Uma perspectiva técnica em Modern Tree-anel Research - Como superar dendroecologia e Madeira anatômicas Desafios

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo como amostrar amostras de madeira para a avaliação geral de suas estruturas de crescimento. São descritas as técnicas de preparação e visualização macro e microscópicas necessárias para gerar conjuntos de dados anatômicos e dendroecológicos de madeira bem replicados e altamente resolvidos.

Resumo

Pesquisa dendroecologia usa informações armazenadas em anéis de árvores para entender como árvores isoladas e até ecossistemas florestais inteiras respondeu às mudanças ambientais e finalmente reconstruir tais mudanças. Isto é feito através da análise de variações de crescimento de volta no tempo e correlacionando vários parâmetros específicos para cada planta para (por exemplo) os registros de temperatura. Integrando parâmetros anatômicos da madeira nessas análises reforçaria reconstruções, mesmo de resolução intra-anual. Por isso, apresentamos um protocolo sobre a forma de amostra, preparar e analisar amostras de madeira para análises macroscópicas comuns, mas também para análises microscópicas subseqüentes. Além disso, apresentamos uma solução potencial para a análise de imagens digitais geradas a partir de pequenas e grandes espécimes comuns de apoio de séries temporais analisa. O protocolo apresenta os passos básicos, dado que actualmente podem ser usadas. Além disso, há uma necessidade constante para o aprimoramento das técnicas existentes e desenvolvimento de novos techniques, para registrar e quantificar os processos ambientais passados ​​e em curso. Pesquisa de madeira tradicional anatômica precisa ser ampliado para incluir informações ecológica para esse campo de pesquisa. Este apoiaria dendrologicos cientistas que pretendem analisar novos parâmetros e desenvolver novas metodologias para compreender os efeitos de curto e longo prazo dos fatores ambientais específicos sobre a anatomia de plantas lenhosas.

Introdução

Árvores, bem como arbustos, arbustos anões, e até mesmo ervas, mostram padrões de respostas múltiplas relacionadas a mudanças em seu ambiente. Esses padrões têm sido objecto de botânica e fisiologia das plantas desde meados do ^século 19. Naquela época, a pesquisa sobre plantas lenhosas focada principalmente em árvores e em uma análise descritiva da estrutura e variabilidade dos anéis anuais em um contexto ecológico ^1. Quando Andrew Ellicott Douglass inventou a técnica de cruzamento de namoro para a pesquisa de anéis de árvores ^2, neste contexto ecológico foi mais ou menos suprimida pela nova capacidade de datar com precisão achados de madeira em arqueologia. -Dating Cruz pela primeira vez permitiu a datação precisa de anéis de árvores para o ano civil e é até hoje considerada a espinha dorsal da pesquisa de anéis de árvores em todos os campos da sua aplicação ^1.

Em paralelo, desde o final do século 19, anatomia da madeira evoluiu para uma disciplina de pesquisa importante relacionard a muitos outros campos das ciências naturais e aplicadas ^3. Dois domínios principais são estabelecidos: a anatomia sistemática de madeira, que é a base para a identificação de madeira em arqueologia ^4, ea anatomia da madeira aplicada, relacionada à tecnologia da madeira, fisiologia, patologia e ecologia ^3,5.

Na pesquisa de anéis de árvores, dendroecologia hoje em dia é definido como um tema que abrange estudos de anéis de árvores relacionadas com foco em estudos ambientais, tais como processos geomorfológicos (dendrogeomorphology), temperatura e precipitação reconstruções (dendroclimatologia), alterações do nível da água (dendrohydrology) ou mesmo flutuações Glacier ( dendroglaciology) ^6. Como esta definição indica, análises de anéis de árvores tornaram-se cada vez mais importante no campo do namoro e reconstruir processos ambientais, tais como (i) condições climáticas do passado, analisando as variações anuais no anel de largura ^7,8, densidade da madeira ⁹ ou isótopos ^10, ou (ii) tele recorrência intervalos de processos geomorfológicos ^11. Estes estudos muito detalhados sobre variações anel de largura e seu conteúdo isotópico demonstrar a necessidade de analisar os anéis com mais detalhes, ou seja, para estudar a estrutura anatômica dos anéis. No entanto, estudos detalhados de características anatômicas da madeira dentro dos anéis anuais relacionadas às mudanças ambientais são raros ^12,13. Embora essas características microscópicas são conhecidas ^14, eles raramente têm sido aplicadas em um nível microscópico para pesquisa dendroecologia. Além disso, o momento exato dessas reações de crescimento em árvores cultivados naturalmente, essenciais para fins de datação exata, tem sido raramente documentado recentemente ^15.

