Introduction
وتضم الظهارة الشمية الماوس في تجويف الأنف 6-10٬000٬000 القطبين الخلايا العصبية الحسية الشمية 1. كل عصبون حاسة الشم تختار واحدة من 1،200 جينات مستقبلات الرائحة للتعبير. كشف عطور يبدأ من الرائحة ملزمة لمستقبلات حاسة الشم 2، والذي ينشط ثم أدينيليل محلقة النوع الثالث (ACIII) 3 عن طريق حاسة الشم بروتين معين G Gα جبهة تحرير أورومو 4. ارتفاع الناتج في دوري أحادي فسفات (المخيم) يفتح دوري 2+ تدفق يؤدي (CNG)، قناة الموجبة غير الانتقائية التي تؤدي إلى تدفق الكالسيوم والصوديوم + 2+، وبعد ذلك الكالسيوم بوابات النوكليوتيدات لافتتاح الكلور الكالسيوم 2+ تفعيلها - قناة 5،6. ومما يسهل تدفق من قبل الخلايا الكلور عالية - - مما أدى الكلور الخارج والحفاظ على تركيز ثابت من الكلور - امتصاص، من المحتمل عن طريق نا + / K + / CL - NKCC1 cotransporter، وCL - / HCO3 - مبادل SLC4A1، والناقلين ربما إضافية بعد الكشف عن هويته 6-8.
الخلايا العصبية الشمية القطبين لها واحدة، محاور عصبية غير متفرع أن المشروع مباشرة إلى البصلة الشمية، والتغصنات أن تمتد إلى سطح البشرة وينتهي كما حجرة المتخصصة، ومقبض الباب شجيري. من هذا مقبض الباب، 10-30 أهداب، والتي يمكن أن تصل إلى طول يصل إلى 50-60 ميكرون، تنبثق في المخاط الذي يغطي سطح الظهارية 9. يتم ترجمة البروتينات من الكنسي نقل الإشارة التعاقبي أساسا في غشاء من هذه الأهداب. زيادة السطح الحسي للظهارة تضخيم القدرة على كشف عطور. نظرا لكثافة الخلايا العصبية الحسية، أهداب تمتد من المقابض شجيري المجاورة تختلط. هذا الاختلاط النتائج في خليط عشوائي من أهداب من الخلايا العصبية المختلفة، معربا عن أنواع مختلفة من المستقبلات الشمية، على سطح ظهارة. كشف وخليةتخصيص الجزيئية للبروتينات الهدبية التي هي موجودة فقط في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية غير ذلك من الصعب في cryosections. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التعريب الدقيق لهذه البروتينات على طول الأهداب هو بالكاد ممكنا، منذ cryosections وعادة ما تكون أرق من متوسط طول الأهداب.
لتمكين التحقيق في الهدبية توطين بروتينات الغشاء حتى uncharacterized بكثير في الخلايا العصبية الشمية، ونحن الأمثل لمواجهة أون تقنية إعداد والذي يسمح للتحليل مفصل للبروتين التعريب في أهداب. لفترة وجيزة، وضحى الماوس وتقسيم الرأس بالقرب من خط الوسط. تتم إزالة القرائن، والأنف، وعظام الأمامية لفضح الحاجز. وخففت الحاجز مع الجزء حاسة الشم من ظهارة بطانة عن طريق قطع كافة الاتصالات إلى تجويف الأنف. بعد وضع الحاجز في طبق بتري مليئة حل رينغر، ومقشر ظهارة قبالة اوند نقلها إلى شريحة الزجاج المطلي. بعد fixat قصيرةأيون خطوة والإجراءات المناعية يمكن أن يؤديها إذا المناولة هو لطيف ممكن لتجنب الضرر من الأنسجة الهشة. ونحن لشرح قرار تحقيقه من خلال مقارنة تلطيخ من اثنين من البروتينات الغشاء مختلفة في أهداب الشم في cryosections الكلاسيكية وفي إعداد أون الوجه وصفها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم التعامل مع جميع الإجراءات الحيوانية في شاريتيه أو مستشفى جامعة جينا في اتفاق مع قوانين رعاية الحيوان الألمانية تجنب أي معاناة لا داعي لها من الحيوانات.
