Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo que gera grandes quantidades de monócitos murinos a partir de medula óssea heterogênea para aplicações translacionais. Em comparação com outros, esse novo método ajuda a reduzir o número de animais sacrificados e reduz os custos, evitando métodos caros, como a separação de células magnéticas de alto gradiente (MACS).

Resumo

Como um subtipo de leucócitos e progenitores de macrófagos, os monócitos estão envolvidos em muitos processos importantes dos organismos e são frequentemente objeto de vários campos da ciência biomédica. O método descrito abaixo é uma maneira simples e eficaz de isolar monócitos murinos da medula óssea heterogênea.

A medula óssea do fêmur e da tíbia de camundongos Balb/c é colhida por lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS). A suspensão celular é suplementada com fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) e cultivada em superfícies de fixação ultrabaixa para evitar a diferenciação de monócitos desencadeada pela adesão. As propriedades e diferenciação dos monócitos são caracterizadas em vários intervalos. A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), com marcadores como CD11b, CD115 e F4/80, é usada para fenotipagem. No final do cultivo, a suspensão é composta por 45%± 12% de monócitos. Ao remover macrófagos adesivos, a pureza pode ser aumentada em até 86%± 6%. Após o isolamento, os monócitos podem ser utilizados de várias maneiras, e um dos métodos mais eficazes e comuns para entrega in vivo é a injeção intravenosa da veia da cauda.

Esta técnica de isolamento e aplicação é importante para estudos de modelos de camundongos, especialmente nas áreas de inflamação ou imunologia. Os monócitos também podem ser usados terapeuticamente em modelos de doenças de camundongos.

Introdução

O isolamento de monócitos é importante e crítico para muitos estudos in vitro e in vivo. Essas células são alvos de doenças como doença arterial periférica, doença cardíaca coronária ou outras doenças isquêmicas, uma vez que o crescimento dos vasos colaterais é fortemente impulsionado pela inflamação local. As respostas inflamatórias incluem ativação endotelial e recrutamento local de leucócitos, principalmente monócitos, que então amadurecem em macrófagos e criam um ambiente altamente arteriogênico secretando múltiplos fatores de crescimento para induzir a remodelação de uma arteríola em uma artéria colateral funcional^1-3. Os monócitos também amadurecem em células dendríticas, que são freqüentemente usadas para estudos imunológicos^4,5 e pesquisas sobre câncer^6,7.

Problemático na abordagem para isolamento de monócitos do sangue periférico⁸ é o alto número de animais doadores necessários para produzir uma quantidade suficiente de monócitos para a maioria das análises. Os protocolos anteriores descrevem métodos como centrifugação com gradiente de densidade e depleção celular via MACS⁹ ao isolar monócitos; no entanto, essas técnicas podem alterar as características e a funcionalidade dos monócitos, o que pode levar a dificuldades de interpretação^10,11. Além disso, esses métodos são difíceis e podem reduzir a reprodutibilidade experimental.

Nosso objetivo com este protocolo é fornecer um método simples e econômico para gerar grandes quantidades de monócitos derivados da medula óssea. Devido ao alto rendimento celular de 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ células obtidas por este protocolo, podemos reduzir substancialmente o número de camundongos necessários durante o isolamento de monócitos derivados da medula óssea. O procedimento pode ser concluído em um período mínimo de tempo e sem usar técnicas caras e complicadas, conforme mencionado acima. Aqui, extraímos monócitos da suspensão nativa da medula óssea de camundongos doadores, cultivamos a suspensão em placas de fixação ultrabaixa e complementamos a solução com 20 ng/ml de M-CFS. No dia 5 de incubação, as células são colhidas e caracterizadas para confirmar as propriedades funcionais e fenotípicas.

Para experimentos no campo da arteriogênese, o transplante intravenoso desses monócitos derivados da medula óssea em camundongos é um método eficaz de administração sistêmica de medicamentos, que pode ser combinado com ligadura da artéria femoral em modelos comuns de doença arterial periférica.

Protocolo

Este estudo foi realizado com autorização do Estado da Saxônia e Saxônia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, de acordo com a Seção 8 da lei alemã de protecção dos animais (24D-9168,11-1 / 2008-24).