Com relação aos efeitos do aquecimento global ^16, a melhoria das existentes e desenvolvimento de novas técnicas para registrar e quantificar os processos ambientais passados ​​e em curso é necessária, especialmente em termos de clima de investigação impacto ^11.Ao expandir a investigação anatômica de madeira tradicional para uma anatomia da madeira ecologicamente baseado ^17, dendrologicos cientistas podem analisar novos parâmetros e desenvolver novas metodologias para compreender a curto e longo prazo efeitos de fatores ambientais específicos sobre a anatomia de plantas lenhosas ^18. O conhecimento detalhado sobre as variações nos parâmetros de células diferentes dentro de anéis individuais relacionados com drivers específicos (por exemplo, forças mecânicas, variações climáticas) é o requisito básico para a compreensão da variabilidade na formação dos anéis de árvore. Em comparação com as medições do anel de largura comuns, identificando variações anatômicas da madeira requer técnicas de preparação mais complexas e amplas que requerem uma grande quantidade de mão de obra e tempo. Os procedimentos detalhados de corte da amostra, a coloração, e incorporação são múltiplas e estão sempre dependentes do objetivo do estudo ^19.

Para a análise macroscópica da largura do anel de coníferas ou mesmo estruturas para o número, tamanho ou distribution de navios em madeiras de lei, a superfície de uma amostra é comumente polidas com lixa fina ou máquinas especiais de moagem ^{de 20.} Uma desvantagem deste procedimento é o enchimento das células individuais com a poeira que impede ainda mais a análise microscópica semi-automática ^21. Os melhores resultados para a preparação da amostra macroscópica são alcançados quando a superfície da amostra são cortados com uma lâmina de barbear ou de outra faca afiada.

Enquanto para pequenas amostras, lâminas de barbear são uma ferramenta perfeita; amostras maiores como núcleos requerem o corte de superfícies planas ao longo de toda a extensão de núcleos. Em contraste com o lixar, as células não são preenchidos com pó, o qual permite que as operações de preparação para a análise de imagens sucessivas. Além disso, o lúmen de células abertas, as paredes celulares adequadamente cortados, e a superfície do plano da amostra inteira permitir a aplicação de alta frequência densitometria ²² a toda a extensão do núcleo. Para análise de imagem, a superfície das amostras (célulaparedes) pode ser corada com tinta escura e o lúmen de células abertas podem ser utilizados posteriormente com giz branco para melhorar o contraste entre a parede da célula e a área do lúmen ^19,23. Esta técnica bastante simples permite uma avaliação macroscópica de base das estruturas celulares maiores, para medições do tamanho do vaso.

Estas técnicas para cortar superfícies planas são suficientes para a análise macroscópica. Para uma detalhada análise anatômica de madeira (ou seja, microscópica), microscopia de luz transmitida é o método mais comum aplicado nas ciências dendrologicos. Diferenciar células do xilema por meio de processos complexos que abrangem tipo celular determinação, divisão celular, diferenciação celular, a morte celular programada e ^24. Desde o momento eo ritmo a que esses processos ocorrem determinar as características anatômicas de células, as condições ambientais que afetam esses processos podem gerar desvios anatômicos na estrutura do anel. Como uma condição importante para estes analisars, seções micro precisa estar preparado com um micrótomo ^19. Quando a preparação de amostras para uma secção transversal, a visibilidade da direcção traqueídeos ou fibra é crucial. É recomendado o uso de normas ditadas micrótomos deslizamento mão para cortar seções micro porque esta técnica facilita seções de alta qualidade, conforme necessário para análise de imagem ^19. Dependendo do objectivo específico de um determinado estudo, as lâminas microscópicas são cortadas perpendicularmente ou paralelamente à extensão longitudinal das células. Essas seções são então fotografadas abaixo de um microscópio e dimensões celulares medidos usando imagem especializado analisa software.

Até recentemente, a capacidade de preparar as lâminas microscópicas foi restringido para amostras de pequenas dimensões apenas (aproximado 1 cm x 1 cm). Isto é aceitável para analisar eventos únicos como distúrbios em anos específicos, mas esta técnica não permite a análise de séries temporais necessário alargado para reconstruções ambientais. Este esforço só pode ser perceberd através do desenvolvimento de novos, eficientes e econômicas procedimentos de preparação e técnicas de análise. Nos últimos anos, os membros do laboratório de anéis de árvores no Swiss WSL Instituto Federal de Investigação, na Suíça começaram um trabalho intenso sobre este tema. Como resultado, os novos dispositivos e técnicas de análise foram desenvolvidos para suportar a ideia de integrar características anatômicas da madeira para uma ampla gama de temas de investigação ambiental.

