Preparação, Imaging, e quantificação de Motilidade Ensaios superfície da bactéria

Summary

A motilidade de enxameação é influenciada por fatores físicos e ambientais. Descrevemos um protocolo de duas fases e diretrizes para contornar os desafios comumente associados à preparação do ensaio de enxame e à coleta de dados. Uma técnica de imagem macroscópica é empregada para obter informações detalhadas sobre o comportamento do enxame que não são fornecidas pelas técnicas de análise atuais.

Abstract

Motilidade superfície bacteriana, tal como enxame, é geralmente avaliada em laboratório usando ensaios em placa, que exigem a concentrações específicas de agar e, por vezes, a inclusão de nutrientes específicos no meio de crescimento. A preparação de tais meios explícitos e condições de crescimento superfície serve para fornecer as condições favoráveis ​​que permitam não só o crescimento bacteriano mas motilidade coordenada de bactérias sobre estas superfícies dentro filmes líquidos finos. Reprodutibilidade da placa enxame e outros ensaios em placa de motilidade superfície pode ser um grande desafio. Especialmente para mais "Swarmers temperados" que exibem motilidade apenas dentro de intervalos de agar de 0,4% -0,8% (p / vol), pequenas alterações no ambiente de laboratório ou protocolo pode influenciar grandemente os resultados do ensaio do enxame. "Molhabilidade", ou do teor de água na interface líquido-sólido ao ar destes ensaios em placa, é muitas vezes uma variável chave para ser controlado. Um desafio adicional para a avaliação swarming é como quantificar observed diferenças entre duas (ou mais) experiências. Aqui nós detalhe um protocolo de duas fases versátil para preparar e ensaios imagem enxame. Nós incluem orientações para contornar os desafios comumente associados à preparação de meios ensaio enxame e quantificação de dados destes ensaios. Nós especificamente demonstrar o nosso método que utiliza bactérias que expressam repórteres genéticos fluorescentes ou bioluminescentes, como proteína fluorescente (GFP), luciferase (operon lux), verde ou manchas celulares para permitir imageamento óptico time-lapse. Demonstramos ainda mais a capacidade do nosso método para controlar as espécies que pululam competindo no mesmo experimento.

Introduction

Muitas bactérias movem em superfícies utilizando vários meios de auto-propulsão. Alguns fenótipos motilidade pode ser pesquisado em laboratório, utilizando ensaios de placas que são afetados pelo ambiente líquido associado à composição ensaio de placas semi-sólido. Um subconjunto de superfície útil ensaios em placa motilidade envolver ainda uma sala de ar gás fase normalmente. Assim, o resultado de qualquer ensaio de motilidade superfície particular, exige um cuidadoso controle da interface de três fases: a superfície sólida ambiental local, meio líquido, e propriedades do ambiente gás.

O modo de motilidade mais vulgarmente estudada em tal ensaio de três fases é conhecido como enxame. Enxameação é o movimento do grupo coordenado de células bacterianas que são movidos por seus flagelos através de filmes líquidos finos em superfícies ^1. É tipicamente estudada em laboratórios usando ensaios em placa de semi-sólidos contendo 0,4% -0,8% (p / vol) de ágar ^1. Uma matriz depatógenos humanos explorar esse comportamento motilidade para explorar e colonizar o hospedeiro humano. Por exemplo, Proteus mirabilis usa enxameação para subir na uretra, atingindo e colonizar a bexiga e os rins ^2. Motilidade Enxameando é geralmente considerado um passo precursor para a formação de biofilme, a principal causa de patogénese em muitos patogénios humanos ^3.

O fenótipo swarming é muito variada entre espécies bacterianas; sucesso experimental e reprodutibilidade dependem fortemente de factores como a composição de nutrientes, tipo agar e composição, protocolo de esterilização (por exemplo, autoclavagem), a cura meios semi-sólidos e umidade do ambiente (por exemplo, mudanças sazonais), entre outros ^3-5. A variabilidade das respostas da motilidade superfície enfatiza os desafios encontrados nestes estudos e os meios de comunicação influência significativa e ambiente pode exercer. Para algumas espécies que pululam, tais como Pseudomonas, pululando motilid pode ocorrer em uma variedade de composições de meio, embora o fenótipo observado e que acompanha taxa de expansão enxame irá variar grandemente ^3. Combinados, esses fatores podem fazer estudos de motilidade superfície extremamente desafiador. Variabilidade sazonal dentro de um laboratório pode influenciar estes ensaios trifásicos: ensaios podem funcionar melhor no-ar úmido do verão e pior no ar seco do inverno. Aqui apresentamos as diretrizes gerais para contornar alguns dos desafios mais notáveis ​​quando se realiza estudo placa motilidade superfície.

