Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

Matthias Garten; Sophie Aimon; Patricia Bassereau; Gilman E. S. Toombes

doi:10.3791/52281

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Artigo de método

Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

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DOI:

10.3791/52281

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22 de janeiro de 2015

Matthias Garten¹ , Sophie Aimon² , Patricia Bassereau¹ , Gilman E. S. Toombes³

¹Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS, UMR 168, PhysicoChimie Curie, Université Pierre et Marie Curie, ²Kavli Institute for Brain and Mind, University of California, San Diego, ³Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute for Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health

Neste artigo

Resumo

A reconstituição da proteína transmembranar, KvAP, em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) é demonstrada por dois métodos de desidratação-re-hidratação - eletroformação, e inchaço assistida-gel. Em ambos os métodos, vesículas pequenas unilamelares que contêm a proteína são fundidos em conjunto para formar GUVs que pode, em seguida, ser estudadas por microscopia de fluorescência e de patch-clamp electrofisiologia.

Resumo

Gigante Unilamelares vesículas (GUVs) são um sistema biomimético popular para estudar membrana fenômenos associados. No entanto, vulgarmente utilizados protocolos para crescer GUVs deve ser modificado de modo a formar GUVs contendo proteínas transmembranares funcionais. Este artigo descreve dois métodos de desidratação-reidratação - eletroformação e inchaço assistida-gel - para formar GUVs contendo o canal de potássio voltagem-dependentes, KvAP. Em ambos os métodos, a solução de pequenas vesículas unilamelares contendo proteína é parcialmente desidratado para formar uma pilha de membranas, o qual é, em seguida, deixadas inchar em um tampão de reidratação. Para o método da eletroformação, o filme é depositado sobre eléctrodos de platina, de modo que um campo CA pode ser aplicada durante a re-hidratação do filme. Em contraste, o método inchaço assistida-gel usa um substrato de gel de agarose para melhorar a hidratação do filme. Ambos os métodos podem produzir GUVs em (por exemplo, 100 mM), as concentrações baixas (por exemplo, 5 mM) e salinas fisiológicas. Os GUVs resultantes são caracterizados através de microscopia de fluorescência, e a função dos canais reconstituídos medida usando a configuração de patch-clamp de dentro para fora. Enquanto inchaço na presença de um campo eléctrico alternado (eletroformação) dá um rendimento elevado da GUVs livres de defeitos, o método inchaço assistida-gel produz uma distribuição de proteína mais homogénea e não requer nenhum equipamento especial.

Introdução

Ao estudar os princípios físicos que regem os sistemas vivos, as abordagens bottom-up permitem um experimentalista para controlar composição do sistema e outros parâmetros que não são facilmente manipulados em sistemas baseados em células ^1. Para os processos baseados em membrana, gigante Vesículas Unilamelares (GUVs, diâmetro ~ 1-100 mm) têm provado ser um sistema muito útil biomiméticos ^2-7 como eles são adequados para estudos de microscopia e micromanipulação ^{de 8 - 10.} Embora existam muitos protocolos diferentes para produzir GUVs, a maioria se dividem em duas categorias - emulsão base aproxima ^11,12 e técnicas baseadas....