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Artigo de método

Cultures Organotípicas fatia de Estudos de Pós-natal Neurogênese

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DOI:

10.3791/52353

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4 de março de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Institute of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, National Yang-Ming University, 3Department of Education and Research, Taipei City Hospital

Neste artigo

Resumo

Aqui nós descrevemos uma técnica para estudar a neurogênese pós-natal do hipocampo utilizando a técnica de cultura fatia organotípica. Este método permite a manipulação in vitro da neurogénese adulto e permite a aplicação directa de agentes farmacológicos para o hipocampo cultivadas.

Resumo

Aqui nós descrevemos uma técnica para estudar a neurogênese pós-natal do hipocampo no cérebro de roedores utilizando a técnica de cultura fatia organotípica. Este método mantém a morfologia topográfica característica do hipocampo, enquanto que permite a aplicação directa de agentes farmacológicos para o desenvolvimento do giro dentado do hipocampo. Adicionalmente, culturas de fatias pode ser mantido durante até 4 semanas, e assim, permitir uma para estudar o processo de maturação de neurónios granulares-nascidos. Culturas de fatias para permitir a manipulação farmacológica eficaz de fatias de hipocampo, enquanto excluindo variáveis ​​complexas, tais como as incertezas relativas à localização anatómica profunda do hipocampo, bem como a barreira de sangue do cérebro. Por estas razões, buscou-se otimizar culturas fatia organotypic especificamente para pesquisa neurogênese pós-natal.

Introdução

A neurogênese adulta no hipocampo de mamíferos representa um exemplo notável da capacidade inata do cérebro de adaptabilidade e plasticidade. As células granulares dentadas (DGCs) são geradas a partir de um pool renovável de células progenitoras neurais no giro dentado do hipocampo, que é uma das duas regiões neurogênicas atualmente bem caracterizadas no cérebro dos mamíferos e é considerada particularmente importante para o aprendizado e a memória. O hipocampo faz parte do sistema límbico e tem uma localização profunda dentro do cérebro dos mamíferos, o que o torna um alvo difícil para manipulação farmacológica precisa. Além disso, a neurogênese aberrante tem sido implicada em condições como epilepsia, esquizofrenia e doença de Alzheimer, o que despertou interesse em entender a influência de vários agentes farmacológicos durante a maturação e sobrevivência dos neurônios recém-nascidos. A distinção entre neurogênese pós-natal e adulta é tênue e estudos anteriores mostraram que muitas características do desenvolvimento neuronal in vivo no início do período pós-natal e na idade adulta são semelhantes25. Aqui enfatizamos a neurogênese pós-natal e sugerimos possíveis aplicações para a neurogênese adulta.

As culturas de fatias organotípicas fornecem um método in vitro eficiente para estudar várias propriedades fisiológicas do hipocampo de mamíferos. O valor das culturas de fatias preparadas a partir de cérebros de roedores pode ser resumido em três qualidades principais: 1) o protocolo é direto e requer materiais prontamente disponíveis; 2) as culturas de slice permitem estudos farmacológicos que eliminam variáveis complexas, como a localização anatômica profunda do hipocampo e contornam a barreira hematoencefálica1; e 3) a estrutura bem caracterizada do hipocampo e do circuito tri-sináptico é preservada2. Pesquisadores anteriores usaram a cultura organotípica do hipocampo para estudar o desenvolvimento sináptico e a fisiologia3,4, gliogênese5-7, dano cerebral isquêmico8,9, neuroproteção e neurorreparo10-12, bem como epilepsia13-15. As culturas de fatias também podem fornecer um sistema modelo útil que permite o monitoramento do desenvolvimento celular em conjunto com a marcação de células com proteína fluorescente verde (GFP) ou outros marcadores vitais.

Culturas de fatias também foram empregadas anteriormente para estudar a neurogênesepós-natal do hipocampo 16-19, mas um fator importante na maioria desses estudos é a degeneração bem caracterizada que resulta do explante de tecido de animais adultos após aproximadamente 2 semanas in vitro20,21. Por esse motivo, as culturas de fatias são normalmente preparadas a partir de camundongos ou filhotes de ratos pós-natais precoces (P5-P10), que utilizam a viabilidade aprimorada do tecido cerebral pós-natal precoce para cultura22. Embora estudos anteriores tenham mostrado que o hipocampo pós-natal precoce e adulto diferem em relação à fisiologia sináptica e à expressão de subtipos neuronais específicos23,24, há uma conservação substancial do programa de desenvolvimento coreografado pelo qual as células granulares dentadas recém-nascidas realizam durante a maturação25. Além disso, estudos recentes sugeriram que as características fisiológicas dos DGCs recém-nascidos em cultura são muito semelhantes aos neurônios imaturos na preparação do corte agudo do hipocampo16.

