Metoder for biopsi av vastus lateralis, utarbeidelse av renset mitokondrier, og respirometrisk profilering er beskrevet. Bruken av små muskelvolum gjør denne teknikken egnet for klinisk forskning.
Respirometrisk profilering av isolerte mitokondrier er vanlig å undersøke elektrontransportkjeden funksjon. Vi beskriver en fremgangsmåte for å oppnå prøver av humane vastus lateralis, isolere mitokondrier fra minimale mengder av skjelettmuskelvevet, og plate basert respirometrisk profilering ved hjelp av et ekstracellulært fluks (XF) analysator. Sammenligning av respirometrisk profiler oppnådd ved anvendelse av 1,0, 2,5 og 5,0 ug av mitokondrier indikerer at 1,0 ug er tilstrekkelig å måle respirasjon og at 5,0 ug gir mest konsistente resultater basert på sammenligning av standardfeil. Western blot-analyse av isolerte mitokondrier for mitokondriell markør COX IV og ikke-mitokondriell vev markør GAPDH indikerer at det er begrenset ikke-mitokondriell kontaminering ved bruk av denne protokollen. Muligheten til å studere mitokondrie respirometri i så lite som 20 mg av muskelvev lar brukerne benytte individuelle biopsier for flere studieendepunkter i kliniskforskningsprosjekter.
Mitokondriene er de primære energiproduksjonsstedene i cellen, og har en viktig rolle i aldrings samt ulike aldersrelaterte forstyrrelser slik som kardiovaskulær sykdom, Alzheimers sykdom, diabetes, kreft og fedme. Respirometrisk profilering av isolerte mitokondrier gir direkte analyse av elektrontransportkjeden (ETC) funksjon og har bidratt betydelig til vår forståelse av mitokondriell biologi og dens rolle i helse og sykdom. Isolerte mitokondrier brukes til å studere ulike aspekter av bioenergi som, underlaget transport, ATP syntase aktivitet, proton lekkasje, etc. Metodikken er beskrevet i dette manuskriptet har blitt optimalisert for å tillate respirometrisk analyse av mitokondrier isolert fra skjelettmuskel vevsbiopsier hentet fra mennesker. Biopsi protokoll beskrevet i dette manuskriptet har blitt utnyttet av våre ansatte for de siste 12 årene. Vår gruppe har utført over 700 prosedyrer på voksne i ulike aldre,opp til 90 år gammel, og med ulike kroniske sykdomstilstander, uten noen uønskede sikkerhetsspørsmål. En sentral del av denne protokollen er at den er spesielt utviklet for å utnytte minimale mengder vev, og dermed tilrettelegge for sin bruk i kliniske studier.
Ulike protokoller har blitt utviklet for å isolere mitokondrier. Fernandez-Vizarra et al. 1,2 er beskrevet en fremgangsmåte for isolering av mitokondrier fra forskjellige rottevev samt dyrkede celler. Garcia-Cazarin et al. 3 har rapportert en metode for å isolere mitokondrier fra skjelettmuskulatur fra rotte og mus. En fremgangsmåte for isolering av mitokondrier fra rottehjerne er også blitt rapportert av Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross, et al., 5 rapportert en fremgangsmåte for å isolere mitokondrier hjelp av barocycler og / eller PCT ruller. Nylig, Claus et al. 6 rapporterte en metode for isolering av høyanriket mitokondrier ved hjelp av anti-TOM22 Magnetiske kuler.
Mens disse protokollene gi utmerkede resultater, krav vev størrelse er høy sammenlignet med den metode som er beskrevet i dette manuskriptet. For eksempel, Gross et al. 5 anvendes 1,5 til 1,8 g av gastrocnemius muskelen, og omtrent 2 g av nyrevevet. Tilsvarende Franco et al. 6 anvendt 500 mg muse levervev. Fra vår erfaring, typiske avkastning som kan forventes av perkutan nålebiopsi av skjelettmuskulaturen (vastus lateralis) varierer 100-200 mg. Evne til å vurdere mitokondriefunksjonen i 20-50 mg av muskelvev ved hjelp av protokollen beskrevet her tillater brukere å utføre flere vurderinger per biopsi og til å lagre prøvene for fremtidig bruk i andre molekylærbiologiske eksperimenter. Dette er en kritisk funksjon i klinisk forskning og andre studier som krever flittig bruk av prøver. Det skal bemerkes at tidligere frosne mitokondrier er ikke bra for å studere koplet åndedrett på grunn av ytre ringr mitokondrie membran skade og tap av Cytokrom C aktivitet. Vår metode er tilpasset og modifisert fra metoden utgitt av Chappell og Perry 7.