Para alguns estudos da motilidade de superfície, o desenvolvimento de fenótipos específicos é de grande interesse. A maioria, mas não todos, os estudos, publicados examinar swarming de P. aeruginosa mostram a formação de rebentos ou fractais que irradiam a partir de um centro de inoculação ^3-9. As diferenças entre P. estirpes aeruginosa têm sido documentados ^5,8, mas em muito da presença ou ausência de gavinhas pode ser atribuído ao específic médio e protocolo utilizado para estes ensaios em placa de motilidade enxame. Aqui vamos incluir detalhes sobre como promover a formação de enxames tendril para P. aeruginosa. Porque P. aeruginosa é apenas uma das muitas bactérias que pululam, nós também incluem detalhes para o nosso método para examinar swarming de Bacillus subtilis e deslizamento de Myxococcus xanthus. Como P. aeruginosa, a pesquisa atual sobre B. subtilis e M. xanthus abrange uma variedade de tópicos como os pesquisadores estão trabalhando para discernir os aspectos da esporulação, motilidade, resposta ao estresse, e comportamento de transição de ^1,10. Existe uma necessidade de quantificar e os padrões de comportamento dinâmica do (s) específico para estas células em grupos que infestam.

Aquisição de dados motilidade Surface, análise e interpretação pode ser complicado e qualitativa. Nós desenvolvemos um protocolo para a análise macroscópica detalhada dos enxames bacterianas que fornece, além de enxame morfologia zona e sIze (por exemplo, de diâmetro), a informação dinâmica quantitativa em relação à taxa de expansão enxame e bacteriana ou densidade bioprodutos distribuição ^7. Além disso, este método pode tirar vantagem das proteínas fluorescentes disponíveis, luminescência, e corantes para obter uma visão global de interacções bacterianas ^8, bem como para controlar a síntese de bioprodutos (por exemplo, P. aeruginosa ramnolipido ^7,8) dentro de um enxame.

Protocol

1. Swarm Ensaio Mídia Preparação e inoculação ^4,5,7,8,11

1. Preparação de Mídia
   NOTA: A composição do meio descrito a seguir é aplicável a P. aeruginosa estudos de formação de mecha. Por favor, consulte as especificações de mídia da Tabela 1 para P. aeruginosa, B. subtilis, e M. xanthus ensaios de motilidade superfície.
   1. Misturar 200 ml de FAB-menos (NH _{4) 2} SO ₄ médias enxame (Materiais Tabela), 0,9 g de agar Noble, e 0,2 g de casaminoácidos (Tabela 1) por agitação com uma barra de agitação magnética. Use pequenos volumes (100-300 ml) para melhorar a consistência entre os experimentos.
   2. Autoclave a mistura 200 ml de ágar / meio utilizando um tempo de exposição de 22 min, temperatura de exposição de 121,1 ° C, e uma opção de ventilação rápida. As configurações de autoclave vai permitir a esterilização adequada e de fusão de agar, mas impedir caramelização ágar.
      NOTA: agar Noble está propenso a carameloização; motilidade bacteriana é alterada em agar caramelizado.
   3. Imediatamente após o ciclo de esterilização foi finalizado, feche a tampa da garrafa de mídia para evitar a perda de água por evaporação. No entanto, note que tampar apertado pode causar um "vácuo de vedação" efeito -como na garrafa.
   4. Arrefece-se a meios para 50 ° C enquanto se agitava à temperatura ambiente (TA) e adicionar 2 ml de glicose 1,2 M estéril. Alternativamente, coloque a mídia em uma incubadora ou água de banho de 60 ° C até que esteja pronto para usar (até 15 horas mais tarde), e prosseguir como indicado. Para evitar a formação de bolhas na mídia, misture bem usando a barra magnética; bolhas na superfície do agar irá evitar mesmo enxame.
      NOTA: Para outros ensaios, adicionar a este passo os componentes sensíveis ao calor, que não pode ser autoclavado, tal como nutrientes ou corantes adicionais, conforme necessário (por exemplo, a adição de 8 ul Invitrogen Syto 63 corante por 100 ml de ágar derretido a imagem de M. xanthus como mostrado em representative resultados, abaixo). A adição de alguns corantes podem afetar o comportamento de enxame de base, que deve ser verificado com um controle não-dye.
   5. Em uma capa de laboratório, alíquota de 7,5 ml de meio estéril por 60 milímetros de diâmetro poliestireno placa de Petri e manter as placas em uma única camada (não empilhados). Para a superfície swarming maior, alíquota de 25 ml de meio por 100 mm de diâmetro placa de Petri. É importante para encher os pratos sobre uma superfície plana horizontal. Use o nível de um olho de boi para verificar se a superfície está nivelado.
      NOTA: Para P. ensaios aeruginosa, utilizando um volume de mídia específicos por placa irá melhorar a consistência e reprodutibilidade. Para B. subtilis e M. ensaios xanthus, derramando mão produz resultados comparáveis ​​aos alíquotas de volume específicos.
2. Placa de cura
   1. No caso de pequenas placas (60 mm), permitir que o meio de agar derretido para curar (definidas como o excesso de líquido semi-sólido e seco) na capa descoberto (isto é, sem tampas) durante 30 min. Maiorplacas (100 mm) exigem um maior tempo de cura (ver Discussão).
      NOTA: Como alternativa, alguns ensaios pode exigir placas para curar no topo de bancada durante a noite (20-24 h) coberta (isto é, as tampas nos) em uma única camada (Tabela 1). Pulular é sensível tanto ao excesso de humidade e inadequada. A umidade, fluxo de ar e temperatura de qualquer laboratório pode necessitar de variação para a chapa de cura para promover swarming ideal de você bactéria.
   2. Inocular placas imediatamente após o período de secagem é longo. Não guarde as placas para posterior utilização.
      1. Realizar o "teste de difusão de tinta" através da identificação de uma placa de ensaio com 10 ul de mistura de 0,50% (vol / vol) Higgins UV Índia tinta preta e ¹¹ inoculo bacteriano. Se a mistura de tinta / inóculo se espalha rapidamente (ou seja, não retém a forma de gota) na superfície dos meios de comunicação, a mídia vai precisar de mais tempo para secar.
         NOTA: Para as espécies que são particularmente sensíveis à umidade ( por exemplo, P. aeruginosa), realizar um "teste de tinta propagação" quick ¹¹ para determinar se as placas são suficientemente seca.
3. Swarm Ensaio Inoculação
   1. Inocular 6 ml de meio de cultura de caldo (ver Tabela 1 para detalhes) com uma colónia isolada fresca a partir de uma (<5 dias de idade, se deixada à temperatura ambiente) Lisogenia Broth (LB) placa de cultura. Incubar durante a noite culturas em caldo (≤18 hr) a 30 ° C ou 37 ° C com agitação horizontal (240 rpm).
   2. Inocular placas enxame manchando com 1-5 mL de caldo de cultura durante a noite, ou por "cutucar" o agar com um dente estéril escolher ou agulha de inoculação fio.
      NOTA: Nós preferimos este último método, porque diminui o risco de salpicos de inoculo e evita a adição de humidade adicional à área de superfície enxame.
4. Swarm Ensaio Incubação
   1. Para o ensaio geral, incubar placas de ensaio enxame em 30 °C ou 37 ° C (ou até mesmo 42 ° C para B. subtilis; Tabela 1) -isto é bactéria específica. Inverter as placas durante a incubação, de modo que o excesso de humidade condensa-se sobre a tampa, não o ágar.
      NOTA: A temperatura pode afectar o fenótipo bem como a cinética. Para P. enxames aeruginosa, incubação a 37 ° C conduz ao crescimento e expansão enxame mais rápido do que a incubação a 30 ° C; no entanto, a morfologia destas enxames difere frequentemente com esta mudança na temperatura.
   2. Para imagens de time-lapse, incubar as placas enxame à temperatura adequada antes de serem transferidos para a estação de imagens (ver Tabela 1 para detalhes).
      NOTA: Esta incubação pré-imaging permite enxames para começar o seu desenvolvimento e se estabelecer antes de ser transferido para um novo ambiente, que pode ou não ser o ideal para a enxameação.