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Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos com animais conformados com as orientações de saúde e bem-estar animal do Departamento de Medicina Comparativa da Universidade de Toronto.

1. Preparação de fatias do hipocampo

  1. Esterilizar os seguintes instrumentos usando o autoclave seco a 125 ° C: cabo de bisturi (# 3) (2), fórceps padrão standard, grande (1), Small dissector tesoura (dobrado para o outro) (1), Micro colher (colher e plana extremidades espátula) (1), Micro-espátulas (arredondados e extremidades arredondadas cônicos) (2), pincel fino (1), Fogo polido Pasteur pipeta (2), praças de gaze, 2 x 2 polegadas (5).
  2. Quando estéril, colocar os instrumentos em um recipiente estéril e manter coberto até o uso. Imediatamente antes da dissecação, mergulhe os instrumentos em uma solução de etanol a 70%.
  3. Prepara-se uma placa de cultura de 6 poços com inserção de cultura antes de iniciar o procedimento de dissecção por adição de 1 ml de meio de cultura / poço e armazenando a placa na incubadora a 35 ° C, umand 5% de CO 2.

2. Organizar instrumentos de dissecação em estéril de fluxo laminar

  1. Pulveriza-se a câmara de fluxo laminar com etanol a 70% e remover instrumentos esterilizados dissecção a partir de álcool. Permitir que os instrumentos para secar enquanto descansa em uma placa de Petri esterilizada para evitar o contato entre o álcool e o tecido do cérebro dissecado.
  2. Depósito 5-7 ml de solução de dissecação gelada esterilizados em 2 grandes placas de Petri estéreis. Um prato vai relaxar e limpar a cabeça (sujo), o outro para o resfriamento e enxaguar a esvaziado cérebro (limpo). Coloque um papel de filtro esterilizado numa das tampas de placas de Petri para dissecar o cérebro.
  3. Colocar uma pequena quantidade de papel de filtro, esterilizado em uma pequena tampa da caixa de Petri para dissecar o hipocampo. Depósito 3-5 ml de solução esterilizada dissecação gelada em 2 pequenos, placas de Petri estéreis. Um prato vai realizar o hipocampo escavado para fora, ninguém vai segurar seções durante a separação das secções do hipocampodissecção sob microscópio.
  4. Prepare o cortador de tecidos gravando um pedaço de papel de filtro esterilizado para a fase de corte e a montagem de uma lâmina de barbear estéril. Molhar o papel de filtro com solução de dissecação esterilizado.
  5. Spray de um bio-saco limpo com álcool e coloque-o em fluxo laminar bancada limpa.

