Artigo de método

In vitro caracterização funcional de Rato Colorretal Aferente Endings

DOI:

10.3791/52310

⸱

21 de janeiro de 2015

 , 
1Center for Pain Research, Department of Anesthesiology, University of Pittsburgh

Neste artigo

Resumo

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Este vídeo demonstra um protocolo para a realização de gravações eletrofisiológicas de fibra única em uma preparação in vitro do nervo colorreto de camundongo.

Resumo

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Este vídeo mostra em pormenor um protocolo de fibra única gravação electrofisiológico in vitro utilizando uma preparação colorectum rato-do nervo. A abordagem permite a identificação imparcial e caracterização funcional de aferentes colorretais individuais. Gravações extracelulares de potenciais de acção propagadas (APs) que se originam a partir de um ou alguns aferente (ou seja, de fibra única) campos receptivos (RFS) na colorectum fascículos são feitos de fibras nervosas provocavam. O colorectum é removido quer com o pélvica (PN) ou splanchnic lombar (LSN) do nervo ligado e abertos longitudinalmente. O tecido é colocado numa câmara de registo, fixado plana e perfundidas com solução de Krebs oxigenada. Estimulação elétrica Focal é usado para localizar as terminações aferentes colorretais, que são ainda mais testadas por três estímulos mecânicos distintos (sem corte sondagem, acariciando mucosa e stretch circunferencial) para categorizar funcionalmente os aferentes em cinco mechanosensiaulas operatório. Endings respondendo a nenhum desses estímulos mecânicos são classificados como aferentes mecanicamente insensíveis (MIAs). Ambos mechanosensitive e MIAs pode ser avaliado para a sensibilização (ou seja, a resposta melhorada, limiar reduzida e / ou aquisição de mecanosensibilidade) por exposição localizada entre os FR para produtos químicos (por exemplo, sopa inflamatória (IS), a capsaicina, trifosfato de adenosina (ATP)). Nós descrevemos o equipamento e preparação de gravação colorectum-nervo, colheita de colorectum com anexado PN ou LSN, identificação de FR no colorectum, gravação de fibra única de fascículos, e aplicação localizada de produtos químicos para a RF. Além disso, os desafios de preparação e aplicação de estimulação mecânica padronizada também são discutidos.

Introdução

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Dor e hipersensibilidade são predominantes as queixas dos pacientes que sofrem de desordens gastrointestinais funcionais, incluindo o síndrome do intestino irritável (IBS), que existem na ausência de pathobiological causa aparente ou danos nos tecidos. Por exemplo, pacientes com SII exibem hipersensibilidade, incluindo respostas intensificadas para distensão rectal balão e aumento da sensibilidade na função normal do intestino, bem como a hipersensibilidade de referência somáticas (isto é, sensibilidade à palpação da zona abdominal) 1. Porque direccionamento aferentes colorectal tem provado ser eficaz no alívio da dor e hipersensibilidade em pacientes com IBS (por exemplo, a instilação intra-rectal de anestésicos locais 2,3; ingestão oral da guanilato ciclase C-agonista linaclotide 4-6), uma melhor compreensão do inervação aferente do colorectum é importante.

Aferentes viscerais, incluindo aferentes colorretais, São capazes de responder às modalidades químicos / em nutrientes e térmicos (por exemplo, 7-9). No entanto, aferentes viscerais que respondem a estímulos mecânicos (ou seja, aferentes mechanosensitive) ter sido o mais estudado porque estímulos mecânicos (por exemplo, distensão luminal, estiramento) são aqueles que normalmente dão origem a sensações conscientes, incluindo desconforto e dor 10-16. Além disso, as vísceras também são inervados por aferentes insensíveis mecanicamente (MIAs), vulgarmente designados por silenciosas ou dormir nociceptors 17. Em condições fisiológicas normais, MIAs não respondem ao estímulo mecânico ou ter resposta muito alta limiares 18, mas pode se tornar ativo e adquirir mecanosensibilidade em condições fisiopatológicas e contribuir para a hipersensibilidade.