1. حلول إعداد وتشريح مكان العمل
- حلول
ملاحظة: إعداد الحلول التالية قبل البدء في تشريح ظهارة.- حلول لإجراء تشريح:
- يعد حل رينغر (درجة الحموضة 7.4) مع تركيز 140 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 10 ملي HEPES، 2 مم CaCl 2، 1 ملم MgCl 2 و 10 ملي الجلوكوز.
- إعداد برنامج تلفزيوني - / - الحل (درجة الحموضة 7.4) مع تركيز 2.68 ملي بوكل، 1.47 ملي KH 2 PO 4، 136 مم كلوريد الصوديوم، و 8.1 ملي نا 2 هبو 4.
- يعد حل تثبيتي (درجة الحموضة 7.2) مع تركيز برنامج تلفزيوني 1X - / - 0.2 ملي CaCl 2، 4٪ سكروز، و 4٪ لامتصاص العرق. السكروز في حل تثبيتي يحسن البردباجتزاء والبيك اب من cryosections. تخزين في -20 ° C.
- حلول لإجراء تلطيخ
- إعداد برنامج تلفزيوني + / + حل مع تركيزات 1X PBS - / -، 0.48 ملي MgCl 2، 0.9 ملي CaCl 2.
- إعداد PBST + / + حل مع تركيزات برنامج تلفزيوني 1X + / + و 0.1٪ تريتون X-100.
- يعد حل حجب مع تركيزات 1X PBST + / + و 1٪ الجيلاتين.
- حلول لإجراء تشريح:
- مكان العمل
- لمكان العمل تشريح، واستخدام المجهر تشريح مع إضاءة ساطعة، وكذلك قلم السائل مانع.
- إعداد طبق بتري، مليئة حل رينغر، والشرائح الزجاجية لاصقة.
- الحصول على الأدوات الجراحية التالية: زوج من مقص جراحي مع واحد حاد واحد غيض حادة، وزوج من مقص الربيع مع شكل طرف على التوالي، وهما ملقط مع غرامة منحني الشكل طرف وشفرة حلاقة (
2. إعداد الأنف الحاجز
- الحيوانات منزل في أقفاص وافق مع الوصول بشكل منتظم إلى الغذاء والماء ودورة اليوم / ليلة المناسبة.
- أداء التخدير في وعاء يحتوي على شاش مغلق غارقة مع 100٪ الأيزوفلورين ورصد تسكين عن طريق اختبار ردود الافعال القدم الخلفية. منذ خلع عنق الرحم يمكن أن يسبب الدم في الجيوب الأنفية، قطع رأس مباشرة الفئران تخدير.
- إزالة الجلد لفضح عظم الجمجمة كلها والأنف، ويمسح الدم والأنسجة المتبقية بدقة باستخدام منشفة ورقية. إزالة الفك السفلي والأسنان الأمامية.
- شق العظام الظهرية من الأنف ثنائيا في 1-2 ملم مسافة موازية لخياطة خط لفصل جانب واحد من الحاجز (إعلامي) من الفك العلوي (أفقيا). تقسيم الأنف مع خفض واحد. إذا لا تزال تعلق بقايا العظام والقرائن إلى الحاجز، وإزالة هذه بعناية لفضح الحاجز تمامادون لمسها.
- إزالة الأنف العظام الظهرية عن طريق تحريك الطرف المنحني غرامة ملقط على طول الجانب الظهري من الحاجز، بين الحاجز وعظم الأنف. تطبيق ضغط طفيف على العظم، ودفع عنه وإزالته.
