Aqui apresentamos um protocolo que gera grandes quantidades de monócitos murinos a partir de medula óssea heterogênea para aplicações translacionais. Em comparação com outros, esse novo método ajuda a reduzir o número de animais sacrificados e reduz os custos, evitando métodos caros, como a separação de células magnéticas de alto gradiente (MACS).
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Artigo de método
Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Como um subtipo de leucócitos e progenitores de macrófagos, os monócitos estão envolvidos em muitos processos importantes dos organismos e são frequentemente objeto de vários campos da ciência biomédica. O método descrito abaixo é uma maneira simples e eficaz de isolar monócitos murinos da medula óssea heterogênea.
A medula óssea do fêmur e da tíbia de camundongos Balb/c é colhida por lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS). A suspensão celular é suplementada com fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) e cultivada em superfícies de fixação ultrabaixa para evitar a diferenciação de monócitos desencadeada pela adesão. As propriedades e diferenciação dos monócitos são caracterizadas em vários intervalos. A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), com marcadores como CD11b, CD115 e F4/80, é usada para fenotipagem. No final do cultivo, a suspensão é composta por 45%± 12% de monócitos. Ao remover macrófagos adesivos, a pureza pode ser aumentada em até 86%± 6%. Após o isolamento, os monócitos podem ser utilizados de várias maneiras, e um dos métodos mais eficazes e comuns para entrega in vivo é a injeção intravenosa da veia da cauda.
Esta técnica de isolamento e aplicação é importante para estudos de modelos de camundongos, especialmente nas áreas de inflamação ou imunologia. Os monócitos também podem ser usados terapeuticamente em modelos de doenças de camundongos.
Introdução
O isolamento de monócitos é importante e crítico para muitos estudos in vitro e in vivo. Essas células são alvos de doenças como doença arterial periférica, doença cardíaca coronária ou outras doenças isquêmicas, uma vez que o crescimento dos vasos colaterais é fortemente impulsionado pela inflamação local. As respostas inflamatórias incluem ativação endotelial e recrutamento local de leucócitos, principalmente monócitos, que então amadurecem em macrófagos e criam um ambiente altamente arteriogênico secretando múltiplos fatores de crescimento para induzir a remodelação de uma arteríola em uma artéria colateral funcional1-3. Os monócitos ta....
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Protocolo
Este estudo foi realizado com autorização do Estado da Saxônia e Saxônia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, de acordo com a Seção 8 da lei alemã de protecção dos animais (24D-9168,11-1 / 2008-24).
1 Isolamento celular
1.1 Preparação do fémur e da tíbia
- Anestesiar o mouse usando uma concentração de isoflurano 5% vaporizando isoflurano em uma lixeira fechada. Após o mouse parou de se mover por 3 s, realizar o deslocamento cervical.
- Desinfectar os membros posteriores com etanol (96%). Retire a pele e os músculos e os ossos separar com um bisturi estéril.
- Comece com uma incisã....
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Resultados
A solução de células extraídas da medula óssea de murídeo consiste em vários tipos de células. Os principais tipos de células são linfócitos, granulócitos e monócitos. Os tipos de célula pode ser estimado pelo tamanho e granularidade, que é mostrado na Figura 1, tanto para as suspensões nativas e as células colhidas depois de 5 dias de diferenciação. Observe a composição celular mudando durante o cultivo. No entanto, a classificação exata das populações deve contar com expressão distintiva de marcadores.......
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Discussão
Nós descrevemos um método simples e de baixo custo para isolar grandes quantidades de monócitos murino de medula óssea. Em comparação com outros protocolos utilizando sangue periférico, que obtêm rendimentos de monócitos 5 de 1,4 x10 6, somos capazes de obter rendimentos mais elevados, de 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monócitos a partir de um único rato doador.
Ao considerar os desafios com este método, é importante mencionar o potencial de contaminação qua.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fundação Alemã de Pesquisa) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centro de pesquisa colaborativa).
Obrigado a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburg, Alemanha, pelo suporte técnico.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de 6 poços de ultra-baixa fixação | Corning Incorporated, NY, EUA | Placa de 6 poços de ultra-baixa-fixação, com tampa, estéril | |
| 8- 12 semanas de idade, macho, camundongos balb/c | Charles River, Sulzfeld, Alemanha | ||
| Placa de 96 poços | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Alemanha | ||
| Mancha de células mortas azuis | Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha | ||
| Albumina de soro bovino | GE Healthcare, Freiburg, Alemanha | Fração V, pH 7,0 | |
| Cânulas | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemanha | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, EUA | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, EUA | 53-0112 | |
| Placa de cultura de células | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha | Com tampa, centrífuga estéril | |
| Beckman | Coulter GmbH, Krefeld, Alemanha | Allegra® Centrífuga X-15R | |
| Creme depilatório | Veet, Mannheim, Alemanha | ||
| Agente de desinfecção | Schü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Alemanha | Kodan Tinktur forte | |
| Bisturi descartável No.10 | Navalha de segurança de penas Co.Ltd, Osaka, Japão | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha | ||
| Etanol 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Alemanha | ||
| Unidade de extração Pipetus | Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Alemanha | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Dü sseldorf, Alemanha | MCA497APC | |
| Buffer FACS | Fabricado pelo nosso grupo com componentes | PBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3 | |
| FACS dispositivo | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, EUA | BD FACS Canto II | |
| Tubos FACS | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Pipeta Falcon® Becton | Dickenson Labware, NY, USA | ||
| Soro fetal para bezerros | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha | ||
| Pinça fina | Rubis, Stabio, Suíça | ||
| Luvas | Rö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Alemanha | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, EUA | 53-5931 | |
| Placa de aquecimento | Labotect GmbH, Gö ttingen, Alemanha | Placa Quente 062 | |
| Incubadora | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Alemanha | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Alemanha | ||
| Microscópio óptico | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Alemanha | Axiovert 40 ° C | |
| Fator Estimulador de Colônias de Macrófagos | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha | SRP3110 | |
| Agitador mecânico | IKA, Staufen, Alemanha | ms2 minishaker | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Áustria | Warm in 37 ° C banho-maria antes | |
| do uso Micro tubos de ensaio | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha | ||
| Bancada de trabalho microbiológica | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Alemanha | Hera safe | |
| Tampão de lavagem de monócitos | Fabricado pelo nosso grupo com componentes | PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Vários | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlim, Alemanha | ||
| NaN3 (ácido de sódio) | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha | ||
| Câmara de contagem Neubauer | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, Alemanha | ||
| Células de nylon | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Nova Jersey, EUA | Filtro de células, 70 µ m tamanho da malha | |
| Penicilina/Estreptomicina | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha | ||
| Fosfato tamponado salina | Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha | pH 7.4, pipetas estéreis | |
| Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha | 10µ l/100µ l/200µ l/1.000µ l | ||
| Pipetas sorológicas | Greiner | ||
| Unidade de sucção | Integra bioscience, Fernwald, Alemanha | Conforto Vacusafe | |
| Tesoura cirúrgica | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, EUA | ||
| B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemanha | Seringa de insulina Omnifix® -F de 1 ml | ||
| Tubos com tampa | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Alemanha | Tubos Cellstar de 15 ml/50 ml Banho-maria | |
| morno | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Alemanha | Julabo SW22 |
Referências
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
- Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C.
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Reimpressões e permissões