Ved hjelp av fremgangsmåtene beskrevet i dette manuskriptet, har vi nylig rapportert at respirometrisk profilen til mitokondriene isolert fra human vastus lateralis er direkte korrelert med fysiske egenskaper, målt som gangart hastighet 8.
Isolerte mitokondrier er ofte benyttet i studier som undersøker rollen til ETC funksjon, så vel som andre mitokondrielle aktivitet, blant annet substrat transport og TCA-syklus funksjon. Respirometrisk analyser ved hjelp av isolerte organ tillate direkte undersøkelse av grunnleggende prosesser i oksidativ fosforylering og iboende egenskapene til ETC. Respirometrisk profilering av isolerte mitokondrier i forhold til hele celler eller permeabiliserte muskelfibre har fordeler av relativt enkel data tolkning og fravær av "forstyrrelser" fra ikke-mitokondrie prosesser eller endringer i mitokondriell masse / biogenese. Normalisering av data er basert på mitokondrie proteininnhold, og dermed lar grei cross-sammenligning av mitokondrier mellom prøver. Respirometrisk profilering av isolerte mitokondrier er en foretrukket tilnærming når målet med studien er å bestemme underliggende mekanismer og identifisere spesifikke mål som ETC komponents / komplekser, eller mitokondrielle transportmekanismer.
Beskrevet er en protokoll for muskelbiopsi og isolering av funksjonell mitokondrier fra små vevsprøver. Denne metode gir reproduserbare resultater mellom brukere på grunn av utnyttelse av en automatisert homogenisator versus hånddrevne Dounce homogenisatorer. Isolering av mitokondriene kan utføres med så lite som 20 mg av muskelvev. Mengden av isolerte mitokondrier som kan hentes fra denne utvalgsstørrelsen er tilstrekkelig til å kjøre Seahorse plate-baserte respirometri samtidig la overskudd mitokondrier for andre eksperimenter og lagring for ytterligere molekylære analyser. Det kan bemerkes at denne metoden kan oversettes til XF 96, hvor enda mindre mengder av mitokondriene kan brukes (1-2 ug per brønn).
Flere protokoller for å isolere mitokondrier stole på Dounce homogenizers for første vev avbrudd. En ulempe med denne metoden er at praktisk natur av den opprinnelige vevhomogenisering. Den kraft og hastighet av stampe i homogenisatoren kan variere betydelig mellom operatører 6. Dette kan resultere i eksperiment til eksperiment variasjon, samt lab-på-lab variasjon, og fører til vanskeligheter ved sammenligning av data mellom eksperimentene. Dette er av spesiell bekymring i humane intervensjonsstudier når data fra deltakerne blir samlet ved forskjellige tidspunkter, vanligvis før og etter behandling, og eventuelt på flere steder. Vi bruker en automatisert homogenisator for en mer konsistent metode som gir mer reproduserbare resultater med begrenset person-til-person-variant. Hastigheten til preparatet gjør også denne metode er egnet for håndtering av flere prøver på samme tid. Vanligvis kan opp til tre eksperimenter utføres på en enkelt dag.