- لتوفير الوصول إلى اثنين من الأنسجة الحاجز، واحد من كل تجويف، وإزالة بعناية الفك العلوي من الجانب الآخر من الرأس. عند إعداد الحيوانات القديمة (P> 28)، وإزالة غيض من العظم الجبهي تغطي بصيلات الشم.
- تحديد الظهارة الشمية التي كتبها لونه أصفر قليلا (الشكل 1B). ظهارة الجهاز التنفسي المتاخمة بيضاء ويظهر حركة أهداب متحركة التي يمكن رؤيتها تحت المجهر تشريح. قطع على طول الحدود بين الظهارة الشمية والجهاز التنفسي مع زوج من مقص الربيع الجميلة.
- تمديد قطع وفصل الحاجز من الاتصال بطني حتى العظم الميكعة. ثم قطع على طول الحدود بين الحاجز والمصفوية الصفيحة الغربالية من نظام التشغيله. والآن معزولة الحاجز تماما من كافة الاتصالات في الرأس. استخدام مواقع القطع هو مبين في الشكل 1C.
3. عزل الظهارة الشمية لالمناعية
- وضع شريحة زجاجية لاصقة في طبق بتري مليئة حل رينغر. وضعه على حافة طبق بتري، حتى أن نصف واحد من الزجاج يكمن في الحل (الشكل 1A) رينغر.
- استخدام ملقط لنقل بعناية العظم الغربالي مع الظهارة الشمية إلى طبق بتري. رفعه دون الاستيلاء عليه مع نصائح ملقط.
- الاستيلاء على لوحة عمودية من عظم الغربالي مع واحد ملقط واستخدام ثانية واحدة لإزالة بعناية ظهارة من جانب واحد من الحاجز. حرك الطرف المنحني بين لوحة عمودية وظهارة لقشر ظهارة قبالة.
- تأكد دائما للتعرف على الجانب الهدبية، في حالة الظهارة تقلب في soluti رينغرعلى. إذا تقلب ظهارة، فإنه يكاد يكون من المستحيل تحديد الجانب الهدبية بعد ذلك. في الغالب، ظهارة تتحرك مع سطح الهدبية في الداخل.
- مقارنة بين شكل الأنسجة المسجلين مع المواقف القطع هو مبين في الشكل 1C. الاستيلاء على ظهارة في موقف على الحدود وسحب وضعها على شريحة زجاجية. لا تلمس الجانب الهدبية مع ملقط لتجنب آفات الأنسجة.
- تحويل الحاجز وكرر الإجراء مع ظهارة من الجانب الآخر.
- تجفيف شريحة زجاجية حول كل قطعة من الظهارة الشمية مع منشفة ورقية وتطويق الأنسجة بالقلم السائل مانع.
- إصلاح الأنسجة مع 150 ميكرولتر حل تثبيتي لمدة 10 دقيقة في RT. وفيما يتعلق استقرار أهداب والنزاهة، استخدام مرة تثبيت قصيرة لمجموعة متنوعة من الأجسام المضادة التي تم اختبارها. ضمن هذه 10 دقيقة أهداب يتم إصلاحها، ولكن ربما لا الأنسجة الطلائية بأكملها. وهكذا، تصور فوري مع المجهر لاحقا إلى لياليtaining الإجراء. ومع ذلك، قد تختلف الأوقات تثبيتي عن الأجسام المضادة الفردية.
4. بروتوكول تلطيخ
ملاحظة: التعامل مع الأنسجة بعناية فائقة للحفاظ على الهياكل الهدبية من الخلايا العصبية الحسية الشمية. إزالة الحلول من قبل pipetting. لا تسقط أي حلول مباشرة على البشرة، والقوى الميكانيكية يمكن أن يعطل أهداب على ما يرام. تنفيذ جميع الخطوات في RT إذا لم ينص على خلاف ذلك.
- إزالة الحل تثبيتي، ويغسل 2 مرات مع برنامج تلفزيوني + / +.
- احتضان ظهارة لا يقل عن 1 ساعة مع عرقلة الحل.