Usando a preparação in vitro e protocolo descrito aqui, nós desenvolvemos e empregou uma estratégia de estímulo elétrico para o mar RCH para terminações receptivas, permitindo a identificação imparcial de ambas as terminações mechanosensitive e MIA no colorectum 19. A inervação colorectal é derivado splanchnic lombar (LSN) e do nervo pélvico (PN) vias, e inclui aferentes colorretal que podem ser classificados em cinco classes mechanosensitive (serosa, mucosa, muscular, músculo-mucosa, mesentérica) e uma classe MIA 20. Usando esta preparação in vitro, verificou-se que MIAs colorretais adquirido mecanosensibilidade (sensibilizar) após uma breve exposição de seus campos receptivos a uma sopa inflamatória (IS), que sensibilizados 71% dos MIAs na via PN e 23% das MIAs na via LSN 19. Nós também documentada sensibilização a longo prazo (até 28 dias) de MI As no contexto da hipersensibilidade visceral comportamentais de longa duração (isto é, nos ratos que receberam os tratamentos com zimosan intracolónica 21 ou ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico (TNBS) 22) .

jove_content "> Entre aferentes mechanosensitive, aferentes musculares e muscular-mucosas são as únicas classes que tonicamente codificam trecho circunferencial da colorectum (ou seja, são stretch-sensitive) e servir à codificação de nocivo distensão colorectal 23,24. Usando um computador controlado- força do actuador, foi aplicado um padrão, homogénea e reprodutível em rampa estiramento na direcção circunferencial do tecido colorectal achatada e mais categorizados aferentes sensíveis ao estiramento tão baixo limiar e de alto limiar 23. Além disso, o curso de tempo da sensibilização de estiramento aferentes sensíveis ao após zymosan intracolônica 21 ou 22 TNBS tratamento corresponde ao início, persistência e / ou recuperação de hipersensibilidade visceral comportamental, sugerindo um papel de aferentes colorretais sensíveis ao estiramento na dor visceral e hipersensibilidade.

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Protocolo

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NOTA: Este protocolo foi revisto e aprovado pela Universidade de Pittsburgh Institutional Animal Care e do Comitê Use.

1. Preparação da solução de Krebs modificado e teste de droga Alíquotas

  1. Adicione 6 L de solução de Krebs modificada, que contém (em mM): NaCl 117,9, KCl 4,7, NaHCO3 25, 1.3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO4, 2,5 CaCl2, 11,1 de D-glucose, 2 butirato de sódio, acetato de sódio 20 , 0,004 nifedipina (para bloquear as contracções espontâneas do músculo), 0,003 e indometacina (para bloquear a síntese de prostaglandinas endógenas). Utilizar soluções ice-frias e quentes Krebs para dissecção dos tecidos e gravação de fibra única, respectivamente.
  2. Preparar todas as soluções químicas (por exemplo, IS, capsaicina, ATP) em alíquotas a concentrações desejadas.

2. dissecção do tecido colorectum nervo-

  1. Anestesiar e eutanásia ratos machos (6-8 semanas de idade, 20 - 30 g) emuma câmara de CO 2 a um caudal que desloca 10 - 30% do volume da câmara por minuto até que os ratinhos parar de respirar completamente, como indicado pela ausência do movimento do tórax.
  2. Imediatamente após a eutanásia, desangrar, cortando abrir a caixa torácica, perfurando o átrio direito, e imergindo a carcaça do mouse em um amplo volume de (~ 500 ml) de gelado Krebs solução (4 ° C) aeradas com carbogênio (95% O 2 , 5% de CO 2).
  3. Remova cuidadosamente todas as vísceras, mas os dois pontos e pélvicas órgãos. Transecto o mouse pela metade em todo o segmento da coluna vertebral T12 ligeiramente acima do diafragma torácico e transferir a metade caudal para uma câmara de dissecção contendo gelo frio, borbulhar solução Krebs.
  4. Sob um microscópio estereoscópico, remover a bexiga e os órgãos reprodutivos, ao seccionar os seus cruzamentos para a uretra, e remova o descendente / aorta abdominal até que se bifurca em artérias ilíacas comuns. Livre o PN ou o LSN de seu surrounding tecidos por dissecção romba e siga o nervo do lado de fora da crista ilíaca até o seu ponto de entrada ventral na L6 e S1 coluna vertebral (por PN) ou T13 e L1 coluna vertebral (por LSN).
  5. Corte a sínfise púbica e à direita e articulações do acetábulo esquerda, e remova o osso ilíaco. Cuidadosamente livre tanto o PN ou LSN do músculo ligado e do tecido conjuntivo de perto da colorectum até onde o nervo entra na coluna vertebral.
  6. Ressecar cuidadosamente o osso ilíaco para expor o colorectum distal. Dissecar o colorectum distal com o PN anexado ou LSN no continuum.
  7. Transferir a colorectum com o nervo ligado ao compartimento da câmara de banho de tecido. Remover excesso de tecido conjuntivo por mais dissecação, e abrir o colorectum longitudinalmente ao longo da fronteira anti-mesentérica.
  8. Com o lado da mucosa voltada para cima, o pino da borda mesentérica do colorectum adjacente ao compartimento de gravação para a base de silicone da chamber e anexar o comprimento antimesentérica do colorectum a um ancinho de ganchos ligados a um actuador de força (ilustrada na Figura 1 e fotografado na Figura 2A).
  9. Estender o LSN PN ou no compartimento de gravação, o qual está ligado ao compartimento de banho por um buraco de rato e portão. Cuidadosamente, coloque o tronco do nervo sobre um espelho de vidro pequeno no compartimento de gravação, o que proporciona uma superfície hidrófila para o nervo para aderir. Superfuse compartimento do banho com água morna (30-32 ° C), solução de Krebs oxigenada e encher o compartimento de gravação com óleo mineral.