2. imagem macroscópica de Superfície Motilidade Ensaios ^7,8

1. Para geração de imagens de lapso de tempo, após os pré-imagem placas de ensaio enxame período de incubação lugar em uma placa de imagem clara dentro de uma estação de imagens in vivo comercial. Imagem até seis, 60 mm de diâmetro ou quatro, placas de 100 mm de diâmetro de cada vez. Dado que a câmara capta imagens de baixo do plano de imagem, inverter as placas de modo a que o percurso óptico não é obstruída ^8. Alternativamente, incuba-se a 30 ° C ou 37 ° C (Tabela 1) para a duração da experiência, e remover as placas a ser trabalhada a partir da incubadora em intervalos de tempo definidos.
2. Coloque as tampas das caixas de Petri na posição vertical no topo da contraparte placa que contém o meio inoculado. Encha as tampas das caixas de Petri com água para evitar o ressecamento excessivo durante o exame, e colocar todo o conjunto acima de usar outra bandeja clara para manter a umidade durante todo o experimento.
3. Usando Imagem Molecular (MI) software ^12, ensaio executado (s) em temperatura ambiente usando o imenvelhecimento configurações descritas na Tabela 2. Para imagens de lapso de tempo, estabelecer um protocolo com os passos e as especificações necessárias.