- يعد حل الأجسام المضادة الأولية عن طريق إذابة الأجسام المضادة في عرقلة الحل (1: 200 عن الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة لإزالة أي رواسب.
- احتضان ظهارة مع حل الأجسام المضادة في غرفة رطبة عند 4 درجة CO / N.
- غسل البشرة مع PBS + / + لمدة 5 دقائق على الأقل 3 مرات.
- إعداد الحل الضد الثانوية عن طريق إذابة الأجسام المضادة في عرقلة الحل (1: 500) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة.
- احتضان ظهارة مع الحل الضد الثانوية لمدة 1 ساعة في غرفة مظلمة.
- غسل البشرة مع PBS + / + لمدة 5 دقائق على الأقل 3 مرات.
- إزالة مانع السائل بشفرة حلاقة أو منشفة ورقية. غسل البشرة بالماء المقطر لمدة 5 ثوان.
- الحفاظ على الأنسجة في antifade كاشف المتزايدة.
ملاحظة: زيادات خلفية مضان بسرعة خلال أيام؛ لذا يوصى تحليل مجهري في موعد لا يتجاوز 2 بعد أيام التضمين في تصاعد المتوسط. رعاية خاصة يجب أن يؤخذ وليس للضغط على الأنسجة عند البحث البؤري الصحيحة، لأنها يمكن أن يلحق ضررا شديدا التحضير. بسبب خارج التركيز مضان، ويوصى مزيد من التحقيقات مع المجهر متحد البؤر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الظهارة الشمية أون الاستعدادات الوجه يمكن استخدامها لتحقيق توطين البروتينات في أهداب الخلايا العصبية الحسية، والسماح للتحقيق مفصل من البروتينات التي التوطين غير واضح بعد تحليل cryosections. ويمكن إيراد أمثلة على هذه المشكلة في حالة تلطيخ لكين من مثل IRRE بروتين 2 (Kirrel2). Kirrel2 (وتسمى أيضا Neph3) هو عضو في الغلوبولين المناعي (IG) الفصيلة من بروتينات الغشاء ووظائفها، وبروتين التصاق مقتصر على المطابق. وقد تبين أن تلعب دورا في محور عصبي التوجيه في نظام حاسة الشم، ويتم التعبير عنها في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الشمية في نشاط بطريقة تعتمد 10.
المناعية لKirrel2 في cryosection نموذجي من خلال الظهارة الشمية كشف توطين Kirrel2 في محاور عصبية، سوما والتشعبات (الشكل 2A). تم إعداد جميع الحلول كما هو موضح أعلاه لوجه أون تقنية التحضير. ورغم أن بعض لترabeling يظهر على الجزء العلوي من طبقة تتألف من المقابض شجيري، ظل الهدبية توطين غير مؤكد بعد تحليل cryosections. بعض الخلايا العصبية أظهرت تلطيخ في وحول مقبض الباب على حاسة الشم، ولكن كانت أهداب واحدة يصعب التعرف عليها. في المقابل، أون إعداد وجه الظهارة الشمية تنفيذها وفقا لبروتوكول المذكورة أعلاه أظهر بشكل لا لبس فيه الهدبية توطين Kirrel2 (الشكل 2B). ومن المثير للاهتمام، وأعرب عن Kirrel2 فقط في أهداب من مجموعة فرعية صغيرة نسبيا من الخلايا العصبية الشمية، على الرغم من أن تحليل cryosections الملون أظهر التعبير في نسبة أكبر بكثير من الخلايا العصبية. وعلاوة على ذلك، فإن EN إعداد وجه لم تثبت فقط الهدبية تلطيخ بشكل عام، ولكن كشف التغيرات في أنماط التعبير الهدبية تتراوح بين الخلايا العصبية مع العديد من أهداب طويلة إلى الخلايا العصبية مع عدد قليل فقط أهداب القصير. في بعض الخلايا، تم الكشف عن Kirrel2 في مقبض الباب شجيري، ولكن ليس في أهداب تمتد من هذه مقبض الباب. ج ause وأهميتها الوظيفية من هذه النتيجة لا يزال يتعين توضيح، لكنه يوضح إمكانيات أون إعداد وجها لتقديم رؤى جديدة في الترجمة البروتين في النظام الشمي.
