O objetivo desta técnica é permitir que os pesquisadores realizem dissecação, imunocoloração e montagem de discos oculares de Drosophila melanogaster de qualquer idade.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
O disco ocular de Drosophila melanogaster é um sistema poderoso que pode ser usado para estudar muitos processos biológicos diferentes. Ele contém aproximadamente 800 unidades oculares separadas, denominadas ommatídeos1. Cada omatídio contém oito fotorreceptores neuronais que se desenvolvem a partir de células indiferenciadas após a passagem do sulco morfogenético no terceiro ínstar larval2. Após a diferenciação sequencial dos fotorreceptores, desenvolvem-se células não neuronais, incluindo células cone e pigmento, juntamente com células de cerdas mecanossensoriais3. Os processos finais de diferenciação, incluindo o arranjo estruturado de todos os tipos de células omatidiais, a morte celular programada de tipos de células indiferenciadas e a expressão de rodopsina, ocorrem durante a fase de pupa4-7. Essa técnica se concentra na manipulação do disco ocular da pupa, fornecendo informações e instruções sobre como dissecar o disco ocular durante a fase de pupa, que é inerentemente mais difícil de executar do que o disco ocular do terceiro ínstar comumente dissecado. Essa técnica também fornece detalhes sobre a imunocoloração para permitir a visualização de várias proteínas e outros componentes celulares.
Introdução
Os campos de biologia do desenvolvimento e celular têm sido grandemente impactada pelo organismo modelo: Drosophila melanogaster. Dentro desse modelo, os estudos sobre o disco olho têm contribuído uma grande quantidade de conhecimento a respeito de sinalização, biologia celular e outras áreas. O terceiro disco instar larval olho ultimamente tem sido estudado extensivamente e é um modelo poderoso de utilizar, uma vez que dá um instantâneo de uma série de períodos de desenvolvimento, cada um com suas moléculas e processos de sinalização único, como o sulco morfogenético progride através do disco olho 8. No entanto, existe uma necessidade para expand....
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Protocolo
Este procedimento é um procedimento de dois dias.
Dia 1 (2 horas + tempo dissecando)
1. Pupal Disco Eye Dissection
- Selecione uma pupa para dissecção.
NOTA: A idade da pupa a ser dissecado será determinado pelas necessidades experimentais. No entanto, se examinar a morfologia das células, isto é frequentemente realizado a 42 horas após a formação pupário (APF) a 25 ° C, que é a idade do pupas mostrado no vídeo. Colete pupas branco (considerado APF 0 hr) com um pincel molhado e organizá-los em ordem cronológica (com base no tempo de coleta) em um novo frasco alimentos mosca mantida a 25 ° C. Dissecar....
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Resultados
Como um exemplo da utilização deste protocolo, que ilustra os resultados midpupal (42 horas APF a 25 ° C) discos oculares imunocoradas com anticorpos diferentes são apresentadas na Figura 2. Ao utilizar um anticorpo dirigido contra os resíduos fosfotirosina, a membrana das células podem ser observado (Figura 2A). Isto pode ser usado para identificar o arranjo regular de células ommatidial no olho de pupa seguindo os processos de padronização finais que ocorrem antes da fase de midpupal. Uma outra imagem.......
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Discussão
Embora pareça que o processo é simples e fácil de executar, na realidade, essa técnica requer muita prática para dominar. Rotineiramente, começamos os alunos aprendendo a dissecar e montar discos oculares de terceiro ínstar12, que são muito mais fáceis de trabalhar. Essa prática ajuda a desenvolver uma posição de dissecção adequada dos braços, mãos e dedos13 para que a manipulação da pinça sob o microscópio de dissecação seja estável, fácil e experiente. Em essência, o período de prática deve ati.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos e gostaríamos de agradecer ao Howard Hughes Medical Institute pelo prêmio HHMI Professor à UB, que tornou este projeto possível. Agradecemos à faculdade da Universidade da Califórnia, em Los Angeles, por fornecer instalações e suporte de infraestrutura de ensino para este trabalho. O trabalho também foi apoiado com financiamento da Midwestern University e uma generosa doação do Charity Fidelity Gift Fund. Agradecemos a John VandenBrooks pelos comentários sobre o manuscrito e a Krista Pearman por sua assistência técnica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) | 80 g de NaCl, 2g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, Traga o volume para 1 μ l, ajuste o pH para 7,4, esterilize em autoclave ou filtro, dilua para 1x PBS com ddH2O autoclavado antes de usar. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Cuidado: Irritante! Use luvas. |
| 0,3% PBT | 1,5 ml de Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| Solução de formaldeído a 37% | Fisher Scientific | F75P1GAL | Cuidado: Tóxico, provável carcinógeno humano! Use luvas. |
| Corrigir solução | (≈ 4% de formaldeído em PBS) 50 μ l de 37% de formaldeído, 450 μ l 1x PBS, faça fresco antes de usar | ||
| Soro de cabra normal | Anticorpos e ensaios Rockland | B304 | Alíquota em volumes de 1 ml e armazene a -80 &# 176; |
| Solução | 10% NGS em PBT. Isso pode ser feito e armazenado a 4 &graus; C por alguns dias antes de usar. | ||
| Solução de estoque DAPI | Life Technologies | D3571 | Para núcleos de coloração externa. Preparar uma solução de 1 mg/ml com ddH2O. |
| VectaShield Montagem | Média Vector Labs | H-1000 | Montagem média |
| Glicerol | Sigma | G5516 | Para montagem. Prepare a diluição de 70% com ddH2O. |
| Equipamento | |||
| Misturador de nutação | VWR | 82007-202 | Usado para balançar o tecido em um prato de vidro de 3 poços |
| Kit de elastômero de silicone SylGard 182 | Krayden | NC9897184 | Usado para fazer prato de dissecação de silicone |
| Prato | de dissecação de siliconeMisture o kit de elastômero Sylgard (acima) de acordo com as instruções suavemente (para evitar bolhas). Despeje a mistura em uma placa de Petri (qualquer tamanho). Permita que o SylGard cure durante a noite em 37 > C. | ||
| Prato de vidro de 3 poços | Corning | 7220-85 | A variedade de 3 poços destes não está mais disponível, este é o produto de 9 poços. |
| Minibandeja de micropoços de 72 poços | Nunc | 438733 | |
| Pinça afiada (Dumont #55) | Ferramentas de Ciência Fina | 11255-20 | |
| Micro Tesoura tipo Vannas, Reta, lâmina de 5mm | Ted Pella | 1346 | |
| 100 mm Capilares de vidro borossilicato | World Precision Instruments | 1B100-4 | Puxe com o extrator de agulha para fazer uma ponta de ponta fina que permite que um pequeno fluxo de PBS flua. |
| Pipetas de transferência descartáveis, ponta fina | Samco Scientific | 231 | |
| As dimensões da tubulação fornecidas são diâmetro interno (ID) x diâmetro externo (OD) x espessura da parede em polegadas | |||
| Tubulação de PVC (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Use-as com agulha puxada para montar o tubo do soprador, conforme mostrado na Figura 2. |
| Tubo de Silicone Tygon (3/32 x 5/32 x 1/32) | Plásticos de Performance Saint Gobain | ABW00004 | |
| Tubo de Silicone Tygon (1/32 x 3/32 x 1/32) | Plásticos de Performance Saint Gobain | ABW00001 |
Referências
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the ....
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Reimpressões e permissões