Protocolo

1. técnicas de amostragem

1. Amostragem Núcleo
   1. Para árvore amostragem caules, extrair pelo menos dois núcleos usando um corer incremento de cada haste para analisar o seu desenvolvimento crescimento. Varie a posição de amostragem sobre a tarefa de investigação, por exemplo, para as reconstruções climáticas comuns tomar a núcleos paralela à inclinação. Ao trabalhar com espécies tropicais, tome pelo menos três ou mais núcleos.
   2. Usar uma sonda incremento afiada (5, 10 ou 12 mm de diâmetro) e colocar a sonda perpendicular ao eixo de crescimento do caule.
      NOTA: Para ter uma posição controlada e estável do corer, use um empurrador para evitar movimentos da corer diferente da sua rotação ao perfurar-lo na árvore. Perfuram a haste todo o caminho para dentro e através da medula. Para núcleo de madeira muito densa (ou seja, espécies tropicais), usam corpos especiais de motosserra reconfigurado com um adaptador de núcleos de incremento que permitem até mesmo núcleo denso bosque como Diospyrus ebenum (Ebony).
   3. Usar um extractor e remover o núcleo resultante da árvore. Desenforme a corer e removê-lo a partir do tronco.
   4. Adicionar uma identificação específica para o núcleo extraído usando um lápis macio por escrito numa fita, o qual é então colocado directamente sobre o núcleo. Repetir o procedimento no lado oposto da haste.
   5. Guarde as duas amostras da árvore em tubos de plástico ou de papel ou caixas especiais para evitar qualquer dano.
      NOTA: canudos de papel são benéfico, especialmente em ambientes tropicais, pois evitam que os núcleos de moldagem.
   6. Finalmente, montar os núcleos (direção das fibras verticais) sobre vigas de suporte de madeira. Use cola de madeira resistente à água fria e deixe-os secar.
      NOTA: Nunca montar os núcleos em suportes de madeira, se o objetivo do estudo inclui análise de densidade mais química, ou isótopo. Para estes fins, corrigir os núcleos em condutas abertas ou um único cartão canelado faced.
2. Amostragem Micro-core
   1. Use um dispositivo de perfuração especialou agulha com uma abertura de 2 mm. Dependendo da espessura da casca utilizar um cinzel para remover uma parte necessária da casca.
   2. Inserir o dispositivo perpendicular ao eixo crescente na haste, como descrito acima, e usar um martelo para penetrar no xilema da haste de cerca de 2 cm de profundidade.
   3. Virar a quebra da agulha do núcleo micro resultante no interior da ferramenta e removê-la da haste. Armazene as micro núcleos em frascos de microcentrífuga e rotulá-los.
3. Amostragem Disc
   1. Em casos especiais (e especialmente nos trópicos), por exemplo, quando a amostragem tocos e árvores caídas ou sempre que possível, levar discos (seções transversais perpendiculares ao eixo de crescimento) com uma serra elétrica. Simplesmente rotular os discos e armazená-los até uma análise mais aprofundada.
      NOTA: Este procedimento de amostragem é mais comumente aplicado para todo o material dry-morto, histórico, arqueológico e sub-fósseis, bem como madeiras muito densas que não permitem o uso de corers incremento.