1 Isolamento celular

1.1 Preparação do fémur e da tíbia

1. Anestesiar o mouse usando uma concentração de isoflurano 5% vaporizando isoflurano em uma lixeira fechada. Após o mouse parou de se mover por 3 s, realizar o deslocamento cervical.
2. Desinfectar os membros posteriores com etanol (96%). Retire a pele e os músculos e os ossos separar com um bisturi estéril.
   1. Comece com uma incisão na pele inguinal, e estender a incisão em direção ao maléolo medial e realizar uma dissecação circular da pele ao redor do bezerro inferior. Remover a pele das pernas completamente por descascar proximalmente.
   2. Retire o músculo quadríceps do fêmur com um bisturi afiado, remova ambos os peroneus anteriore os grupos e músculo gastrocnêmio desarticular a perna na articulação do quadril, localizando e dissecando os ligamentos.
   3. Comece anterior e proceder ao redor da articulação, girando cuidadosamente a perna e cortando transversalmente os ligamentos, desarticulando, assim, a articulação.
3. Lavar fémur e da tíbia com etanol a 96% durante um período mínimo de 90 segundos para garantir a preparação de células asséptica. Continuar o processo de lavagem com PBS estéril para enxaguar restante etanol.
   Nota: Todos os passos subsequentes devem ser estéreis para evitar contaminação.

1.2 Colheita de Medula Óssea

1. Cortar a extremidade proximal e distal de cada osso com um par de tesouras finas para obter acesso aos veios femorais e tibiais. Tenha cuidado com este passo, uma vez que estes ossos se quebram com muita facilidade.
2. Lave os ossos com meio quente (M199 + 10% de soro fetal de vitelo (FCS), + 1% de Penicilina / Estreptomicina). Use uma agulha estéril de 28-G, uma seringa de 1 ml, e entre 10-15 ml por meio deosso para enxaguar.
3. Segure o osso com uma pinça fina e lavar um por um até que fique semi-translúcido. Cuidadosamente aplicar pressão para a extremidade do êmbolo da seringa, a fim de minimizar o stress celular.
4. Filtrar a medula óssea através de um 70 um nylon web e recolher o filtrado. Para extrair a quantidade máxima de medula óssea, lavar repetidamente a partir das extremidades distais e proximais.
5. Enxaguar a peneira com PBS e recolher o filtrado. Desalojar cuidadosamente detritos e conglomerados celulares por agitação suave e pipetagem.

1.3 Cultivo

1. Centrifuga-se a suspensão de células a 250 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células com aproximadamente 25 ml de meio. Repetir uma vez.
2. Ressuspender as células em 6 ml de meio depois do segundo passo de lavagem. Misturar 50 ul da solução de células com 50 uL de azul de tripano. Contar as células numa câmara de contagem sob um microscópio de luz. Calcula-se o número de cvaras na solução usando esta fórmula:
   
3. Semear as células em placas de superfície de ultra-low-fixação de 6 poços para evitar a aderência permanente para o fundo da placa. Usar uma concentração de 10 ⁶ células por ml, com até 6 ml por poço.
4. Complementar a suspensão com 20 ng / ml de M-CSF para promover a diferenciação de células.
5. Cultura das células durante 5 dias a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono e observar diariamente.

1.4 colheita de células

Nota: Estes passos devem ser realizados em gelo. Prossiga com ou 1.4.1 ou 1.4.2 em conformidade.

1. Neste ponto, efectuar a totalidade da cultura, incluindo os macrófagos diferenciados que aderem às placas de cultura, mesmo que sejam placas de superfície de ultra-baixo de fixação.
   1. Efectuar a totalidade da cultura por pipetagem suave e desprender com uma solução de 4 ° C PBS, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA. Repita até que as placas são claras dos restantes células aderentes - confirmar sob um microscópio se não tiver certeza.
2. Alternativamente, descartar macrófagos aderentes por meio da colheita com o sobrenadante as células em suspensão, que contêm predominantemente monócitos.
   1. Colheita das células não aderentes com uma solução de PBS livre de EDTA e 0,5% de BSA. Não aplique muita força, a fim de evitar a retirada macrófagos levemente aderentes.

