelulares meias-vidas de proteínas de sinalização segregadas durante o desenvolvimento do peixe-zebra. Aqui, descrevemos um protocolo para experimentos FDAP em embriões de peixe-zebra. Deve ser possível usar FDAP para determinar a cinética de depuração dequalquer proteína de qualquer organismo taggable opticamente acessíveis.

Introdução

Os níveis de proteínas em células e organismos são determinados através das suas taxas de produção e de depuração. Proteína de semi-vida pode variar de minutos a dias ^1-4. Em muitos sistemas biológicos, a estabilização ou limpeza de proteínas-chave tem efeitos importantes sobre a atividade celular. Modulação da estabilidade da proteína intracelular é necessário para a progressão do ciclo celular ^5,6, sinalização de desenvolvimento ^7-9, apoptose ^10, e a função normal e manutenção de neurónios ^11,12. A estabilidade da proteína extracelular afecta a distribuição e disponibilidade de proteínas segregadas, tais como m....

Protocolo

1. Gerando um Photoconvertible construção de fusão e injetando dechorionated embriões Zebrafish

1. Gerar uma construção funcional contendo a proteína de interesse fundida com uma proteína photoconvertible verde-a-vermelho (ver discussão), em seguida, utilizar a transcrição in vitro para gerar ARNm que codifica tapado a proteína de fusão como em Muller et al., 2012 ^19.
2. Use pronase para remover os córions de cerca de 30 embriões de peixe zebra na fase de uma célula. Alternativamente, dechorionate manualmente embriões usando uma pinça ^28.
   Nota: Os embriões devem ser dechorionated ....

Resultados

FDAP tem sido usado para determinar a meia-vida de proteínas de sinalização extracelular em embriões de peixe-zebra ^19. Uma destas proteínas, estrabismo, induz a expressão de genes durante o desenvolvimento embrionário mesendodermal ^34. Estrabismo-Dendra2 activa a expressão de genes mesendodermal em níveis semelhantes aos estrabismo não marcado, como demonstrado por qRT-PCR e hibridização in situ em ¹⁹ ensaios. Os embriões foram co-injectados com Alexa488-dextrano e ARNm que cod.......

Discussão

O sucesso de uma experiência FDAP baseia-se na geração de uma proteína de fusão photoconvertible funcional. Marcação de uma proteína pode afectar a sua actividade biológica e / ou propriedades biofísicas, incluindo a sua localização, a solubilidade, a estabilidade e ^36-41. Ser preparados para testar a actividade de várias construções de fusão diferentes, a fim de encontrar um que seja activo. Verificou-se que a mudança da posição da proteína photoconvertible em relação à proteína de interesse ou utilizando li.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
PyFDAP (baixe do seguinte website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)			Instale e opere usando as instruções fornecidas no site do PyFDAP; O PyFDAP é compatível com os sistemas operacionais Linux, Mac e Windows.
Kit de Transcrição mMessage mMachine Sp6	Life Technologies	AM1340	Para gerar mRNA tampado para injeção em embriões
Alexa488-conjugado de dextrano, 3 kDa	Life Technologies	D34682	Co-injetar com mRNA para criar máscaras intracelulares e extracelulares
Prato de plástico de 6 poços	BD Falcon		Incubar embriões em poços revestidos de agarose até estarem prontos para montagem
Meio embrião			250 mg/L Sal oceânico instantâneo, 1  mg/L de azul de metileno em água de osmose reversa ajustada para pH 7 com NaHCO3
Protease de Streptomyces griseus	Sigma	P5147	Faça um estoque de 5 mg/ml e use a 1  mg/ml para descorionar embriões na fase de uma célula
		de Petri de vidro de 5 cm de diâmetro	Para descorionação de embriões
Copo			Para descorionação de embriões Aparelho
		microinjecção	Para injecção de ARNm e corante em embriões na fase de uma célula
Estereomicroscópio			Para injecção e montagem de
embriões1x meio			Dilua a agarose de baixo ponto de fusão e realize imagens neste meio; receita: solução filtrada de 0,2 mm de NaCl 58 mM, KCl 0,7 mM, MgSO4, CaCl 0,3 mM<>2, 5  mM HEPES pH 7.2
UltraPure baixo ponto de fusão agarose	Invitrogen	16520-100	Para montagem de embriões; use a uma concentração de 1% no meio de Danieau: adicione 200 mg a 20 ml de meio de Danieau, leve ao microondas até dissolver, depois alíquota 1  ml em tubos de microcentrífuga; alíquotas podem ser armazenadas em 4 ° C, re-derretido a 70  ° C, e resfriado a 40– 42 &graus; C quando estiver pronto para usar
Pipeta Glass Pasteur	Kimble Chase (via Fisher)	63A53WT	Para montagem de embriões; chame a ponta para evitar que bordas irregulares machuquem os embriões Sonda
		de metal	Para posicionar embriões durante a montagem
Pratos de fundo de vidro	MatTek	P35G-1.5-14-C	Use a espessura de vidro de cobertura apropriada para seu objetivo; o número de peça listado aqui é para a tampa de vidro nº 1.5
Tubo de 15 ml preenchido com meio embrionário de ~5 ml	BD Falcon		Para enxaguar agarose residual da pipeta Pasteur
Microscópio			Uma lâmpada de arco de mercúrio, 488  laser nm, laser de 543 nm e os conjuntos de filtros apropriados
são necessários Estágio			Para manter os embriões na temperatura ideal de 28 > C durante o experimento
Software confocal capaz de imagens			Deve ser capaz de definir várias posições e imagens automaticamente em intervalos definidos
		de água de 25X ou 40X	Objetiva para imagem de imagens
Objetiva			Objetiva para fotoconversão
Óleo			Óleo de imersão com o mesmo índice de refração da água

Placa de vidro de 200 ml de de Danieau confocal de varredura a laser invertido aquecido de lapso de tempo Objetiva de ar de 10X de imersão