Gravação 3. Single-fibra e localização do campo receptivo

  1. Retire cuidadosamente de volta o epineuro (bainha do nervo) do PN ou LSN, ao microscópio estereoscópico em alta ampliação (50 - 60X). Usando uma pinça fina, provocar o tronco do nervo em 5-8 feixes de nervos de ~ 100 m de espessura.
  2. Coloque a referência de platina-irídioeléctrodo em contacto com a solução de Krebs na câmara de tecido. Sequencialmente colocar os feixes de nervos individuais sobre o eléctrodo de gravação feitos do mesmo material.
  3. Use um pincel macio para evocar APs dos aferentes colorretais por acariciando acima e abaixo da superfície colorectal. Localize o pacote (s) de nervos que inervam o cólon através AP detectável (potencial de ação) gravações.
    NOTA: A PN e LSN também inervam a bexiga e outros órgãos pélvicos.
  4. Use um par de 30 g pontas de agulha para dividir ainda mais o feixe de nervos em filamentos finos fascículo de ~ 10 mm de espessura e coloque um filamento indivíduo para o eletrodo de registro.
  5. Coloque o eletrodo concêntrico rodada de ponta perpendicular à superfície da mucosa para excitar eletricamente terminações aferentes na intensidade suprathreshold estímulo (10 mA magnitude, 0,5 duração ms @ 0,3 Hz), que produz um raio de propagação mm atual ~ 2. Mova o eletrodo sistematicamente (~ 1,5 passos mm) Ao longo do comprimento e largura do colorectum achatadas para localizar terminações receptivas.
  6. Quando um final aferentes está animado, ajustar a posição do eletrodo para identificar o local da ativação (campo receptivo, RF) que requer intensidade mínima de estímulo (limiar de estímulo). Descarte terminações com um limiar de estímulo> 3 mA 19.
  7. Calcula-se a velocidade de condução (CV) a partir de 1) a distância entre o eléctrodo estimulante no campo receptivo (RF) e o local de gravação e 2) o atraso na condução (por exemplo, a Figura 2B) entre o artefacto de estímulo e o aparecimento do potencial de acção .
    CV (m / s) = distância (mm) / atraso de condução (ms).

4. Classificação Funcional de Mechanosensitive colorretais Aferentes

  1. Depois de localizar um RF pela estimulação elétrica, aplicam-se as seguintes três estímulos mecânicos para a RF:
    1. Conduzir o estímulo sondagem pressionando a ponta de uma calibrated von Frey-like monofilamento de nylon (0,4 e 1 g vigor) perpendicularmente ao RF na colorectum achatada.
    2. Conduzir o estímulo acariciando acariciando gentilmente a mucosa retal com uma multa fio de nylon de filamento (10 mg vigor) para gerar uma pequena tensão de corte superficial na RF.
    3. Conduzir o trecho circular usando uma força atuador controlado por computador, o que proporciona uma força trecho em rampa (0-170 mN em 5 mn / seg) em direção circunferencial ao longo da borda anti-mesentérica do colorectum via o rake de ganchos descritos no passo 2.8 .
  2. Classifique aferentes como serosa (responder apenas a despontar sondagem), mucosa (responder a mucosa acariciando e neutralizar sondagem), muscular (responder ao estiramento circunferencial e neutralizar sondagem) muscular / mucosa (responder ao estiramento circunferencial, mucosa acariciando e neutralizar sondagem), ou MIA (não responsivos a qualquer um dos três estímulos mecânicos).
  3. Para aferentes mesentéricos (apenas eminervação LSN) que são difíceis de ativar seletivamente pela estimulação elétrica, localize suas terminações receptivas acariciando mecânica / sondagem do mesentério.
  4. Para aferentes sensíveis ao estiramento muscular e muscular (-mucosas), determinar o limiar de resposta, que é definida como a força que evoca o primeiro AP durante trecho em rampa.
  5. Para aferentes serosa, gravar as suas respostas a ascendente níveis de pontuada sondagem do campo receptivo impulsionado pela força do atuador controlado por computador.