2. Preparação de Amostra

1. Lixar discos
   1. Coloque os discos em uma máquina de lixamento e moer a superfície usando uma seqüência de abrasivos cada vez mais finas, começando com uma lixa de 80 grit, seguido de 120, 220, 300-grit. Um polimento final com 400 grit é suficiente para a maioria das coníferas. Para madeiras e espécies tropicais, especialmente o uso de lixa grits até 1200 para distinguir os limites dos anéis de crescimento.
2. Cortar superfícies planas em núcleos
   1. Corrigir os núcleos de incremento no suporte núcleo de um micrótomo núcleo recém-desenvolvido que permite cortar superfícies planas em núcleos em toda a sua extensão.
      NOTA: corrigir a orientação do núcleo dentro do portador para que o sentido das fibras da amostra na vertical, o qual está em ângulo recto com a faca de micrótomo.
   2. Levante o núcleo até ligeiramente toca a lâmina. Puxar a lâmina, que está fixado na orientação rolamento de esferas ao longo da extensão do núcleo de cuT fora a primeira parte do topo.
   3. Empurrar para trás a faca atrás do núcleo, levantar o suporte de amostra com o núcleo de cerca de 10 um e repetir o procedimento de corte. Fazer isso até cerca de um terço do diâmetro do núcleo é cortado para baixo, resultando em uma superfície contínua plana.
3. De se prepararem secções micro por adição de solução de amido de milho.
   1. Para a análise de imagem detalhada da estrutura anatômica, corrigir núcleos ou outras amostras separou discos do titular de um micrótomo. Posicionar a lâmina micrótomo, guiado por um rolamento de esferas orientação de um micrótomo trenó recentemente desenvolvida na extremidade superior da amostra e puxar sobre ele.
   2. Empurrar para trás da lâmina para levantar a amostra em cerca de 20 a 30 um e puxar a lâmina ao longo da amostra novamente. Repetir este procedimento até que uma superfície contínua no topo da amostra é criado.
   3. Cobrir a superfície resultante com uma solução de amido de milho (10 g de amido de milho, 8 ml de água, e 7 g de 100% glicerol) com uma escova comum.
      NOTA: Os grãos de amido encher as células abertas da amostra para estabilizar a estrutura para o corte subsequente das secções finas.
   4. Levantar a amostra por 15 fim, colocar um pincel sobre a superfície da amostra e puxar a lâmina lentamente para a amostra de partida para cortar uma secção fina (inferior a escova). Durante o corte, a secção resultante desliza sobre a lâmina guiada pela escova.
   5. Quando a seção inteira é cortada, remova a seção micro da lâmina com uma escova e água (para reduzir o atrito) e coloque a seção sobre uma lâmina de vidro para uma maior preparação. Para impedir que a secagem, cobri-los usando uma pequena quantidade de glicerol (33% = uma parte de glicerol a 100% e duas partes de água).

3. Preparação MicroSlide

1. Para a seguinte preparação de lâminas permanentes, primeiro lavar o glicerol para longe da secção de micro, com uma pipeta e água.
2. Cubra o wet secção com algumas gotas de safranina (1 g de pó de safranina + 100 ml de água) e azul de astra (0,5 g de pó de azul Astra + 2 ml de ácido acético a 100% + 100 ml de água) para distinguir entre lignificado e não lignificado estruturas, mas também para melhorar o contraste para a análise de imagem subsequente.
3. Deixe o resto seção por 5 min abrangidos pelo corante e depois lave-a com uma pipeta e água novamente.
4. Assim que o corante em excesso é removido, desidratar a secção com pipetas, lavando-as com uma sequência de 75% diluído, 96% e, finalmente, 100% de etanol.
5. Utilização pipetas para lavar as amostras sobre a placa de vidro em vez de colocar as amostras num banho de reduzir o tempo de processamento de cerca de dois a três minutos para todo o processo de desidratação.
   NOTA: A desidratação com etanol impede amostras frágeis de quebrar.
6. Em seguida lave a seção com 100% xilol.
   NOTA: O xileno é cancerígeno e ventilação é obrigatória no laboratório quando usá-lo. Outroprodutos existem substituindo xilol, mas se houver a intenção de armazenar as amostras ao longo de períodos mais longos de tempo (anos, décadas) para uma reanálise potencial, bálsamo do Canadá (passo 3.5.2), é a forma única incorporação que permanece claro, sem mudar de cor ao longo do tempo. Infelizmente bálsamo do Canadá tem de ser utilizado em combinação com xilol.
7. Enquanto o xilol transforma leitoso (esbranquiçada), repetir o processo de desidratação, uma vez que não é suficientemente desidratado.
8. Assim como o xilol permanece claro, cobrir a secção com uma gota de 100% bálsamo do Canadá e cobri-lo com uma tampa de vidro de, pelo menos, o tamanho da secção.
   NOTA: Lembre-se de retirar as bolhas de ar, pressionando suavemente o vidro da tampa para baixo.
9. Coloque o micro slides resultante entre duas tiras de plástico resistentes ao calor e colocá-lo em uma placa de metal. Coloque um peso (por exemplo, um íman) em cima do slide para pressioná-lo para baixo para manter a parte plana durante o seguinte processo de secagem.
10. Colocar as lâminas em um forno a60 ° C durante cerca de 12 horas. Depois de 12 horas, tome as lâminas de sair do forno e coloque-os em uma prateleira para deixá-los esfriar a RT (cerca de 20 ° C). Quando esfriar, retire o peso e a tira de plástico e limpe a lâmina utilizando lâminas de barbear para remover o excesso de bálsamo do Canadá.