3. Hippocampal Dissection

  1. Pulverizar o filhote de rato P7 Sprague Dawley com etanol 70% fora do fluxo laminar bancada limpa e rapidamente decapitar o animal usando grandes tesouras cirúrgicas estéreis dentro do banco de fluxo laminar. Deixe a cabeça cair na solução de dissecação gelada em uma das placas de Petri.
  2. Na placa de Petri, enxaguar o sangue e rapidamente transferir a cabeça para papel de filtro esterilizado, lado ventral para baixo.
  3. Usando o bisturi, cortar ao longo da superfície dorsal no plano sagital para expor o crânio subjacente. Cortar através da pele, mas não o osso subjacente, que é macio e facilmente penetrável em ratos de tsua idade. Separe este bisturi "sujo" e não usar em tecido cerebral.
  4. Usando as pequenas tesouras de dissecção (anguladas para o outro) e uma pinça, cortado o crânio ao longo da sutura sagital do crânio para bregma, o ponto na anatomia do crânio onde a sutura coronal é entrecortada perpendicularmente pela sutura sagital. Use uma pinça para puxar abas crânio para cima e longe da linha média do crânio.
  5. Coloque a colher micro no lado inferior do cérebro, por baixo do tronco cerebral, para levantar suavemente para fora do cérebro do crânio. Levante o cérebro para expor os nervos ópticos e bulbo olfatório na superfície basal do cérebro. Corte essas estruturas com uma tesoura pequena para separar totalmente o cérebro de crânio. Remover e transferir o cérebro intacto para o outro prato de Petri contendo solução grande dissecação gelada.
  6. Usando o micro colher, transferir o cérebro a uma tampa pequena placa de Petri contendo papel de filtro estéril. Com uma pipeta de Pasteur estéril, lavar o cérebro com algumas gotas de dissecting solução para manter o tecido úmido.
  7. Usando uma lâmina de bisturi "clean" cortar os dois hemisférios separados. Transfira o hemisfério esquerdo volta a grande placa de Petri com micro colher e coloque o lado pia hemisfério baixo na solução de dissecação gelada para posterior utilização.
  8. Ver a face medial do hemisfério direito e identificar o fornix borda, uma banda de destaque da matéria branca ao longo da borda medial do hipocampo. Usando um bisturi estéril, faça um corte sagital através do fundo de saco, mas tome cuidado, pois apenas 0,5 cm da ponta do bisturi vai ser suficiente para cortar o fundo de saco.
  9. Usando 2 micro-espátulas, remova o primeiro hipocampo do hemisfério direito, colocando a mão-espátula direita no tronco cerebral e levantando o córtex sobreposta com a espátula esquerdo. Suavemente levantar o córtex para revelar o ventrículo lateral e medial da superfície do hipocampo. A linha curva branca, a fímbria, agora deve estar visível.
  10. Alinhe a curvatura da espátula com a curvatura da fímbria e pressione suavemente a espátula sob a fímbria. Deslize a espátula esquerda e passeio ao longo do eixo rostral-caudal e levante espátula na direção dorsal para remover hipocampo.
  11. Transferir o hipocampo de uma 2ª pequena placa de Petri com solução de dissecção gelado. Repita o mesmo procedimento no hemisfério esquerdo para remover o hipocampo esquerdo.
  12. Usando uma espátula micro, transferir cuidadosamente o hipocampo para o palco cortador de tecidos. Dispor-los adjacentes e paralelos um ao outro e perpendiculares ao eixo da lâmina de helicóptero. Utilização de um pincel para posicionar o tecido e adição de algumas gotas de solução de dissecção no topo do hipocampos.
  13. Corte o tecido em 400 mm fatias sem parar para remover fatias individuais (geralmente eles não vão aderir à lâmina). Depois de todo o hipocampo foi cortado, use o pincel para transferir delicadamente as seções para a 2ª pequena placa de Petri com solução de dissecção.
  14. De acordo com anúncioissecting microscópio, separe cuidadosamente as fatias flutuante usando amicro-espátula e pincel.
  15. Remova a placa de cultura de pré-preparados com inserção de cultura do incubador e lugar numa câmara de fluxo laminar.
  16. Usando uma pipeta de Pasteur polida ao fogo, desenhar 4-5 fatias para a pipeta de transferência e fatias à superfície apical de membrana inserção de cultura. Em seguida, ajuste o posicionamento com um pincel e deixe espaço entre as seções individuais e da fronteira da inserção da cultura.
  17. Usando uma pipeta de Pasteur estéril, remover o excesso de solução de dissecação da superfície apical de membrana.
    NOTA: Ao remover solução evitar desenhar cortes de tecido para a pipeta. Como alternativa, use uma pipeta regular (P200 ou P1000) com pontas de pipetas esterilizadas para remover lentamente solução.
  18. Colocar a placa de cultura com meio de cultura contendo soro e as fatias de hipocampo de volta na incubadora a 35 ° C e 5% de CO 2.
    NOTA: Se as chamadas experiênciapara a geração de culturas de vários animais, limpar completamente o fluxo laminar banco limpo entre dissecções. Retorno instrumentos para solução de álcool e substituir todas as placas de Petri, papéis de filtro e lâminas de barbear estéril, antes da segunda dissecção.

4. alimentação e manutenção de Organotípicas Slices

  1. Culturas para alimentação animal em um fluxo laminar estéril bancada limpa.
  2. Realize a primeira alimentação das seções de cultura dois dias pós-dissecção. Aspirar meio de cultura de idade que usa a pipeta de vidro esterilizado.
  3. Use estéreis 5 ml pipeta serológica para adicionar 1 ml de, meio contendo soro fresco, estéril aos poços.
  4. Gentilmente substituir a inserção da cultura e tomar cuidado para remover as bolhas de ar que podem ter se formado debaixo da superfície da membrana.
  5. Após a primeira alimentação, mudar meio todos os outros dias.