3. Processamento de Dados e Interpretação ^7,8

1. Processamento De Imagem
   1. Use software MI para exportar imagens em lote como arquivos TIFF de 16 bits: Arquivo> Exportar ou exportar várias> Selecione o arquivo (s) para exportar e local de exportação.
   2. Use ImageJ para abrir uma única imagem ou importar uma série time-lapse:
      1. Abra uma única imagem: File> Open
      2. Importação de lapso de tempo seqüência de imagens: File> Import Sequence, e selecione "Classificar nomes numericamente".
         1. Para arquivos de lapso de tempo maiores, selecione "Usar pilha virtual" na janela "Importar Sequence" para empilhar as imagens exportadas em categorias apropriadas (ie, GFP, RFP, etc.).
   3. Se necessário, alterar imagens de arquivos de 16 bits para arquivos de 8 bits: Imagem> Tipo> 8-bit
      NOTA: Algumas ferramentas ImageJ exigem imagens de 8 bits.
   4. Determinar se a intensidade do sinal para uma sequência de imagens ou de lapso de tempo tem de ser invertida. Coloque o cursor em um ponto brilhante na imagem (por exemplo, o crescimento marcado por fluorescência) e anote a intensidade do sinal "Valor" na barra de ferramentas ImageJ. Em seguida, coloque o cursor em um local escuro fora da área de placa e observar a intensidade do sinal. Se a intensidade do sinal para o ponto escuro é maior do que a intensidade para o ponto brilhante, a intensidade de sinal de imagem tem de ser invertida (siga subpassos 1-2 abaixo).
      1. Inverta os sinais de intensidade: Editar> Invert
      2. Inverta a tabela de referência: Imagem> Tabelas de Pesquisa> Invert LUT
   5. Subtrair o background: Processo> Subtrair fundo, e usar um "raio de rolamento bola" com um raio de pixel que é metade de uma dimensão de imagem (por exemplo, 1.000 pixels para um 2000 x 2000 pimagem Ixel).
   6. Artificialmente colorir uma imagem ou time-lapse sequência: Imagem> tabelas de pesquisa e selecione a cor apropriada entre as opções da lista.
   7. Para filmes com dois ou mais canais, fundir e equilibrar as cores antes de salvar como um filme (Processamento de Imagem, Passo 8). Para mesclar imagens juntas, aberto todos os pilhas de imagens em ImageJ, em seguida, selecione Imagem> Cor> Mesclar Canais, e atribuir a cada pilha para um canal de cor.
   8. Salve seqüência de lapso de tempo como AVI ou QuickTime Filme: Arquivo> Salvar como e escolher o formato e especificações desejadas.
2. Análise De Dados
   1. Adquirir bacteriana da área de superfície do Crescimento para Quantificar taxa de expansão
      1. Abrir imagem (s) em ImageJ
      2. Para calcular o diâmetro da placa em pixels, desenhe uma linha que atravessa o centro de uma placa de ensaio com a ferramenta "Straight" do e medir seu comprimento: Analisar> Medida
      3. A unidade de medida padrão no ImageJ é o pixel. Obter um factor de conversão, dividindo o diâmetro da placa de ensaio (por exemplo, 60 para uma placa de 60 mm) do comprimento do pixel obtido na etapa anterior.
      4. Alterar a unidade de medida de pixel para mm: Imagem> Propriedades
         1. Altere a "unidade de comprimento" para "mm", e do "Pixel Largura", "Altura Pixel" e "Voxel Profundidade" para o fator de conversão calculado na etapa anterior. Marque a caixa "Global" para manter esse fator de conversão através de várias imagens.
            NOTA: Se ImageJ é fechado e reaberto, ou o campo de visão de uma imagem é alterada (ou seja, uma imagem é ampliada em mais de um outro), o fator de conversão deve ser recalculado. Como alternativa, realizar todas as análises em pixels e depois convertido para mm.
      5. Para cada quadro, rastrear e medir a área de enxame utilizando a ferramenta "Freehand Selections" na barra de ferramentas para rastrear a UOtline do enxame e medir a área usando: Analisar> Medida. Isso irá gerar um medições log que pode ser guardado para posterior análise no Microsoft Excel ou programas similares: Arquivo> Salvar como
   2. Adquirir bacteriana Intensity superfície de crescimento para Quantificar Superfície Taxa de Crescimento
      1. Uma vez que o fundo é subtraído (Processamento de Imagem, Passo 5), use o último quadro da seqüência para determinar a área máxima de enxame (Análise de Dados, Passo 1).
      2. Use a ferramenta de seleção "Oval" na barra de ferramentas para desenhar uma caixa em torno do crescimento de superfície bacteriana.
      3. Defina a medida de intensidade de pixels na caixa usando dizer: Analisar> Definir Medidas, e selecione "valor de cinza média".
      4. Para obter medições de intensidade de sinal para cada quadro na seqüência de lapso de tempo, enquanto no primeiro quadro da seqüência acesse: Analisar> Medida. Isso irá gerar um medições log que pode ser guardado para posterior análise em Microsoft Excel ou programas similares: Arquivo> Salvar como
   3. Alternativa para a seção anterior (Análise de Dados, Passo 2). Use o plugin ImageJ Macros de configurar e executar um crescimento de superfície medida de intensidade de roteiro Macros.
      1. Setup um script de medição automatizada para analisar vários quadros simultaneamente: Plugin> New> Macro, e cole o script fornecido (abaixo) na caixa e salvar como um arquivo de texto ImageJ Macros: File> Save, e salvar a pasta do aplicativo ImageJ sob " macros ".
         numberOfFrames = N
         for (i = 0; i executar ('Medida');
         executar ('Next Slice [>]');
         }
         NOTA: Aqui, a variável "N" é para um número indefinido de quadros.
      2. Edite os "numberOfFrames" no plugin Macros para cada experimento para refletir o número de quadros na seqüência de imagens antes de executar o script. Use: Plugin> Macros>Editar e digite o número correto de quadros na seqüência e salvar (Arquivo> Salvar).
      3. Siga subetapas 1-3 em Análise de Dados-Step 2, e enquanto no primeiro quadro da seqüência de executar o plugin Macros: Plugin> Macros> Executar. Isso irá gerar um medições log que pode ser guardado para posterior análise no Microsoft Excel ou programas similares: Arquivo> Salvar como

