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Artigo de método

Técnica Cirúrgica para a Implantação de engenharia de tecidos enxertos vasculares e Subsequente

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DOI:

10.3791/52354

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3 de abril de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology & Bio-Physics, State University of New York Buffalo School of Medicine, 2Department of Pediatrics, State University of New York Buffalo School of Medicine, 3Department of Chemical and Biological Engineering, State University of New York Buffalo School of Engineering

Neste artigo

Resumo

Um protocolo de passo-a-passo para a colocação inter-posicional de engenharia de tecidos Vessels (TEVs) na artéria carótida de um carneiro usando anastomose end-to-end e avaliação digital em tempo real, in vivo até o sacrifício animal.

Resumo

O desenvolvimento da engenharia de tecidos de vasos (TEVs) é avançada pela capacidade de TEVs habitual e efectivamente implante (4-5 mm de diâmetro) em um modelo animal de grande porte. Um protocolo de passo a passo para colocação inter-posicional da avaliação digital de TEV e em tempo real de TEV e artérias carótidas nativas é descrito aqui. In vivo, a monitorização é tornada possível pela implantação de sondas de fluxo, cateteres de ultra-sons e cristais (capaz de gravar mudanças dinâmicas diâmetro de TEVs implantados e artérias carótidas nativas) no momento da cirurgia. Uma vez implantado, os pesquisadores podem calcular padrões de fluxo sanguíneo arterial, pressão arterial invasiva e diâmetro da artéria rendendo parâmetros como a velocidade da onda de pulso, índice de aumento, pressão de pulso e conformidade. A aquisição de dados é conseguida utilizando um único programa de computador para análise ao longo da duração da experiência. Tais dados inestimável fornece insights sobre TEV remodelação da matriz, a sua resemblanCE para controles nativos / farsa e desempenho geral TEV in vivo.

Introdução

O foco principal para o desenvolvimento de TEVs tem sido fornecer um substituto para a substituição de enxerto autólogo quando os vasos autólogos não estão disponíveis e limitar doador vista morbidade. Por exemplo, o número de cirurgias de revascularização do miocárdio por ano ultrapassou 350 mil nos EUA, e a fonte ideal de enxertos adequados continua a ser a artéria mamária interna esquerda, descendente anterior da artéria coronária e uma veia safena. Uma vez que muitos indivíduos que sofrem de doenças vasculares pode não ter artérias e veias adequadas para a substituição de enxerto autólogo, o desenvolvimento de TEVs tornou-se assim um campo de intensa pesquisa por décadas 1-6. Enquanto a engenharia e otimização de novos TEVs passaram por muitos avanços, informando sobre as técnicas cirúrgicas utilizadas para implantar os TEVs si não tem sido um tema de tal discussão intensa. Em vez disso, os protocolos relativos à implantação de TEVs em modelos animais são em grande parte à esquerdaaté investigadores pesquisar.

O seguinte demonstra como manuscrito para implantar TEVs utilizando uma abordagem anastomose extremidade-a-extremidade. Este processo foi optimizado usando um padrão específico de sutura da anastomose, estabilizando técnica de sutura, optimizando a tensão longitudinal e a adição de instrumentação de monitorização in vivo. Este método é contrastado com algumas das muitas variações que têm sido utilizadas anteriormente. Além disso, este procedimento descreve como adquirir parâmetros tais como pressão arterial, TEV diâmetro / compliance e taxa de fluxo através do TEV após cirurgia até explante. Esta recolha de dados proporciona uma análise indispensável do TEV enquanto ele está no processo de remodelação.

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Protocolo

NOTA: Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo.

Preparação 1. Pré-cirúrgica

  1. Use ovelhas (Dorset cruz, fêmea, cerca de 1-3 anos de idade com um peso de 40-60 kg) para o seguinte estudo. Administrar ciclosporina A (200 mg / dia), aspirina (975 mg / dia), e coumadina (20-30 mg / dia) por via oral, começando 3 dias antes da cirurgia e continuar para a duração de todos os estudos.
  2. Garantir a ovelha jejuou 12 horas antes da cirurgia (alimentação normal = 1,8 kg de feno e 0,4 kg de grãos).
  3. Esterilizar todos os materiais cirúrgicos usando um autoclave a vapor a 121 ° C e 15 psi durante 30 min.
  4. Coloque os seguintes itens em uma hr paraformaldeído secador 48 antes da cirurgia: 4 mm sondas de fluxo Doppler, um milímetro cristais ultra-sônicos, cateteres arteriais residente, extensão de tubos e 42 "Tygon Tubing.
    NOTA: A tabela de equipamentos médicos relevantes necessárias àcirurgia e para a esterilização está listado na Tabela 1. Pré-colocação de instrumentação dentro da tubagem em Tygon neste passo vai ajudar a poupar tempo durante a cirurgia.
    1. Escreva em cada extremidade das sondas, cateteres e cristais como esquerda e direita, se for o caso.

