Aqui, apresentamos um protocolo explicando o uso da microscopia de força da sonda Kelvin como uma ferramenta para gerar mapas de potencial de superfície em nanoescala de alta resolução. Esta ferramenta foi aplicada para avaliar o papel do potencial superficial na capacidade de ligação de microrganismos às superfícies do substrato.
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Artigo de método
Superfície de Medição de Potencial de Bactérias Usando Kelvin Probe Microscopia de Força
Neste artigo
Resumo
Resumo
Potencial de superfície é uma característica física geralmente negligenciado que desempenha um papel dominante na adesão de microorganismos para substrato superfícies. Microscopia de força sonda Kelvin (KPFM) é um módulo de microscopia de força atômica (AFM), que mede a diferença de potencial entre as superfícies de contato na escala nano. A combinação de KPFM com a AFM permite a produção simultânea de potencial de superfície e mapas topográficos de amostras biológicas, tais como células bacterianas. Aqui, nós empregamos KPFM para examinar os efeitos do potencial de superfície sobre a adesão microbiana em superfícies medicamente relevantes, tais como aço inoxidável e ouro. Mapas de potencial de superfície revelou diferenças de potencial de superfície para membranas microbianas em diferentes substratos de materiais. Um gráfico passo-a altura foi gerado para mostrar a diferença de potencial na superfície uma área de fronteira entre a superfície do substrato e microrganismos. Alterações no potencial de membrana da superfície celular têm sido relacionados com a mudanças no metabolismo celular e a motilidade. Portanto, KPFM representa uma ferramenta poderosa que pode ser utilizado para examinar as alterações da superfície microbiana potencial de membrana sobre a adesão a várias superfícies do substrato. Neste estudo, nós demonstramos o procedimento para caracterizar o potencial de superfície de células de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina USA100 individuais em aço inoxidável e ouro usando KPFM.
Introdução
Os biofilmes produzidos nas superfícies dos equipamentos e em feridas cutâneas apresentam um problema para a indústria médica como biofilmes são recalcitrantes à remoção e pode levar a um aumento das taxas de transmissão da doença e resistência aos antimicrobianos. Anexo é o primeiro passo na formação de biofilme e é a etapa mais crítica, devido à sua reversibilidade 1-3. Características de superfície do substrato desempenham um papel crucial na adesão microbiana. Factores tais como a dureza da superfície, a porosidade, rugosidade, hidrofobicidade e têm sido mostrados para efectuar a adesão microbiana; No entanto, pouca investigação examinar o potencial pa....
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Protocolo
1. Preparação de material de vidro e Culturas
- Antes de prosseguir com esta experiência, preparar agar sangue 5% de ovelha (SBA) placas para o cultivo de MRSA. Incubar as placas SBA durante 24 horas à temperatura de 37 ° C. Após este tempo,, colónias individuais bem isoladas deve estar presente para ser utilizado para as inoculações subsequentes em meios líquidos. Loja estrias SBA placas com colónias isoladas a 4 ° C durante 1 - 2 meses.
NOTA: placas de agar de sangue de ovelha-se em embalagens contendo pré-fabricados entre 20-25 placas com base no fabricante, e consistem tipicamente numa base de agar de tripticase de soja com adição de 5% w / v de s....
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Resultados
A capacidade de medir utilizando SP KPFM baseia-se no princípio de que tanto a superfície da amostra e o braço de suporte da ponta condutora são, em certa medida. Aço inoxidável e ouro agiu superfícies como condutores para que MRSA foram anexados. KPFM imagens foram tiradas de 15 células por MRSA em ambas as superfícies com 512 x 512 de resolução, e com as áreas de análise que variam de 5 x 5 mm a 10 x 10 mm. Varredura foi realizada com velocidades de linha que variam de 0,02 linhas / seg de 0,05 linhas / seg. Portanto,.......
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Discussão
KPFM foi empregado como uma nova técnica para a obtenção de dados elétricos de superfície. Ele tem sido comumente usada como um método para a análise de distribuição de carga em química e só recentemente começou a ser aplicado para o estudo de sistemas biológicos na micro e nano-escala. A partir dos dados coletados, descobrimos que os micróbios não pareceu facilmente anexar para limpar superfícies de aço inoxidável e ouro, mesmo após 3 horas de incubação estática. Superfícies funcionalizadas poli-L-lisina foi rápida ade.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem sinceramente ao Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá, ao Ministério de Pesquisa e Inovação de Ontário e à Fundação Canadense para Inovação por financiar este estudo.
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Materiais
tecnologias atômicas de
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agilent do | microscópio da força 5500ILM | #N9435S | |
| discos TED PELLA do espécime do metal de AFM/STM | , INC. | #16219 | Discos de amostra de aço inoxidável |
| DPE (Baixo Ruído) Sondas SPM Condutivas | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | Existem 4 cantilevers revestidos com Pt por chip. Utilizamos o cantilever B para experimentos. |
| Discos de amostra de metal AFM / STM revestidos de ouro PELCO | TED PELLA, INC. | #16218-G | Discos de amostra de ouro |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Microscópio de Força Atômica software de imagem |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Microscópio de Força Atômica software de processamento pós-imagem |
| Microcentrífuga de alta velocidade Scilogex D3024 | Thomas Scientific | #91201513 | Centrífuga usada em etapas de lavagem de células para separar células (pellet) do meio |
| Ágar Soja Tripticase com 5% de Sangue de Ovelha | BD | #221261 | Pratos pré-fabricados |
| Caldo de Soja Tríptico | BD | #257107 | Vem como um pó seco. Instruções sobre como fazer vir no recipiente. |
Referências
- Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
- Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. Biofilms and chronic infections. JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).
- Hoiby, N., et al.
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Reimpressões e permissões