Results

Variação da placa preparação pode influenciar bastante enxameação. A cura ou secagem tempo após o vazamento de meio agar derretida afeta o filme fino líquido presente nos ensaios de motilidade de superfície e da motilidade bacteriana ao longo do tempo. Alterações na composição nutriente também afectar enxame para várias bactérias. A Figura 1A mostra um efeito de curto prazo de tempo de secagem mediante espalhamento da tinta da índia e propagação de um inoculo inicial de Bacillus subtilis ^11. A Figura 1B mostra o efeito do tempo de secagem e a Figura 1C mostra os efeitos do sulfato de amônio _{[(NH4) 2} SO _4] sobre o desenvolvimento posterior mecha por swarming P. aeruginosa ^5.

Dados quantificáveis ​​podem ser obtidas a partir de imagens de ponto de extremidade de motilidade superfície usando várias estratégias de imagem. A Figura 2 mostra resultados representativos de crescimento superfície para B. sua imagem de bioluminescência associada subtilis swarming e; ea imagem de fluorescência vermelha associada de SYTO Myxococcus xanthus crescimento de superfície e as células de 64 vitrais.

Expansão de aquisição de dados para além de apenas inspecção e de resultados de imagem de pontos de extremidade permite o estudo do comportamento dinâmico (s) para o crescimento de bactérias na superfície. A Figura 3 ⁷ mostra um exemplo de P. aeruginosa swarming (fotografada por células expressando GFP) e sua produção ramnolipido associado (fotografada usando Nile Red manchas de gorduras) -o quantificação de dados destas imagens também é exibido para mostrar a taxa de expansão do P. aeruginosa enxameação. Video 1 mostra um lapso de tempo de B. subtilis swarming fotografada usando luminescência de um -expressing estirpe lux. Video 2 ⁸ mostra um lapso de tempo de P. aeruginosa Salmonella enterica sorotipo (lux red-expressando) em um ensaio enxame competitivo.

Figura 1: Exemplos de fatores na preparação ensaio de motilidade superfície que afetam resultado ensaio Efeito de (A) o tempo de secagem em agar agar umidade da superfície e espalhando de inóculo para B.. subtilis (Ref ^8), (B) o tempo de secagem em agar e P. aeruginosa swarming (Reproduzido de Ref ⁵ com permissão), e (C) presença ou ausência de sulfato de amônio em P. aeruginosa swarming e formação de mecha.

Figura 2: Alternative abordagens para o crescimento da superfície de imagem e motilidade de bactérias usando uma estação de imagens Bruker. Side imagem ao lado de uma câmera (à esquerda) e por imagem Bruker (direita) que mostram (A) P. aeruginosa expressando (B) B. usando as configurações de Fluorescência verde, fotografada-GFP subtilis expressando lux bioluminescência usando as configurações de luminescência, e fotografada-repórter (C) M. xanthus corados com SYTO 64 fotografada usando configurações Red Fluorescência II. Ver Tabela 2 para definir detalhes.

Figura 3:. A análise qualitativa e quantitativa de uma superfície de ensaio de motilidade (A) análise de lapso de tempo de distribuição da densidade de células, a produção de ramnolipido (mancha vermelha do Nilo lipídico fotografada usando a fluorescência vermelhaI configurações; barra de escala = 15 mm), e (B) quantificação da taxa de expansão a partir de imagens de distribuição de densidade de células de uma P. aeruginosa enxame. (Reproduzido de Ref ⁶ com permissão.)

Video 1. Time-lapse imagem de um B. subtilis enxame. B. subtilis expressando lux e gravados usando as definições de luminescência. Ver Tabela 2 para definir detalhes.