2. Operação Cirúrgica

  1. Ovelhas para induzir anestesia com diazepam (0,5 mg / kg) e cetamina (4 mg / kg) por via intravenosa (IV). Alternativamente, usar Telazol (4 mg / kg) IV.
    1. Realizar intubação orotraqueal com um diâmetro 8,5-10,0 mm interno algemado tubo endotraqueal 7.
    2. Administrar anestesia por inalação através de um circuito de reciclagem do ar com um ventilador de volume corrente (7-10 ml / kg) ou um ventilador de pressão regulada (15-20 cm de H 2 O). Use um vaporizador de precisão para administrar isoflurano ou sevoflurano em uma quantidade adequada (3% -4% inicialmente) para chegar a uma média a profunda fase anestésico cirúrgico. A concentração mínima para alveolarovinos é de 1,4% ou 1,9%, respectivamente 8.
    3. Avaliar a profundidade da anestesia por meio da observação da resposta motora aos estímulos, reflexo palpebral, a posição dos olhos, e freqüência cardíaca. Monitor de saturação de oxigênio no sangue (95% -100%) pela oximetria de pulso, concentração de CO 2 (45-55 mmHg) em gases expiratórios usando capnografia e manter a temperatura corporal durante o procedimento (38,5-39,5 ° C), utilizando um auto regulado manta térmica.
  2. Raspar lã de todo o pescoço do ovino, e sobre uma veia cefálica, utilizando uma lâmina de # 40 na tosquiar padrão. Prepare a pele de ambos os sites para cirurgia, utilizando 70% de álcool isopropílico e 7,5% betadine matagal gaze saturada. Comece com álcool gaze para facilitar a remoção da oleosidade da pele. Alternar entre gaze betadine e álcool gaze três vezes.
  3. Coloque ovelha para a mesa de operação em decúbito dorsal no topo de um cobertor de aquecimento. Passe uma sonda orogástrica de tamanho médio para permitir a expulsão passiva do conteúdo do estômago. Estender apescoço e de ovelha usar amortecimento de apoio conforme necessário para manter a colocação.
    1. Realize uma esfoliação asséptica final usando 7,5% betadine gaze embebida e deixe descansar por 5 minutos antes da cirurgia.
  4. Administrar fluidos IV (solução de lactato de Ringer ou soro fisiológico 0,9%) a 10 ml / kg / h através de um angiocath colocado na veia cefálica. Administrar antibióticos intra-operatórios e analgesia: penicilina G procaína 6.600 U / kg por via intramuscular (IM), gentamicina 1,6 mg / kg IM, e buprenorfina 0,005-,01 mg IV ou IM.
  5. Faça uma incisão ~ 12 cm do comprimento sobre o pescoço ventral com bisturi electro. Isolar as artérias carótidas direita e esquerda (~ 6 cm) por remoção do tecido conjuntivo, utilizando uma técnica de dissecção romba. Empate fora e cauterizar micro-vasos de ramificação das artérias carótidas para minimizar o sangramento.
  6. Manter a esterilidade, utilizando (a não-estéril) enfermeira cirúrgica para ajudar na construção de galerias toda a fiação e tubulação (sonda de fluxo, fios de cristal ultra-sônicose tubo do cateter) na camada subcutânea da pele. Use a trocar embotada, que sai através da incisão preparado cirurgicamente no pescoço dorsolateral.
    1. Alcançar sob o campo estéril e virar a cabeça da ovelha de modo a que a parte lateral do pescoço pode ser visualizada sob a cortina.
    2. Utilize uma pinça hemostática curva 8 cm a túnel através do espaço subcutâneo entre a incisão na linha média ventral do pescoço e a parte lateral do pescoço. Abra e feche a pinça hemostática para dissecar sem rodeios um espaço para a tubulação de cerca de 1,5 cm de largura. As dicas da pinça hemostática deve residir no meio do caminho entre a cabeça e os ombros, aproximadamente 10 cm caudal para o ouvido direito ou esquerdo. Vire a pinça hemostática para que as pontas estão apontando na direção da pele superficial.
    3. Alcance sob a cortina estéril e fazer um 1,5 centímetros incisão através da pele, sobre as pontas da pinça hemostática com um estéril # 11 da lâmina. Visualize as pontas da pinça hemostática para confirmar a saída clara através da pele.
    4. Passe o tubo Tygon contendo umfiação ll e tubos através do túnel subcutâneo. Mantenha os fios e tubos acima do campo estéril.