4. A visualização de conteúdo da célula

1. Preparar a solução Nawashin ^25.
   1. Prepara-se uma solução de (A) com 5 g de ácido crómico, 50 ml de ácido acético a 96%, e 320 ml de água desionizada. Prepare uma outra solução (B) com 200 ml de formalina, com 175 ml de água desionizada.
   2. Misturar a solução A e solução B, em uma proporção de 1: 1 para criar a solução Nawashin.
2. Para visualizar o conteúdo da célula, fixar a amostra com solução Nawashin por 10 min para parar todos os processos de degradação no interior da célula.
   NOTA: A fixação preserva o núcleo das células, permitindo uma estimativa de longevidade celular (a longevidade das células = núcleos presentes / núcleos ausente; a presença or ausência do núcleo indica se a célula viva ou morta).
3. Após a fixação, lavar as seções com água para remover totalmente a solução Nawashin antes manchando-os com safranina-azul de Astra e antes, adicionalmente, manchando-as com azul picric-anilina (1 parte saturada anilin solúvel em água azul + 4 partes de ácido pícrico 10%) .
4. Aquecer cuidadosamente a amostra a cerca de 80 ° C (em qualquer caso abaixo do ponto de ebulição), para acelerar o processo de coloração. Para a desidratação e incorporação das amostras de seguir o protocolo passos 3,4-3,8.

5. Preparação de Imagens Digitais de características anatômicas

1. Criar imagens digitais de superfícies do núcleo para análise navio.
   1. Corte o plano da superfície do núcleo usando o microtome núcleo e manchar o preto superfície resultante simplesmente usando um marcador de feltro.
   2. Assim que o corante é seco, esfregar a superfície do núcleo com giz branco. Pressione a giz nas células, simplesmente esfregando a giz sobre osuperfície utilizando um dedo. Também remova o excesso de giz por este procedimento.
      NOTA: Como resultado, as paredes celulares são pretos e as partes luz dos vasos são brancos. Esse contraste é uma pré-condição para uma análise automática de imagem.
   3. Coloque o núcleo preparada abaixo de um microscópio binocular equipado com uma câmera digital. Tomar uma sequência de sobrepondo ligeiramente (aprox. 10%) de imagens a partir de um lado do núcleo até que toda a superfície é capturado. Costurar as imagens individuais para criar uma imagem completa da superfície do núcleo.
2. Criar imagens digitais de micro lâminas
   1. Coloque as micro lâminas limpas sob um microscópio e tomar sobrepor imagens de toda a seção.
   2. Definir uma ampliação específica dependendo das estruturas a serem analisadas, variando entre 40X e ampliação 1000X.
   3. Costure as imagens individuais para criar uma imagem completa da seção. Para evitar possíveis distorções durante o processo de costura, use "; Plano "-tipo lentes objetivas com o microscópio.

6. Características Quantificação anatômicas

1. Para detectar células borda do anel e utilizando a ferramenta de análise de imagem ROXAS18 ou similar, carregar uma imagem completa de uma secção de micro e a calibração espacial associado para obter resultados quantitativos em unidades métricas. Calcula-se a calibração espacial através da medição do número de pixels entre as escalas de imagens de um micrómetro de estágio tomadas com a mesma ampliação e dividindo o valor obtido pelo espaçamento escala em unidades métricas (por exemplo 1,000 mm).
2. Selecione na lista fornecida (fornecido no software) uma configuração adequada antes de iniciar a parte automática da análise.
   Observação: Uma configuração é um conjunto previamente optimizado de configurações do programa que, por exemplo, leva em conta a coloração cor da amostra e o tamanho e forma do intervalo de células a ser detectado. Configurações personalizadas, assim,permitem produzir resultados de reconhecimento ideais para diferentes espécies e qualidades de imagem.
   1. Selecione outras opções, tais como o uso de regiões na imagem que devem ser incluídos ou excluídos para evitar, por exemplo, as margens de imagem em branco ou fissuras na amostra, se for necessário.
3. Iniciar a análise, pressionando o botão Analisar. Se optou, definir regiões da imagem que devem ser incluídas ou excluídas usando a ferramenta polígono, retângulo ou círculo. A análise automática seguinte utiliza algoritmos flexíveis para corrigir algumas deficiências de imagem (por exemplo, sem contraste) e melhorar o contraste com base na qualidade da imagem.