Video 2. competição Interspecies visualizado por imagem time-lapse. Enxames de P. aeruginosa (verde; expressando GFP e gravados usando as definições Fluorescência verde) e S. enterica sorotipo Typhimurium (vermelho; exprescantar lux e gravados usando as definições de luminescência). Ver Tabela 2 para definir detalhes. (Reimpressão com permissão de Ref. ⁷⁾

	P. aeruginosa	P. aeruginosa estudos de formação tendril	B. subtilis	M. xanthus
Meios de cultura caldo Overnight	FAB mais 30 mM de glicose	FAB mais 30 mM de glicose	LB	CTT
Caldo de cultura durante a noite a temperatura de incubação	37 ° C	37 ° C	37 ° C	30 h a 30 ° C
Media Enxame	FAB	FAB menos (NH 4) 2 SO 4	2% (p / vol) LB	CTT
Media Enxame: componentes adicionais	12 mM de Glicose um	10% (peso / vol) CAA, 12 mM de Glicose um	n / d	SYTO® 64 um
Tipo de Agar	Agar, Noble	Agar, Noble	Agar Granulated	Agar, Noble Affymetrix
Concentração de agar (p / v)	0,45%	0,45%	0,60%	1,50%
Tamanho da placa Swarm	60 milímetros	60 milímetros	100 milímetros	150 milímetros
Volume de mídia por placa	7,5 ml	7,5 ml	Mão Derramado	Mão Derramado
Configuração de mídia Enxame método / secagem	Exaustor; placas descoberto	Exaustor; placas descoberto	De bancada; placas cobertas	De bancada; placas cobertas
Configuração de mídia Enxame / tempo de secagem	30 min	30 min	Overnight (20 -24 h)	Overnight (20 -24 h)
Swarm temperatura ensaio de incubação	30 ou 37 ° C	30 ° C	37 ° C	30 ° C
Incubação de lapso de tempo de imagem	30 ° C durante pelo menos 4 h	30 ° C durante pelo menos 4 h	37 ° C durante 2 hr	RT durante 12 hr
Time-lapse comprimento captura	24 hr	24 hr	10 hr	66 hr
Configuração Time-lapse	1 frame / 10 min	1 frame / 10 min	1 frame / 6 min	1 frame / 10 min
Adicionado após a autoclavagem.

Tabela 1:. Especificações para Superfície Motilidade Ensaio preparação inclui superfícieespecificações de preparação do ensaio de motilidade para P. aeruginosa, B. subtilis, e M. xanthus.

Sinal	Fluorescência Verde	Red Fluorescência I	Red Fluorescência II	Luminescência
Proteína ou corante	Proteína de Fluorescência Verde (GFP)	proteína mCherry ou Nile Red ramnolipido mancha	SYTO® 64	Luciferase de lux operon
Comprimento de onda de excitação (nm)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	Fora
Comprimento de onda de emissão (nm)	535 ± 17,5	600 ± 17,5	670 ± 17,5	Sem filtro
O tempo de exposição (seg)	30	60	60	240
parada f-	4	4	2,5	1.1
FOV (mm)	190	190	140	120
Plano focal (mm)	27,5	27,5	12.2	4
Binning (pixels)	Nenhum	2 x 2	Nenhum	8 x 8

Tabela 2: Geração de Especificação especificações estação Bruker imaging para fluorescência vermelha e verde, e luminescência de imagem de crescimento de superfície bacteriana..

Discussion

Alcançar swarming reproduzível em laboratório pode ser um desafio, como ensaios enxame são altamente sensíveis a fatores ambientais, tais como umidade e nutrientes disponíveis. O aspecto mais crítico de um ensaio de placa de motilidade superfície humidade na superfície do agar. Antes da inoculação, media enxame deve estar seco o suficiente para evitar que as células bacterianas de nadar em todo o líquido da superfície, mas não tão seco como para inibir a enxameação ^5. A incubação deve ocorrer em um ambiente suficientemente úmido: muito pouca umidade pode resultar no ensaio de secagem durante a incubação, enquanto muita umidade pode levar a superfície artificial ou artifactual espalhando. A menos que uma incubadora de umidade controladas está à mão, incubadora e laboratórios umidade pode variar drasticamente. Por conseguinte, um reservatório de água adicional, um humidificador ou um desumidificador dentro da incubadora pode ser necessário para evitar o excesso de secagem ou a acumulação de excesso de humidade, mantendo o Relative umidade perto de 80%. A manutenção dessa umidade ideal pode ser um desafio, se mudanças de umidade sazonais são significativas. Se este for o caso, o protocolo de ensaio enxame vai exigir alguns ajustes para explicar as mudanças sazonais na umidade. Descobrimos que modificar o tempo de secagem da mídia enxame é a maneira mais simples para ajustar para mudanças de umidade sazonais. Monitoramento de umidade constante, tanto dentro como fora da incubadora, é recomendado. Além disso, recomenda-se que os pesquisadores calibrar e validar os seus instrumentos, incubadoras, balanças, etc. erros como menores na temperatura, volume ou quantidade de componentes de mídia pode afetar a reprodutibilidade destes ensaios.

