Aqui nós descrevemos uma técnica para estudar a neurogênese pós-natal do hipocampo utilizando a técnica de cultura fatia organotípica. Este método permite a manipulação in vitro da neurogénese adulto e permite a aplicação directa de agentes farmacológicos para o hipocampo cultivadas.
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Artigo de método
Cultures Organotípicas fatia de Estudos de Pós-natal Neurogênese
Neste artigo
Resumo
Resumo
Aqui nós descrevemos uma técnica para estudar a neurogênese pós-natal do hipocampo no cérebro de roedores utilizando a técnica de cultura fatia organotípica. Este método mantém a morfologia topográfica característica do hipocampo, enquanto que permite a aplicação directa de agentes farmacológicos para o desenvolvimento do giro dentado do hipocampo. Adicionalmente, culturas de fatias pode ser mantido durante até 4 semanas, e assim, permitir uma para estudar o processo de maturação de neurónios granulares-nascidos. Culturas de fatias para permitir a manipulação farmacológica eficaz de fatias de hipocampo, enquanto excluindo variáveis complexas, tais como as incertezas relativas à localização anatómica profunda do hipocampo, bem como a barreira de sangue do cérebro. Por estas razões, buscou-se otimizar culturas fatia organotypic especificamente para pesquisa neurogênese pós-natal.
Introdução
A neurogênese adulta no hipocampo de mamíferos representa um exemplo notável da capacidade inata do cérebro de adaptabilidade e plasticidade. As células granulares dentadas (DGCs) são geradas a partir de um pool renovável de células progenitoras neurais no giro dentado do hipocampo, que é uma das duas regiões neurogênicas atualmente bem caracterizadas no cérebro dos mamíferos e é considerada particularmente importante para o aprendizado e a memória. O hipocampo faz parte do sistema límbico e tem uma localização profunda dentro do cérebro dos mamíferos, o que o torna um alvo difícil para manipulação farmacológica precisa. Além disso, a neurogênese aberrante tem sido im....
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Protocolo
NOTA: Todos os procedimentos com animais conformados com as orientações de saúde e bem-estar animal do Departamento de Medicina Comparativa da Universidade de Toronto.
1. Preparação de fatias do hipocampo
- Esterilizar os seguintes instrumentos usando o autoclave seco a 125 ° C: cabo de bisturi (# 3) (2), fórceps padrão standard, grande (1), Small dissector tesoura (dobrado para o outro) (1), Micro colher (colher e plana extremidades espátula) (1), Micro-espátulas (arredondados e extremidades arredondadas cônicos) (2), pincel fino (1), Fogo polido Pasteur pipeta (2), praças de gaze, 2 x 2 polegadas (5).
- Quando estéril, ....
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Resultados
Determinar se as culturas organotypic seria adequado para a investigação a neurogênese adulta necessário que preencham dois critérios principais: 1) que fatias manter características morfológicas características de fatias do hipocampo após 10-21 dias in vitro (DIV), e 2) que PED-nascidos pode ser quantificada utilizando técnicas de imuno-histoquímica padrão comumente empregados na pesquisa neurogênese adulta. Relativamente ao primeiro critério, a Figura 1A e 1B destacar a morfo.......
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Discussão
Seguindo CldU (ou BrdU) a administração, o calendário de aplicação de agentes farmacológicos podem ser escolhidas como alvo para PED-nascidos durante janelas específicas do desenvolvimento. Por exemplo, um agente hipotético pode ser aplicada durante a segunda semana pós-injecção CldU, o que é proposto para coincidir com a idade de neurónios imaturos que se encontram numa fase de desenvolvimento em que o GABA é despolarizantes. Estudos futuros utilizando este protocolo poderá adaptar o agente farmacológico e a janela de .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa MOP 119271 ao JMW pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde. Os autores gostariam de agradecer à Sra. Yao Fang Tan por sua excelente assistência técnica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 5-cloro-2'-desoxiuridina (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Perigoso, Carcinogênico |
| Inserções de cultura de células, 30 mm de diâmetro, 0,4 µ m tamanho do poro | Thermo scientific | 140660 | O revestimento Nuclon delta nessas inserções proporciona melhor adesão do tecido e melhora a qualidade do corte. |
| Tubos de centrífuga cônicos (estéreis) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| (inclinada para o lado) | Ferramentas de Ciência Fina | 14082-09 | |
| Meio essencial mínimo (MEM) | Gibco | 11095; líquido | Armazenar a 4 ° C |
| Eclipse Ni-U microscópio fluorescente | Nikon | ||
| Cola para tecido | Krazy Glue | KG585 | Use uma quantidade mínima de cola para obter aderência, pois qualquer tecido exposto à cola será inutilizável para IHC. |
| Hank' s Solução salina balanceada (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Armazene a 4 ° C |
| Soro de Cavalo Inativado por Calor (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Faça alíquotas de 50 ml e armazene a -20 ° C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Pipetas de vidro modificadas (fundo da pipeta Pasteur removido e borda alisada com chama de Bunsen) | |||
| Placa de Petri (100 mm x 15 mm) e (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 e FB0875713A | |
| # 11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Cabo de bisturi # 3 | Fino Ferramentas científicas | 10003-12 | |
| Pipetas sorológicas | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Padrão Padrão fórceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Filtro de vácuo estéril | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Tesoura Cirúrgica | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Unidade de filtro acionada por seringa | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper com estágio móvel | Stoelting& nbsp; | 51425 | |
| Pincel |
Referências
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D.
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Reimpressões e permissões