Resultados

Todas as análises dendroecologia depender de amostras precisas, não importa se discos, núcleos, ou micro núcleos são tomadas. Para isso, os dispositivos precisam estar em perfeita forma (afiadas com precisão) para evitar micro fissuras dentro da amostra de madeira. Ao preparar as superfícies em núcleos de incremento, a utilização de um micrótomo núcleo é essencial. A capacidade de ter células abertas, que podem ser tratados ainda mais para melhorar o contraste para imagem análises e medições do tamanho do reservatório (Figura 1), é um primeiro passo importante para a adaptação das estruturas anatômicas em tempo série analisa. Por vezes, a densidade de uma amostra de madeira evita a utilização de um micrótomo. Nesse caso, um polimento adequado e subsequente remoção do excesso de serragem dos vasos com um compressor ou de vácuo é a melhor opção.

Para análises mais detalhadas das estruturas celulares menores como lenho inicial e traqueidas lenho tardio em coníferas, são necessários seções micro de alta qualidade. Aqui, potential artefactos, tais como paredes celulares secundárias serem retirados para fora da parede primária necessidade de ser evitada (Figura 2). Se estes artefactos ocorrer nas imagens digitais, uma análise automática das dimensões da célula já não é possível. Os artefatos em seguida, precisam ser corrigidos manualmente, o que é demorado e na maioria dos casos resulta em medições incorretas de dimensões celulares. A simples aplicação de um fluido não-newtoniano, ou seja, uma solução de amido de milho, para o topo da amostra suporta a estabilidade da estrutura, enquanto a redução da ocorrência de artefactos para um mínimo (Figura 2) ^26. Esta aplicação de amido de milho, adequado para todas as amostras de madeira, incluindo espécies tropicais, faz com que a aplicação do processo de incorporação para as amostras antes de cortar redundante.

Micro secções permitir uma determinação mais seguro dos anéis anuais. Este é especialmente o caso para as coníferas crescendo em seus limites naturais, ou seja, </ Em>, na linha de árvore em áreas de alto alpinas. Extremamente anéis estreitos são freqüentes e difíceis de detectar macroscopicamente (Figura 3). Em casos extremos, os anéis consistem em uma ou duas filas de células de lenho inicial e uma linha de células achatadas lenho tardio, que não têm (em contraste com as células lenho tardio comuns) paredes celulares espessas. Para isso, eles são melhores ou até mesmo visível somente ao utilizar lâminas microscópicas. Além disso, as flutuações de densidade podem ser diferenciados a partir das fronteiras do anel de forma mais clara, o que simplifica a detecção dos anéis anuais especialmente no Mediterrâneo e os trópicos (Figura 3).

Ao analisar as imagens com uma ampliação de 40X ou mais, células individuais são visíveis e a espessura das suas paredes celulares também é detectável. Software de análise semi-automático permite a medição de parâmetros específicos ao longo de caminhos definidos seguindo a direção de seu desenvolvimento temporal e espacial (Figura 4). Com isso, changes de parâmetros individuais, tais como a luz da célula ou a espessura da parede da célula pode ser determinada ao longo de toda a extensão de um anel anual (Figura 4). Isso pode ser feito para todos os anéis visíveis na imagem e isso apoia plenamente a necessidade de uma análise de séries de tempo prolongado.

A análise das imagens podem também ser usadas para determinar as fases de desenvolvimento de anéis anuais no âmbito do período de vegetação (Figura 5). Ao analisar a imagem de uma secção corada com safranina e Astra-azul usando luz polarizada, mesmo as diferentes fases da lenhificação, começando nos cantos exteriores das paredes das células, até o completo lenhificação da parede celular secundária, tornam-se visíveis. Isso ocorre porque as paredes lignificadas (maduro) brilhar em luz polarizada (Figura 5). Informações detalhadas podem ser relacionadas aos dados ambientais documentados para o respectivo período de vegetação para determinar, por exemplo, um clima relati-crescimento mais detalhada onship.