Deve também ser notado que o tipo e tamanho da placa utilizada no ensaio pode afectar a placa de humidade, e, assim, enxame. Placas hermeticamente fechados não desabafar o excesso de umidade, assim motilidade natação encorajador. Em contraste, as placas de face aberta permitem muita umidade para escapar. Uma placa de Petrifornece um ambiente ideal porque desabafa off suficiente excesso de umidade para evitar que o líquido se acumulam, mas retém a umidade suficiente para impedir a mídia de secar. Este método detalha um protocolo de ensaio de motilidade superfície que permite a imagem de alta qualidade. Para manter o agar clara para pratos de imagem 60 milímetros de diâmetro são preenchidos com 7,5 ml de ágar. Se imagiologia detalhada não é necessária, os volumes de até 20 ml, também pode proporcionar resultados reprodutíveis.

Enquanto motilidade enxame pode ser conseguida através de uma ampla gama de concentrações de ágar, a gama óptima de ágar necessária para enxame depende das espécies. No geral, mais elevadas concentrações de ágar inibem enxameação e, conseqüentemente, o tempo necessário para produzir uma imagem pronta enxame aumenta. P. aeruginosa geralmente pulula sobre as concentrações de ágar entre 0,4-0,7% ^1, no entanto, descobrimos que swarming ideal ocorre em uma faixa muito estreita (0,4-0,5%). Outros, como B. subtilis e S. entéricoum enxame de 0,6% de ágar e Vibrio parahaemolyticus em 1,5% agar ^10. A concentração necessária de ágar também é determinada pelo tipo e marca de ágar. Maiores agares de pureza, como agar Noble, fortemente aprimorar pululando em P. aeruginosa e são preferidos em relação granulado ágar ^13,14. No entanto, estas versões purificadas de ágar são também mais propensas a caramelização durante o ciclo de esterilização em autoclave; dependendo do instrumento, um encurtado / sequência de esterilização modificado (para possivelmente alterar o ciclo de escape para evitar a exposição prolongada do calor) pode ser necessária para preparar a mídia enxame utilizando ágar Noble.

Composição de mídia também desempenha um papel no fenótipo enxame observado ^3. P. aeruginosa estudos da motilidade swarming geralmente são realizadas por meio de nutrientes mínimos. Nós preferimos FAB médio ^{de 4,8} (Tabela de Materiais), mas outros meios de comunicação, tais como M9, LB, ou pequenas variações para essas mídias comuns,têm sido utilizados com sucesso ^9,15,16. Formação Rebento é melhor conseguida em FAB meio mínimo suplementado com glucose como fonte de carbono e de casaminoácidos (CAA), mas sem uma fonte de azoto adicional (ou seja, (NH _{4) 2} SO ₄₎ ^6,13. Se a formação do cacho ou morfologia não é o foco principal do estudo, então FAB meio mínimo (Tabela de Materiais; Tabela 1) desprovida de CAA é recomendado para que os efeitos das fontes de carbono específicos e / ou nutrientes adicionais podem ser estudados em detalhe. Outras espécies, tais como B. subtilis (apresentado aqui), são swarmers versáteis, capazes de pululando em LB e agar granulado. Estas espécies enxame facilmente, necessitando apenas de ~ 10 horas para desenvolver um enxame inteiro. Esta taxa rápido swarming faz seguindo a progressão do enxame potencialmente difícil, mas nosso protocolo faz tal rastreamento muito viável. A capacidade de realizar enxame de lapso de tempo de imagem fornece uma substancial facilidade na aquisição de dados enxame, particularmente a partir de tais swarmers ávidos.

Nós introduzimos um, abrangente protocolo de duas fases robusto e orientações destinadas a melhorar a execução e reprodutibilidade da pesquisa motilidade superfície bacteriana e têm enfatizado principalmente aspectos importante examinar swarming mediada por flagelar. Este protocolo de ensaio enxame detalhes importantes aspectos da composição do meio e manuseio de placas de motilidade superfície para dar uma maior consistência e reprodutibilidade dentro e entre os grupos de pesquisa. Isto irá melhorar a base de comparação entre os diferentes estudos de investigação. Além disso, a abordagem apresentada e protocolo fornece meios para fazer pesquisa sobre swarming e superfície motilidade menos suscetíveis a variações ambientais, fazendo pesquisadores cientes de que tais fatores afetam o seu trabalho e fornecimento de soluções possíveis (por exemplo, como pequenas mudanças na agar afetar swarming ^4,5 ). Além disso, o protocolo fornecido paraquantificar aspectos macroscópicos da swarming, oferece uma oportunidade para medir muitos atributos de crescimento da superfície bacteriana que antes eram inquantificável.