5. Chemical Aplicação / Modulação da Endings Receptivo

  1. Grave uma resposta de linha de base a um estímulo mecânico (ou seja, a resposta ao trecho em rampa, pontuada de sondagem, ou mucosa carícias).
  2. Revestir a borda inferior de um pedaço de tubo (latão ou aço inoxidável, 10 mm de altura e 4 x 4 mm 2 quadrado ou 4 - 5 mm de diâmetro) com vaselina e colocá-lo sobre o campo receptivo no colorectum.
  3. Removera solução de Krebs no interior do tubo, e exponha o fim receptivo para o 3 - 5 min a 170 ul da solução que contém o produto químico (s) a ser testado.
  4. Monitorar a resposta das vias aferentes durante a aplicação de produtos químicos (aferentes são alguns quimiosensível).
  5. Remover a solução química e tubos para terminar a acção do produto químico. Dentro de 4-6 min, testar a resposta de aferentes ao mesmo estímulo mecânico como na resposta de linha de base.
  6. Reaplique o estímulo mecânico novamente após período suficiente de wash-out (> 15 min).

6. spikes Gravação e Discriminando AP

  1. Digitalizar os sinais elétricos gravados a partir de axônios em 20 kHz e salvar os dados para um computador. Monitorar o sinal on-line por um monitor de áudio.
  2. Analisar os pontos AP off-line e discriminar unidades individuais com base em análise de componentes principais das formas de onda de pico individuais 25.
    NOTA: Um registro não deve conter mais thum duas unidades activas facilmente discrimináveis.

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Resultados

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A configuração está ilustrada na Figura 1. Ela inclui uma câmara de tecido feito à medida que abriga o colorectum num compartimento de banho revestido de silicone e o nervo ligado num compartimento cheio com óleo mineral contígua. A câmara de dois compartimentos foi usinado a partir de um bloco sólido de plástico acrílico por uma máquina CNC; parte inferior de ambos os compartimentos foi posteriormente revestido com silicone firme para permitir a fácil pin para baixo do tecido colorretal. APs extracelul...

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Discussão

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A preparação in vitro colorectum-nervo descrito aqui tem provado ser uma abordagem poderosa para estudar funções de codificação neural de aferentes colorretais individuais, que bem complementa outras abordagens não-funcionais (por exemplo, estudos celulares, moleculares e histológicos) sobre os neurônios sensoriais viscerais ( veja o comentário 27 para detalhes). Mecanismos neuronais que contribuem para a nocicepção e hipersensibilidade colorectal longo prazo foram revelados e manipulações f...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Apoiado pelo prêmio NIH R01 DK093525 (GFG). Agradecemos imensamente a revisão científica e a edição gramatical do manuscrito pela Dra. Amber Shaffer (Universidade de Pittsburgh) e agradecemos a Michael Burcham pela ajuda na preparação das figuras.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio estéreo Leica MZ16Leica Microsystems Inc.
Câmera Leica IC DLeica Microsystems Inc.
Instrumentos de precisão do mundo do amplificador, Inc.SYS-DAM80Amplificador diferencial de baixo ruído
Câmara de tecido de dois compartimentos
Cambridge Electronic Design LimitedPower1401Aquisição de dados, entrada/saída de sinal analógico
Spike2 v5.02Cambridge Electronic Design Pacote desoftware limitado
NatusAm
Estimulador de pulso quadradoNatusS48Para fornecer estímulos elétricos
Unidade de isolamento fotoelétricoNatusPSIU6Isolamento de estímulo para reduzir o ruído
Microeletrodo bipolar concêntricoFHC Inc.CBFFG75Para fornecer estímulos elétricos
Sistema de alavanca de modo duploAurora Scientific Inc.Série 300CPara fornecer estímulos mecânicos
FórcepsFine Science Tools11252-00Fórceps com pontas finas
Power1401 que funciona com o monitor de áudio Power14018

Referências

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