Figura 1. Exemplos de uma seção de micro e uma superfície plana preparada de um carvalho, incluindo anel de largura e medição do tamanho dos vasos esquerda:. Parte mais externa de um núcleo incremento de carvalho. O núcleo de 5 mm de diâmetro foi cortado usando um micrótomo núcleo. A superfície foi depois corado preto utilizando um marcador de células e foram cheios com giz branco após a mancha foi seca. Direita: o gráfico está indicando anel de largura e do tamanho do vaso medições feitas sobre a superfície do núcleo mostrado à esquerda. Não há seções micro eram necessários para fazer estas medições devido à superfície clara criada pelo microtome núcleo (modificado após ^21). Resumindo: a seção Micro cortar um núcleo de incremento, manchado, desidratado e fixados em bálsamo do Canadá. Espessura: 20 mm, comprimento: 25 cm. g "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Imagens de seções micro cortar sem estabilização contra um corte de seção usando a solução de amido de milho esquerda:. Seção Micro mostrando corte de artefatos nas traqueidas lenho inicial de uma conífera. A amostra foi cortada sem incorporar e como resultado as paredes secundárias, em vez de as células finas lenho inicial foi dividido a parede principal (setas azuis). Direita: Micro seção sem quaisquer artefatos nas traqueidas lenho inicial de uma conífera. Esta seção (mesma amostra, como mostrado à esquerda) foi cortado depois de aplicar a solução de amido de milho com uma escova em cima da superfície da amostra. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ove_content "fo: manter-together.within-page =" always ">
. Figura 3. Exemplos de dificilmente detectáveis ​​limites anuais anelar esquerdo: seção Micro de um núcleo de incremento (aqui: Larix decidua) mostrando um limite de anel (seta preta), indicado por uma única fileira de células achatadas lenho tardio, sem qualquer espessamento das paredes das células. Este anel não seria visível macroscopicamente. Direita: flutuações de densidade intra-anual (seta branca) são comuns em espécies do Mediterrâneo (seção micro: Quercus ilex). A mudança gradual da estrutura celular em direção lenho tardio e de volta à estrutura de lenho inicial (seta branca) permite diferenciar flutuações de densidade de Limites de anéis de reais (seta preta). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Ilustração da área de luz, e medidas de espessura de parede dentro de um anel anual de uma conífera Top:. Cut-out imagem que mostra um resultado exemplar de análise Roxas em uma árvore-ring de Pinus sylvestris (pinheiro silvestre). Borda do anel são mostrados em amarelo e contornos de tracheid Lumina em ciano. Para um arquivo radial (azul tracheid Lumina) da espessura da parede da célula medida é representado por círculos vermelhos. Bar escala Preto = 100 mm. Inferior:. As mudanças intra-anuais na área do lúmen tracheid e espessura das células-wall tracheid para todo o anel anual Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. example de um anel anual de formação. A imagem foi capturada em microscópio de luz com luz polarizada de um micro-seção manchado Safranina e Astra-azul obtido a partir de um micro-core amostrados em ⁷ de julho de 2007 a ​​partir de uma decídua Larix crescente no Lötschental a 1.300 m acima do nível do mar. Nesta secção, os micro-células do câmbio, as células na fase de alargamento, as células na fase de espessamento da parede e as células maduras são reconhecíveis. A largura tangencial da imagem cobre ~ 1 mm da seção transversal do xilema. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os desafios de uma integração bem sucedida e sustentável da anatomia da madeira em pesquisa dendroecologia são, além de problemas analíticos múltiplas, principalmente devido a aspectos técnicos. Estes desafios vão desde princípio de amostragem abordagens para a criação de micro seções de alta qualidade e sua posterior análise ^19.

À primeira vista, a amostragem de núcleos ou até mesmo discos é um procedimento simples que tem sido conhecido por muitos anos agora. Há muitas coisas que podem ser feitas errado e uma pequena imprecisão na amostragem pode resultar em problemas graves durante as fases de preparação e posterior análise. As pequenas imprecisões como descaroçamento que não é exactamente perpendicular ao eixo da haste, ou usando uma sonda imperfeitamente aguçada não são um problema se o objectivo do estudo é restrito ao anel de largura de medições. No entanto, quando se aponta para a análise microscópica das amostras, uma direco de amostragem incorrecta pode resultar em distorções ópticas deparedes das células, enquanto que o uso de rombos corers resultados em micro fissuras dentro do núcleo. Como resultado, ao tentar cortar micro seções destes núcleos, as seções finas apenas desmoronar e uma preparação eficiente não é mais garantida. O mesmo é verdade para a amostragem de micro-núcleo. A ponta romba irá resultar em pressão alta quando o perfurador é martelado em madeira do tronco. Por conseguinte, a camada cambial será comprimido. As células do câmbio (Figura 5) são, consequentemente, espremida e não pode ser analisado.

Disco de amostragem é de fato a melhor estratégia quando se analisa as variações de crescimento para relacioná-los às mudanças ambientais. Infelizmente, é simplesmente impossível tomar discos de todas as árvores destinadas a serem amostrados para análises posteriores. No entanto, especialmente no caso de dendrochronology tropical, uma certa quantidade de discos tronco é necessário em combinação com núcleos de incremento. Os discos são usados ​​como base para definir os limites de anel e, por esta para apoiar o boundaries definido com base na análise de núcleos de incremento ^12,27,28.

