Método simples para DNA de Fluorescência In Situ A hibridação com Cromossomos Squashed

Summary

Aqui, apresentamos um método simples para realizar hibridização in situ de DNA de fluorescência (DNA ISH) para visualizar sequências heterocromáticas repetitivas em cromossomos montados em lâminas. O método requer reagentes mínimos e é versátil para uso com sondas curtas ou longas, tecidos diferentes e detecção com sinais baseados em fluorescência ou não fluorescência.

Abstract

ADN de hibridação in situ (ISH ADN) é um método vulgarmente utilizado para mapeamento de sequências para as regiões cromossómicas específicas. Esta abordagem é particularmente eficaz em mapeamento de sequências altamente repetitivas para regiões heterocromáticas, onde abordagens computacionais enfrentam desafios proibitivos. Aqui nós descrevemos um protocolo simplificado para DNA ISH que contorna lavagens formamida que são etapas padrão em outros protocolos de DNA ISH. Nosso protocolo é otimizado para a hibridação com sondas de DNA vertente individuais curtas que levam corantes fluorescentes, o que efetivamente marcam sequências de DNA repetitivas dentro de regiões cromossômicas heterocromáticos através de um número de diferentes tipos de tecidos do inseto. No entanto, os pedidos podem ser estendido para usar com sondas maiores e visualização de sequências de DNA única cópia (não repetitivo). Demonstramos esse método mapeando várias sequências repetitivas diferentes de cromossomos esmagados de Drosophila melanogaster células neurais e Nasoniavitripennis espermatócitos. Mostramos padrões de hibridização, quer para pequenas sondas, sintetizados comercialmente e para uma sonda maior para comparação. Este procedimento utiliza material de laboratório simples e reagentes, e é ideal para os investigadores que têm pouca experiência com a realização de DNA ISH.

Introduction

ADN de hibridação in situ (ISH ADN) é um método vulgarmente utilizado para mapeamento de sequências para as regiões cromossómicas específicas. Sondas para regiões de cópia única dentro euchromatin pode ser gerado através de um punhado de abordagens, incluindo nick-tradução ou de fim-de rotulagem dos produtos de ADN longas ^1,2 ea incorporação de deoxygenin (DIG) nucleotídeos -attached e seu reconhecimento através de uma ampla variedade de anticorpos conjugados do grupo ^1-3. Visualização das sequências eucromáticos em poucos ou número único de cópia requer a utilização quer de sondas individuais grandes, com uma actividade específica elev....

Protocol

1. Dissecção de tecido e fixação (60 min)

1. Para cérebros de Drosophila, colocar larvas ^3rdin uma gota de 1x PBS (solução salina tamponada com fosfato). Escolha grande larvas ^3º que estão rastreando ativamente de frascos ou garrafas que não estão superlotadas.
   1. Use um par ultrafine pinça para agarrar os ganchos na boca e outro par de pinça para agarrar 2/3 para baixo o comprimento do corpo (Figura 1A, B). Puxe delicadamente sobre os ganchos na boca para expor o cérebro, os gânglios ventral, glândulas salivares e parte do trato digestivo das larvas. Use as pinças para separar o cérebro e gânglios ventral ....

Results

Para demonstrar este método, que hibridou um conjunto de pequenos oligonucleótidos sintetizados comercialmente que foram quimicamente modificados com conjugados fluorescentes (Figura 2) e uma sonda mais longa biotinilado (feita através de tradução por cortes de um produto de PCR; Figura 2B), a partir de vários tecidos cromossomas diferente tipos (ver Tabela 1). As sequências alvo incluídas repete satélite localizadas em regiões (pericentroméricas heterocromáticos) de cr.......

Discussion

DNA ISH é freqüentemente usado para mapear sequências específicas para os cromossomas. Nós descrevemos um método simples para o ADN ISH optimizado para elevado número de cópias, sequências de heterocromatina. Em vez de utilizar lavagens numa solução de formamida, que é um requisito em outros protocolos ISH ADN existentes, colocamos lâminas montadas-tecido directamente sobre um bloco de pré-aquecida para desnaturar o ADN. Este método evita o uso de grandes quantidades de formamida. Um passo fundamental para a produção de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lâminas revestidas de poli-L-lisina (lâminas regulares também podem ser usadas)	Pinças ultrafinas Sigma Aldrich
(calibre 5)	Dumont
22 x 22 mm lamínulas de cobertura	Fisher		Sigmacote tratadas por imersão por 15 segundos, secando e limpando todos os vestígios de Sigmacote para que a lamínula fique clara
Sigmacote Sigma
			75 - 150 mm
			de cera de parafina
Bloco de calor com termômetro
Incubadora
Lâminas de
Câmara de umidade			caixa de ponta de pipeta vazia ou Tupperware, forrada com toalhas de papel umedecidas ou
	Coplin		com ranhuras deslizantes
Pipetas
Pasteur de folha
Tubos
Esmalte
Micropipeta P20 transparente ou colorida e pontas
Clipes de			20 - 25 clipes de papel de metal padrão ligados para formar um chain
Reagentes
16% Paraformaldeído de grau EM			microscopia eletrônica
Ácido	acético Sigma
Nitrogênio
100% Etanol, grau
Sintetizado comercialmente, oligos marcados com fluorescência Sonda
longa biotinilada	Invitrogen; Etapas alternativas 2.7.1-2.7.3		por exemplo, nick traduzido e biotinilado com BioNick da Invitrogen
Rhodamine-Avidin	Roche; Etapas alternativas 2.7.1-2.7.3		para detecção de sonda biotinilada longa
Tampão de hibridização	Receita acima
4x SSCT	Receita acima		citrato salino-sódico + Tween
0,1x SSC	Receita acima		de solução salina-sódica
Solução de bloqueio	Receita acima
SBT	Receita acima		SSC, albumina de soro bovino, Tween
1x PBT	Receita acima		solução salina tamponada com fosfato + Tween
1x solução	salina tamponada com fosfato
Solução hipotônica			0,5% de citrato de sódio em H2O
Formamida	Sigma Aldrich
Vectashield meio de montagem com vetor DAPI	Laboratórios