Aqui, criamos uma pipeta de vidro com funções duplas: inibição de estruturas cerebrais profundas por microinjeções de drogas e monitoramento em tempo real de seus efeitos por meio de registros eletrofisiológicos simultâneos.
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Artigo de método
Gravação simultânea eletrofisiológica e micro-injeções de agentes inibidores no cérebro do roedor
Neste artigo
Resumo
Resumo
Aqui nós descrevemos um método para a construção de um uso único "injectrode" usando peças comercialmente acessíveis e económicas. Um sistema de sondagem foi desenvolvido que permite a injecção de um fármaco durante a gravação de sinais electrofisiológicos da população de neurónios afectados. Este método fornece uma alternativa simples e económica para soluções comerciais. Uma pipeta de vidro foi modificado combinando-o com uma agulha hipodérmica e um filamento de prata. O injectrode está ligado a bomba de micro comercial para entrega da droga. Isso resulta em uma técnica que fornece feedback em tempo real através de sinais extracelulares farmacodinâmica de múltiplas unidades provenientes do local de entrega de drogas. Como prova de conceito, registramos a atividade neuronal do colículo superior provocada por flashes de luz em ratos, concomitantemente com a entrega de drogas através da injectrode. A capacidade de gravação injectrode permite a caracterização funcional do injsite de exão favorecendo o controle preciso sobre a localização de entrega da droga. A aplicação deste método também se estende muito além do que é demonstrado aqui, como a escolha de substância química carregada no injectrode é vasto, incluindo o rastreamento de marcadores para experimentos anatômicos.
Introdução
A inactivação de áreas corticais e núcleos sub-corticais é importante no estudo das relações funcionais entre diversas estruturas cerebrais 2-4. A literatura recente empregue química perda de função ou técnicas criogénicas para estudar o papel das estruturas cerebrais 2,5. No que diz respeito a micro-injecções farmacológicas, pequenos volumes de medicamentos podem ser administrados em uma região do cérebro, a uma taxa controlada ao mesmo tempo minimizando os danos colaterais ao tecido circundante 6,7. Esta técnica pode ser usada para fornecer agonistas específicos, agonistas inversos ou antagonistas para estudar o efeito de diferentes....
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Protocolo
Nota: Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes do Conselho Canadense para a Proteção dos Animais e do conselho de revisão Ética da Université de Montréal.
1. Assembleia da pipeta de gravação de injecção
- Puxar um capilar de vidro a cerca de 7 cm de comprimento (diâmetro exterior 1 mm), utilizando um puxador de pipeta.
- Quebrar a ponta do capilar e verificar a abertura sob um microscópio de luz. Confirmar que o diâmetro interno é entre 30 um e 40 um.
- Inserir um longo fio de prata 7 centímetros para o capilar de vidro com cerca de 1 cm protuberantes a partir da extremidade não-có....
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Resultados
A construção do injectrode é ilustrada na Figura 1. Um fio de prata (C) é alimentado para dentro de uma pipeta de vidro de (D) com uma porção do arame dobrado e projectando-se para fora a partir da abertura. Uma agulha 30 G (B) está ligado e selado para a abertura da pipeta de vidro com cola. Após a pipeta foi cheia com a substância de injecção, uma micro seringa de vidro (A) está ligado à agulha. É importante que exista uma boa vedação onde o micro liga seringa com a agulha (E) e em que o fio de prata .......
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Discussão
O protocolo proposto foi projetado para resolver os desafios decorrentes de métodos atuais de inativação reversíveis. Especificamente, este projeto visa aperfeiçoar os métodos utilizados para microinjeções químicas das substâncias que modulam a atividade neural, particularmente em estruturas cerebrais profundas. Um desafio técnico que emerge a partir deste tipo de instalação é a necessidade de ambas as sondas para ser co-localizada no mesmo espaço restrito in vivo a fim de obter gravações precisas no local da i.......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Apoiado por doações do CIHR (MOP231122) e NSERC (RGPIN-2014-06503). Gostaríamos de agradecer a Geneviève Cyr por sua ajuda na preparação de experimentos e na supervisão do trabalho de laboratório. O MAL recebeu uma bolsa de estudos do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bomba de injeção (UltraMicroPump III) | WPI | #UMP3 | |
| Console de injeção (Micro4 Controller) | WPI | #SYS-MICRO4 | |
| Seringa Hamilton | Hamliton | (80301) 701LT 10 µ L Seringas SYR | entre 5 e 10 μ l |
| usado Adesivo plástico flexível | Lepage | 393915 | A forma de gel é mais fácil de aplicar ao eixo do 30 G agulha hipodérmica formando uma vedação à prova d'água quando seca. |
| Pipetas de vidro | WPI | #TW100F-4 | Parede fina, 1 mm OD, 0,75 mm ID com pipetas de filamento usadas |
| 720 Extrator de pipetas de agulha | Kopf | 720 | |
| Fio de prata | A-M Systems, Inc. | 782500 | 0,010 " desencapados |
Referências
- Martin, J. H., Ghez, C. Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).
- Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T.
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Reimpressões e permissões