Potensielle begrensninger av den teknikk som er beskrevet her oppstår fra bruken av isolerte organeller og bruken av en plate basert format. For eksempel, Picard et al. har demonstrated at isolerte mitokondrier har funksjonelle egenskaper som skiller seg fundamentalt fra de av intakte mitokondrier i permeabiliserte myofibers. De foreslo at mitokondrie isolasjonsteknikker føre til endrede bioenergetisk funksjon, for eksempel betydelig økt RCR forhold til permeabiliserte myofibers ledsaget av større reaktive oksygenarter produksjon 13. Sammenlignet med permeabiliserte muskelfibre, isolering av mitokondrier krever lengre forberedelsestid. Også tap av celleinnholdet avtar fysiologiske relevans, noe som er fastholdt i hele celler og selv permeabiliserte fibre. Bruken av plate-baserte respirometri med de beskrevne teknikken tillater replikere kjører per prøve. Imidlertid må mitokondrier holder seg til bunnen av hver brønn. Denne konfigurasjonen er forskjellige fra deres normale miljø og kan påvirke funksjonelle egenskaper. I tillegg bør det bemerkes at bruk av denne protokollen for mitokondrie isolasjon, there kan fortsatt være forurensning fra endoplasmatisk retikulum (ER) i mitokondrie preparatet. Forskjeller i ER forurensning kan påvirke fastsettelsen av mitokondrie avkastning og påvirke resultatene.
Som konklusjon, viser denne studien data som bekrefter at mitokondriene isolert fra vevene ved hjelp av denne fremgangsmåten, er funksjonelt aktiv og kan anvendes for undersøkelser / applikasjoner som krever høy kvalitet isolerte mitokondrier fra minimal mengde av skjelettmuskelprøver. Fordelen med denne metoden er at: i) det er mulig å isolere mitokondrier fra minimale mengder av skjelettmuskulatur, ii) fremgangsmåten er rask, iii) med plate-basert teknologi, er det mulig å kjøre flere prøver på samme tid, og iv) det er nok overskudd vev og isolerte mitokondrier etter bioenergetisk assay for prøveoppbevaring og andre molekylærbiologiske undersøkelser.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.
Equipment | ||
Name of the Equipment | Company | |
Homogenizer Bio-Gen PRO200 | BioExpress | |
Eppendorf Centrifuge 5804 R | Fisher Scientific | |
Deepwell late Rotor | Fisher Scientific | |
6mm University College Hospital Needle | Cadence | |
60cc syringe | Fisher Scientific | |
96-well plate reader | Tecan (Genios-basic) | |
Seahorse XF 24-3 analyzer | Seahorse Biosciences, Inc. | |
Protein gel system | Life Technologies (Invitrogen) | |
Kodak Gel Logic 112 | Carestream Health, Inc | |
Kodak camera assembly | Carestream Health, Inc | |
Consumables | ||
Name | Company | Catalog Number |
XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 100850-001 |
100867-100 | ||
Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich Co | 221473 |
Hydrochloric acid (HCl) | Acros | 12421-0010 |
Dulbecco's Phosphate buffered saline | Lonza | 17-512F |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P333 |
MOPS | Fisher Scientific | BP308 |
EDTA | Fisher Scientific | BP118 |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich Co | M7506 |
ATP | Sigma-Aldrich Co | A9187 |
Fatty acid-free BSA | Calbiochem | 126575 |
Sucrose | Sigma-Aldrich Co | S0389 |
Bacterial proteinase | Sigma-Aldrich Co | P-8038 |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich Co | M9546 |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich Co | M9272 |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3784 |
EGTA | Sigma-Aldrich Co | E3889 |
BCA protein assay kit | Sigma-Aldrich Co | PI23227 |
Succinic Acid* | Sigma-Aldrich Co | S3674 |
Pyruvic acid* | Sigma-Aldrich Co | P5280 |
Malic acid* | Sigma-Aldrich Co | 2288 |
ADP(K+ salt)* | Sigma-Aldrich Co | A5285 |
XF Cell mito stress test kit | Seahorse Biosciences | 101706 |
Tween-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-29113 |
NuPAGE 12% Bis-Tris Gel | Life Technologies (Invitrogen) | NP0343BOX |
Immobilin Transfer Membranes (0.45um) | Millipore | IPVH20200 |
MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml | Life Technologies (Invitrogen) | NP0001 |
NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter | Life Technologies (Invitrogen) | NP0006-1 |
Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin) | Abcam | ab14734 |
Primary antibodies (mAB to GAPDH) | Abcam | ab9484 |
Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF822E001EA |
Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF812E001EA |
*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only |