5. Incubar fatias de tecido com timidina Analogues para Label Newborn Neurônios

  1. A fim de estudara maturação e integração de células granulares do denteado do hipocampo, incubar as fatias organotípicas com um análogo da timidina, tal como bromodesoxiuridina (BrdU) ou Chlorodeoxyuridine (CldU). Aqui, nós utilizamos CldU devido à sua maior solubilidade em solução salina.
  2. Após 3DIV, adicionar 1 ml de / ml de solução concentrada CldU 10 mg em solução salina a 1 ml de meio de cultura para uma concentração final de 10 ug / ml. Se BrdU é usado, corrigir a concentração para as diferenças de peso molecular. Adicionar meio com CldU para poços de cultura e incuba-se o tecido com CldU contendo meio durante 2 horas a 35 ° C.
  3. Após 2 h de incubação a 35 ° C, remover o meio contendo CldU e substitua com meio de alimentação regular para retomar a programação de alimentação normal (descrito acima).

6. Os tecidos Fixation e Armazenamento

  1. Estabeleça um cronograma para a aplicação de tratamentos e fixação de amostras de tecido antes de iniciar experimentos de cultura (Figura 2B).
  2. A um dia predeterminado pós-dissecação, preparar o seguinte numa hotte de laboratório: uma proveta de 10-50 ml contendo 4% de paraformaldeído (PFA) em tampão fosfato salino (PBS); um copo vazio para o meio de cultura descartados; pequeno fórceps; e uma pipeta de 1000 ml com pontas descartáveis.
  3. Remova a placa de cultura (s) a partir de câmara de incubação e transferência para uma coifa. Inclinação das inserções individuais de placas bem com fórceps. Em seguida, utilizar uma pipeta para remover o meio de cultura e transferência para uma proveta de eliminação. Inclinar a placa de cultura a um ângulo para ajudar a garantir que todo o meio de cultura é removido.
  4. Concluir a remoção por meio de uma placa de cultura de cada vez. Ao meio foi removido, adicionar 1 ml de PFA 4% para cada poço de cultura e sele bem placa com parafilm. Repita o procedimento para o maior número de placas de cultura como placas necessárias e transferir para geladeira a 4 ° C, durante 24 horas.
  5. Após 24 horas, prepare o seguinte em um exaustor: 10-50 taça ml contendo 0,1% de azida de sódio em PBS; um vazioTaça por PFA descartado (siga as precauções de segurança ao descartar substâncias tóxicas); pequeno fórceps; e 1.000 ml pipeta com pontas descartáveis.
  6. Siga o procedimento descrito no ponto 6.4 para a adição de PFA, mas adicionar 1 ml de PBS com azida de sódio em vez disso. Uma vez terminada a transmissão, placas de poços de vedação para uso futuro por envolvimento bordas em parafilm e armazenar na geladeira a 4 ° C.

7. O corte do tecido por imuno-histoquímica

  1. Realizar tecido corte usando um vibratome. A seguinte série de passos ajudar a maximizar o rendimento de secções de tecido utilizáveis ​​a partir de culturas organotípicas.
    NOTA: Imediatamente após dissecação do hipocampo e plaqueamento das fatias, o tecido tem uma espessura de aproximadamente 400 um. No entanto, depois de 2-3 semanas na câmara de incubação, fatias de tecido começará a achatar, resultando numa espessura de secção final de 150-300 | im.
  2. Prepare os seguintes itens para a seção de tecido cultivado: a # 11 bisturi blade e manusear, um prato de vidro Petri contendo PBS gelado, um micro-dissecação fórceps, e uma fase de corte vibratome limpa para montar tecido.
  3. Usar um bisturi para cuidadosamente cortada ao longo do perímetro da membrana inserção circular de modo que ele pode ser separado da carcaça inserção de plástico. Deixar um amplo espaço entre a fatia culta e o bisturi.
  4. Transferir a membrana inserção individual para uma placa de Petri contendo PBS. Após lavagem em PBS, utilize uma pinça para transferir a membrana para a fase de montagem vibratome.
  5. Em seguida, usar o bisturi para eliminar o excesso de membrana que envolve fatias cultivadas e cortar o excesso de material para criar bordas limpas. Este passo irá garantir a membrana é plana e pode aderir facilmente à superfície de corte.
  6. Colocar 1-2 gotas de adesivo sobre a fase de corte vibratome e espalhar em camada uniforme utilizando uma agulha 22 G. Espalhe adesiva em uma forma retangular com a borda longa paralela à lâmina de corte do vibratome. Execute esta etaparapidamente, para evitar que o adesivo de secagem.
  7. Use uma pinça para transferir a membrana aparadas contendo fatias do hipocampo para o estágio de corte e gentilmente posicionar a membrana na cola e garantir que não haja bolhas de ar.
  8. Como o superglue seca, transferir o palco vibratome com a membrana colada de volta para a PBS contendo placa de Petri. Prepare a lâmina vibratome e uma azida de sódio contendo 48 poços para armazenar seções do tecido.
  9. Use vibratome para gerar 30 mm secções do tecido fatia organotípicas e transferência para uma placa de 48 poços contendo azida de sódio para armazenamento e subsequente coloração imuno-histoquímica.
  10. Consulte os protocolos de imuno-histoquímica 26,29 coloração pré-existentes.