1,5 FACS-análise (Opcional)

Nota: É possível a esgotar a suspensão de células de CD117 ⁺ e células progenitoras de haste pelo uso de MACS. Use protocolos fabricante para este procedimento.

1. Colher as células de acordo com os passos ou 1.4.1 ou 1.4.2.
2. Centrifuga-se as células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C e repetir este passo novamente.
3. Ressuspender pelo menos 250.000 células em 300 ul de FACS buffer por sonda.
4. Transferir a solução para uma célula de 96 poços de placa (30 uL por poço).
5. Centrifuga-se a suspensão de células a 250 xg durante 5 min a 4 ° C.
6. Remover o sobrenadante e adicionar 25 uL de anticorpo a cada poço (diluição utilizar fabricante).
7. Corar as células com anticorpos (seguintes protocolos do fabricante para fenotipagem de células após os passos 1.5.1-1.5.6. Marcadores vulgarmente utilizados para a identificação de monócitos / macrófagos incluem CD11b, F4 / 80 (Figura 3), CD115 (Figura 2), e GR- 1.
   Nota: Para uma descrição mais detalhada de soluções de celulares, é recomendado o uso de marcadores como CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G e CD192. Características celulares foram previamente descritos ^12.
8. Incubar as sondas de 20 min a 4 ° C.
9. Centrifugar as sondas a 250 xg durante 5 min a 4 ° C e ressuspender com 200 ul de tampão de FACS. Repita thé entrar duas vezes.
10. Transfira as sondas em tubos de FACS e realizar a análise FACS ^12.
11. Realizar a análise de FACS ¹² no dia 0, 3 e 5 para analisar a diferenciação celular.

2. Cauda Vein Injection

2.1 Preparação

1. Aquecer os animais sobre uma placa de aquecimento a 37 ° C durante cerca de 10 min. Observar os animais durante o aquecimento para reconhecer sinais de superaquecimento.
2. Ressuspender as monócitos isolados em etapas 1.1- 1.4, em 150 ul de NaCl, e carregar as células para uma seringa de insulina de 1 ml com uma agulha de 30G. Vortex levemente a solução antes de carregar a seringa para garantir que todos os monócitos são injectados. Sempre lidar com as células em gelo para evitar penhora mediada pelo calor e ativação de monócitos.

2.2 Prender

1. Evitar perturbar outros ratos na gaiola na escolha de um rato por injecção intravenosa.
2. Posicione o mouse para o limitador. Evite muito prEssure e ter cuidado com os membros posteriores. (Figura 4)
   Nota: Como alternativa, usar anestesia geral para garantir estresse livre movimentação dos animais.
3. Certifique-se de que o rato tem espaço para respirar antes de fechar o limitador.

2.3 Injeção

1. Desinfetar o local da injecção com agente de desinfecção. Pulverizar na cauda do rato e deixar em repouso durante pelo menos 1 min.
2. Interrompa o fluxo de sangue venoso da cauda, ​​aplicando uma leve pressão para o lado lateral da cauda acima do local da injeção, para uma melhor visibilidade das veias.
3. Vire a cauda 90 graus, antes da injeção. (Figura 5)
4. Injetar em um ângulo de 45 graus. Injetar lentamente e não mais de 5 mL por grama para evitar animais prejudicando.
5. Se houver uma bolha, que é um sinal de uma injecção falhou, interromper imediatamente e repetir a injecção mais proximalmente.
6. Parar o sangramento no lado da injeção através da aplicação suave pressure por cerca de 1 min.
7. No final do procedimento, o afastador de abrir e colocar o rato na sua gaiola.
8. Observar o rato durante 20 minutos para assegurar que o animal não foi prejudicada por injecção e decúbito esternal é mantida. Aumentar o tempo de observação até que o mouse recupera a consciência suficiente. Retorne o mouse para a companhia de outros animais somente depois que ele se recuperou totalmente.