وبالإضافة إلى ذلك، أجرينا المناعية لمستقبلات حاسة الشم مور-EG، التي يسلك الهدبية قوي التعبير 11. مستقبلات هو بالفعل التعرف بشكل واضح في طبقة الهدبية في cryosections (الشكل 3A). ومع ذلك، وتحليل خصائص مفصلة، مثل عدد أهداب في مقبض الباب أو طول أهداب الفردي غير ممكن. باستخدام أون الوجه إعداد، وتحديد أهداب الخلايا العصبية من التعبير عن مستقبلات حاسة الشم من الممكن بسهولة (الشكل 3B، C). أون إعداد وجهه لا يمكن أن يؤديها مع الحيوانات من مختلف الأعمار. كانت ملطخة بنجاح حتى أهداب من الحيوانات قبل الولادة وتصور (الشكل 3D).
المحتوى "> أون الاستعدادات الوجه بالتالي تمثل أداة مناسبة تماما لتحليل مورفولوجيا الهدبية وتوطين البروتينات الهدبية معروفة بالتفصيل.
الشكل 1. إعداد رئيس الماوس. (A) ترتيب مكان العمل تشريح. شغل في طبق بتري مع الحل رينغر ويحمل شريحة زجاجية لاصقة. وأوصى الأدوات الجراحية لإعداد أون الوجه. (B) بعد إزالة نصف واحد من الرأس الماوس، يتعرض الحاجز. وهي مغلفة الحاجز مع الظهارة الشمية (OE) وظهارة التنفسية (RE). OB: البصلة الشمية، V: الجهاز الميكعي الأنفي (C) لعزل جزء من الحاجز اصطف مع الظهارة الشمية، وقطع الحاجز على طول خطوط تظاهر مع زوج من مقص غرامة. الصورة: //www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مقارنة بين Kirrel2 المناعية في cryosections وEN الاستعدادات الوجه. (A) متحد البؤر صورة (بحد أقصى الإسقاط) من يوم ما بعد الولادة 60 (P60) cryosection immunostained لKirrel2 يكشف الترجمة البروتين في الخلايا العصبية الحسية الشمية. تظهر المقابض حاسة الشم واحدة تلطيخ قوي وKirrel2 يفترض توطين في أهداب (النجمة)، ولكن غير مؤكد. (B) صورة متحد البؤر (بحد أقصى الإسقاط) من ظهارة P65 حاسة الشم أون إعداد وجه المعارض اضح Kirrel2 تلطيخ في أهداب من مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية الشمية . (الحانات مقياس، 10 ميكرون)9 / 52299fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. مقارنة مور-EG المناعية في cryosections وEN الاستعدادات الوجه. (A) متحد البؤر صورة (بحد أقصى الإسقاط) من cryosection P60 immunostained لمستقبلات حاسة الشم مور-EG. الهدبية التعريب هو بالفعل كشف. (B) صورة متحد البؤر من P65 أون إعداد وجه immunostained لمستقبلات حاسة الشم مور-EG. وأعرب عن مور-EG بقوة في أهداب من مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية الشمية. وعلى النقيض من cryosections، وخصائص أهداب المتعلقة طول، وعدد من أهداب في يمكن تحليلها مقبض الباب والمحدد الترجمة البروتين. (C) التكبير العالي في المنطقة محاصر في (B). (D) Confocآل صورة ليوم الجنينية 18 (E18) EN إعداد وجه immunostained لمستقبلات حاسة الشم مور-EG. ويمكن بوضوح أن ينظر إلى تلطيخ للأهداب. (الحانات مقياس، 10 ميكرون) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P.
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