Os prós e contras de lixar contra corte são frequentemente discutidos ^1,11,21. Como mencionado acima, o melhor procedimento depende sempre da questão de pesquisa e os parâmetros a serem analisados ​​(macroscópica ou microscópica). Se as análises isotópicas ou químicos são projetadas em um passo de trabalho adicional, é de extrema importância que o pó abrasivo criado por lixar que podem preencher em Lumina celular ao longo de toda a amostra, é cuidadosamente removido por aspiração ou ar pressão.

Cortar seções micro é para todos microscópica analisa a forma mais adequada de preparação de amostras para análises posteriores. Em primeiro lugar, a secção é cortada da amostra, que então pode ser mantido sem qualquer contaminação potencial para análises posteriores. Segundo essas seções permitem medições de alta resolução de parâmetros de célula única. Além disso, evitar a incorporação demoradotécnica, utilizando uma solução de amido de milho ²⁶ para estabilizar as células é uma grande vantagem em micro corte.

A desvantagem de micro corte ainda é o tamanho da amostra limitada, resultando em longos tempos de preparação. Para as análises de séries temporais reais voltar no tempo ao longo de séculos ou mesmo milênios, há uma necessidade de desenvolver dispositivos existentes corte ^17,19, mas também análise e processamento de imagem ^18. Um primeiro passo neste sentido é o desenvolvimento de micrótomo do núcleo ^21, inicialmente fabricado para cortar superfícies planas sobre os núcleos (Figura 1). Testes recentes revelaram a capacidade de corte de micro-secções de núcleos inteiros com este dispositivo (Figura 1).

Seções micro alta qualidade fornecem o princípio básico para uma análise de imagem eficaz. Tomando as imagens sob um microscópio é um procedimento comum ^{de 19,} mas a sua análise eficaz ainda é uma tarefa que precisacontinuar a ser desenvolvidos ^17. Todos os sistemas de análise de imagem existentes são semi-automática, ou seja, eles precisam ser mais ou menos intensamente controlado pelo técnico. Em muitos casos, as imagens precisam ser corrigidos ou mesmo novas imagens têm de ser feitas para melhorar o contraste para um melhor registro das estruturas por parte do software sem alterar espessura da parede celular dentro da imagem.

Ferramentas de análise de imagem especializadas, como Roxas ^18, WinCell ou os scripts específicos para ImageJ ²⁹ são capazes de fornecer dados anatômicos básicos, tais como o número de células, a dimensão da célula, espessura da parede celular e posição da célula dentro do anel anual. Muitas métricas adicionais anatómicas que são relevantes em um contexto dendroecologia pode ser calculada a partir destas medições básicas, tais como o tamanho das maiores condutas, condutas de distribuição de tamanho, o tamanho de lenho inicial ou a primeira fila de condutas, (óptico) a densidade da madeira, intra-anual perfis de tamanho conduta e da parede celularespessura, e os padrões de agrupamento de condutas (solitária, múltiplos, etc.).

Usando o software Roxas ^18, os contornos de Lumina conduta (ou seja, a água celular condução) e fronteiras anuais anel são automaticamente reconhecidos e visualmente representadas como sobreposições sobre a imagem original. Algoritmos de detecção de condutas são baseadas em cor, tamanho e informação da forma, os algoritmos de detecção de borda do anel sobre o contexto local de cada conduta. Uma caixa de ferramentas permite-nos melhorar manualmente estes resultados editando diretamente os recursos de sobreposição, ou seja, suprimir, acrescentar e modificar as fronteiras anel e conduta descreve. Após a edição, a saída de dados final, incluindo a espessura da parede celular (coníferas), é gerado e salvo em uma planilha automaticamente. Totalmente sistemas automatizados não estão disponíveis, nem mesmo para as coníferas que mostram uma estrutura relativamente simples, mas este é um objetivo para futuros desenvolvimentos. Isso iria apoiar fortemente o fuintegração ll de parâmetros anatômicos da madeira em análises de séries temporais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Incremento do descaroçador			http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article & id=57& Itemid=88& lang=pt-br
Micrótomo
http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN micrótomo			http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Trephor micro corer
http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp solução			Dez partes 1% de ácido crômico, quatro partes 4% formaldeído e uma parte de ácido acético
		de picric-anilina	Uma parte de azul de anilina saturada e quatro partes de Trinitrofenol dissolvido em etanol a 95%
de safranina			(notação de Hill) C20H19ClN4
azul-Astra			(notação de Hill) C47H52CuN14O6S3
Fórmula			CH3CH2OH
Fórmula Linear de Xilol (Xileno)			C6H4(CH3)2
Brasil Bálsamo			Solução de incorporação para microscopia
Roxas Software			http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN
ImageJ Software			http://imagej.nih.gov/ij/
WinCell			http://imagej.nih.gov/ij/