Nós não examinaram todas as bactérias de superfície motilidade no desenvolvimento deste protocolo. Como tal, espera-se que as modificações do protocolo irá ser necessária para espécies não apresentados aqui. A eficiência deste protocolo será restringido pelos limites inerentes ao equipamento e os materiais utilizados. Por exemplo, estudos de temperatura relacionado não são possíveis ainda com a estação de imagens Bruker, uma vez que o controlo de temperatura não é uma característica do equipamento. Além disso, a utilização de corantes (tal como Vermelho do Nilo para corar rhamnolipídeos) pode ter limitações cinéticas e de concentração ^8. Esta técnica baseia-se fortemente sobre o processamento e análise de imagens digitais; melhor automação de análise de dados (por exemplo, usando Macros adicionais de função script no ImageJ) reduziria o tempo necessário para análisee expandir a utilidade dos dados. Finalmente, devido à robustez do protocolo de imagem, aplicações futuras devem visar a expansão dessa técnica para examinar as superfícies de crescimento menos uniformes que são mais relevantes para superfícies colonizados por bactérias ambientais e patogênicos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagentsa
FAB Mídia mínima:			Prepare a cada ~4 semanas. Topo para 1  L com H2O nanopuro.
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	2 g. Não usado em estudos de formação de gavinhas P. aeruginosa.
Na2HPO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	S9390	9 g
KH2PO4	Sigma	P5655	3 g
de NaCl	BDH	BDH8014	3 g
de solução de MgCl2 x 6H2O (198 g/L)	Fisher Scientific	M33	1 ml de
CaCl2 x 2H2O solução (14 g/L)	Fisher Scientific	C79	1 ml
de solução de metais residuais (ver abaixo)	n/a	n/a	1 ml
Trace Metal Solution:			Cubra com 1 L com H2O. nanopuro Conservar num frasco de vidro, mexendo e coberto com papel alumínio.
CaSO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	255548	200 mg
MnSO4 x H2O	Sigma-Aldrich	M7634	20 mg
CuSO4 x 5H2O	Fisher Scientific	C493	20 mg
ZnSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Z4750	20 mg
CoSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	C6768	10 mg
NaMoO4 x 2H2O	Sigma	S6646	10 mg
H3BO3	Fisher Scientific	A74	5 mg
FeSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	F7002	200 mg
CTT Media:			Prepare conforme necessário. Topo para 100 ml com H2O. nanopuro.
Tris-HCl, solução 1 M (ajustar para pH 8,0)	Amresco	0234	1 ml. Prepare uma solução estoque 1 M em H2O. nano puro. Ajuste o pH para 8,0 e esterilize por filtro (0,2 μ m poro).
K2HPO4, solução 1 M (ajustar para pH 7,6)	Sigma-Aldrich	P3786	0,1 ml. Prepare uma solução-mãe 1 M em H2O. Ajuste o pH para 7,6 e filtre a esterilização (0,2 μ m poro).
MgSO4 solução	Fisher Scientific	M65	0,8 ml. Prepare uma solução estoque 1 M em H2O. nano puro. Esterilize por filtro (0,2  μ m poro).
Casitone	BD Diagnostics	225930	1 g
Reagentes adicionais:
LB Caldo, Lennox	BD Diagnostics	240230	2% (peso/vol)
D-(+)-Glicose	Sigma-Aldrich	G5767	30 mM para culturas de caldo durante a noite; 12 mM para meios de enxame. Prepare uma solução de estoque esterilizada com filtro de 1,2 M em H2O. nano puro Adicione à mídia após a autoclavagem.
Ácidos Casamino (CAA)	Amresco	J851	0,10% (peso / vol). Recomendado para estudos de formação de gavinhas P. aeruginosa. Adicione à mídia antes da autoclavagem.
Agar, Noble	Sigma-Aldrich	A5431	0,45% (peso / vol). Ágar Noble preferido para estudos de motilidade superficial P. aeruginosa. Adicione à mídia antes da autoclavagem.
Ágar, Noble	Affymetrix	10907	1,50% (peso / vol). Usado em estudos de motilidade de superfície M. xanthus. Não recomendado para estudos de motilidade P. aeruginosa. Adicione à mídia antes da autoclavagem.
Ágar, Granulado	Fisher Scientific	BP1423	0.60% (wt/vol)
Higgins Tinta da Índia Preta à Prova d'Água	Higgins	HIG44201	0.50% (vol/vol). Misture tinta com inóculo para testar a umidade da superfície do meio de enxame.
SYTO® 64 Mancha de ácido nucleico fluorescente vermelho	Invitrogen	S-11346	Use 4 μ l (para P. aeruginosa) ou 8 μ l (para M. xanthus) do SYTO® 64 por 100 ml de ágar fundido (adicionado após autoclavagem).
Materiais e Equipamentos Relevantes
Petri dish, estéril, 150  mm x 15 mm (Diâmetro x A)	VWR	25384-326
Placa de Petri, estéril, 100  mm x 15 mm (Diâmetro x A)	VWR	25384-342
Placa de Petri, estéril, 60 mm x 15 mm (Diâmetro x A)	VWR	25384-092
In-Vivo Xtream	Bruker		Utilização para a obtenção de imagens macroscópicas de estudos de motilidade superficial. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html
Bruker MI software	Bruker		http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf
software ImageJ	NIH		http://imagej.nih.gov/ij/
aConsulte MSDS de reagentes para obter informações sobre manuseio e descarte.