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Resultados

Determinar se as culturas organotypic seria adequado para a investigação a neurogênese adulta necessário que preencham dois critérios principais: 1) que fatias manter características morfológicas características de fatias do hipocampo após 10-21 dias in vitro (DIV), e 2) que PED-nascidos pode ser quantificada utilizando técnicas de imuno-histoquímica padrão comumente empregados na pesquisa neurogênese adulta. Relativamente ao primeiro critério, a Figura 1A e 1B destacar a morfo...

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Discussão

Seguindo CldU (ou BrdU) a administração, o calendário de aplicação de agentes farmacológicos podem ser escolhidas como alvo para PED-nascidos durante janelas específicas do desenvolvimento. Por exemplo, um agente hipotético pode ser aplicada durante a segunda semana pós-injecção CldU, o que é proposto para coincidir com a idade de neurónios imaturos que se encontram numa fase de desenvolvimento em que o GABA é despolarizantes. Estudos futuros utilizando este protocolo poderá adaptar o agente farmacológico e a janela de ...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa MOP 119271 ao JMW pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde. Os autores gostariam de agradecer à Sra. Yao Fang Tan por sua excelente assistência técnica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
5-cloro-2'-desoxiuridina (CldU)MP Biomedicals105478Perigoso, Carcinogênico
Inserções de cultura de células, 30 mm de diâmetro, 0,4 µ m tamanho do poroThermo scientific 140660O revestimento Nuclon delta nessas inserções proporciona melhor adesão do tecido e melhora a qualidade do corte.
Tubos de centrífuga cônicos (estéreis)Fisher Scientific14-432-22
(inclinada para o lado)Ferramentas de Ciência Fina 14082-09
Meio essencial mínimo (MEM)Gibco11095; líquidoArmazenar a 4 ° C
Eclipse Ni-U microscópio fluorescenteNikon
Cola para tecidoKrazy GlueKG585Use uma quantidade mínima de cola para obter aderência, pois qualquer tecido exposto à cola será inutilizável para IHC.
Hank' s Solução salina balanceada (HBSS) (500 ml)Gibco14025-092Armazene a 4 ° C
Soro de Cavalo Inativado por Calor (500 ml)Gibco16050-122Faça alíquotas de 50 ml e armazene a -20 ° C
KimwipesKimberly-ClarkeTW 31KYPBX
Pipetas de vidro modificadas (fundo da pipeta Pasteur removido e borda alisada com chama de Bunsen)
Placa de Petri (100 mm x 15 mm) e (60 mm x 15 mm)Fisher BrandFB0875712 e FB0875713A
# 11Fine Science Tools10011-00
Cabo de bisturi # 3Fino Ferramentas científicas10003-12
Pipetas sorológicasSorfa Medical Plastic Co.P8050
Padrão Padrão fórcepsFine Science Tools11000-12
Filtro de vácuo estérilThermo-Scientific565-0020
Tesoura CirúrgicaFine Science Tools14054-13
Unidade de filtro acionada por seringaMillipore-MillexSLGP033RS
Tissue chopper com estágio móvelStoelting& nbsp;51425
Pincel
Tesoura de dissecção Lâminas de bisturi de ponta fina

Referências

  1. Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
  2. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  3. Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  4. Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
  5. Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
  6. Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
  7. Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
  8. Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
  9. Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
  10. Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
  11. Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  12. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  13. Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
  14. Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271(2012).
  15. Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
  16. Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
  17. Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
  18. Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Molecular And Cellular Neurosciences. 26 (2), 241-250 (2004).
  19. Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
  20. Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
  21. Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
  22. Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
  23. Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
  24. Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
  25. Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409(2006).
  26. McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
  27. Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
  28. Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
  29. Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
  30. Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
  31. Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
  32. Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
  33. Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
  34. Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
  35. Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
  36. Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
  37. Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).

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