Resultados

A solução de células extraídas da medula óssea de murídeo consiste em vários tipos de células. Os principais tipos de células são linfócitos, granulócitos e monócitos. Os tipos de célula pode ser estimado pelo tamanho e granularidade, que é mostrado na Figura 1, tanto para as suspensões nativas e as células colhidas depois de 5 dias de diferenciação. Observe a composição celular mudando durante o cultivo. No entanto, a classificação exata das populações deve contar com expressão distintiva de marcadores...

Discussão

Nós descrevemos um método simples e de baixo custo para isolar grandes quantidades de monócitos murino de medula óssea. Em comparação com outros protocolos utilizando sangue periférico, que obtêm rendimentos de monócitos ⁵ de 1,4 x10 ^6, somos capazes de obter rendimentos mais elevados, de 11 x 10 ⁶ ± 3 x 10 ⁶ monócitos a partir de um único rato doador.

Ao considerar os desafios com este método, é importante mencionar o potencial de contaminação qua...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de 6 poços de ultra-baixa fixação	Corning Incorporated, NY, EUA		Placa de 6 poços de ultra-baixa-fixação, com tampa, estéril
8- 12 semanas de idade, macho, camundongos balb/c	Charles River, Sulzfeld, Alemanha
Placa de 96 poços	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Alemanha
Mancha de células mortas azuis	Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha
Albumina de soro bovino	GE Healthcare, Freiburg, Alemanha		Fração V, pH 7,0
Cânulas	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemanha		28G, 30G
CD115	eBioscience, San Diego, EUA	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, EUA	53-0112
Placa de cultura de células	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha		Com tampa, centrífuga estéril
Beckman	Coulter GmbH, Krefeld, Alemanha		Allegra® Centrífuga X-15R
Creme depilatório	Veet, Mannheim, Alemanha
Agente de desinfecção	Schü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Alemanha		Kodan Tinktur forte
Bisturi descartável No.10	Navalha de segurança de penas Co.Ltd, Osaka, Japão
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha
Etanol 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Alemanha
Unidade de extração Pipetus	Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Alemanha
F4/80	AbD Serotec, Dü sseldorf, Alemanha	MCA497APC
Buffer FACS	Fabricado pelo nosso grupo com componentes		PBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3
FACS dispositivo	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, EUA		BD FACS Canto II
Tubos FACS	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Pipeta Falcon® Becton	Dickenson Labware, NY, USA
Soro fetal para bezerros	Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha
Pinça fina	Rubis, Stabio, Suíça
Luvas	Rö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Alemanha
Gr1	eBioscience, San Diego, EUA	53-5931
Placa de aquecimento	Labotect GmbH, Gö ttingen, Alemanha		Placa Quente 062
Incubadora	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Alemanha		Incu safe
Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Alemanha
Microscópio óptico	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Alemanha		Axiovert 40 ° C
Fator Estimulador de Colônias de Macrófagos	Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha	SRP3110
Agitador mecânico	IKA, Staufen, Alemanha		ms2 minishaker
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Áustria		Warm in 37 ° C banho-maria antes
do uso Micro tubos de ensaio	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha
Bancada de trabalho microbiológica	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Alemanha		Hera safe
Tampão de lavagem de monócitos	Fabricado pelo nosso grupo com componentes		PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer	Vários
NaCl	Berlin Chemie AG, Berlim, Alemanha
NaN3 (ácido de sódio)	Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha
Câmara de contagem Neubauer	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, Alemanha
Células de nylon	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Nova Jersey, EUA		Filtro de células, 70 µ m tamanho da malha
Penicilina/Estreptomicina	Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha
Fosfato tamponado salina	Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha		pH 7.4, pipetas estéreis
	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha		10µ l/100µ l/200µ l/1.000µ l
Pipetas sorológicas	Greiner
Unidade de sucção	Integra bioscience, Fernwald, Alemanha		Conforto Vacusafe
Tesoura cirúrgica	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, EUA
	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemanha		Seringa de insulina Omnifix® -F de 1 ml
Tubos com tampa	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Alemanha		Tubos Cellstar de 15 ml/50 ml Banho-maria
morno	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Alemanha		Julabo SW22