    5. Alcance sob a cortina para remover o tubo exterior Tygon do pescoço, expondo a fiação da implantado, uma vez que deixa o pescoço do ovino. Puxe linhas individuais de forma a minimizar qualquer folga no espaço subcutâneo. Deixe uma distância suficiente para unir corretamente a instrumentação para a artéria.
  7. Coloque 4 milímetros sondas de fluxo Doppler em ambas as artérias carótidas e atingir uma leitura inicial (Figura 1). Administrar 100 U / kg de heparina IV 30 min antes do pinçamento da artéria.
  8. Continue a administração de heparina a 100 U / kg / h até ao final da cirurgia. Prenda a artéria carótida usando non-esmagamento pinças vasculares e extirpar uma porção (cerca de 4 cm de comprimento). A taxa de fluxo da carótida contralateral aumente em 50% -100%, para manter o fluxo sanguíneo para o cérebro.
    Nota: É possível limitar trecho longitudinal pelo recuo do vaso nativo, removendosegmentos mais curtos do que está sendo substituído e / ou alongamento da artéria nativa com vascular grampos para encurtar lacuna até anastomotic procedimento completo é concluído. Isso vai ajudar a limitar a tensão na sutura exploração individual, tendo o enxerto implantado.
  9. Suturar a TEV no local usando pontos isolados simples com 7-0 prolina ethalloy dupla sutura de monofilamento armado. Se necessário, aplicar relaxantes musculares lisas vasculares, tais como a papaverina (15 mg / ml) ou nicardipina (1,25 mg / ml) por via tópica à vasculatura nativa, a fim de impedir a vasoconstrição, que iria dificultar a sutura da anastomose.
    NOTA: Comece colocando suturas com espaçamento de cerca de 1 mm. Isso pode variar muito de caso para caso. A composição e espessura TEV irá afectar a distância efectiva entre as suturas. À medida que a espessura do tecido nativo ou TEV diminui, pode ser necessário para colocar as suturas mais juntos.
    1. Primeiro âncora de quatro pontos de TEV à artéria nativa, colocando dois s opostastitches em ambas extremidades proximal e distal (Figura 2 -di). Segure cada âncora ensinou usando hemostats.
      NOTA: descrições proximal e distal são em referência a direção do fluxo de sangue por todo o papel.
    2. Adicionar mais 5-6 suturas sobre o lado superficial de ambas as extremidades proximal e distal para iniciar a anastomose. (Figura 2-Pr). Simultaneamente rodar o vascular grampos 180 graus.
    3. Restabelece-se a tensão sobre as suturas de ancoragem. Adicionar adicional (5 a 6) para suturas interrompidas extremidades proximal e distal do lado girado de TEV.
  10. Uma vez que o TEV está devidamente suturado no lugar, gire-a de volta para a posição original e retire a vascular grampos um de cada vez, braçadeira distal primeiro. Ligeiro sangramento nos locais de anastomose é comum. Isso pode resolver naturalmente após vários minutos de liberação grampo e reclamping ou exigir a colocação de pontos adicionais. Coloque a sonda de fluxo Doppler (Figura 3-Fl) De volta em proximal da artéria nativa ao fluxo de sangue que entra no TEV e vazão monitor.
    NOTA: O prazo as taxas de fluxo da carótida esquerda e direita para equilibrar após aproximadamente 15 min. Se a taxa de fluxo na artéria carótida com TEV firmemente implantada gotas, é possível que a TEV é coagulação. Outras alterações possíveis em relação ao fluxo pode ser atribuído à constrição da artéria nativo proximal ou distal ao TEV. Se isto ocorrer, o uso de relaxante do músculo liso vascular adicional pode ser aplicada, e o vaso nativo deve retornar a um tónus basal após 30-60 min após o encerramento do tecido sobre o sítio do enxerto.
    1. Se desejar, extirpar a artéria carótida contralateral e sutura-lo de volta no lugar, como um controle "Sham". Isto é mais clinicamente relevante do que deixar a artéria carótida direita e sozinho só prender a sonda de fluxo, os cristais ultra-sons, e o cateter. Se um controle sham é querido, faça isso antes de prosseguir para a etapa 2.11.
  11. Suturar um milímetro cristais ultra-sônicas (Figura 3 CR1 CR2) para lados opostos do TEV usando 7-0 prolina. Fio de sutura através da cabeça de cristal ultra-som e pontos apenas na camada superficial da TEV.
  12. Cateterize artéria utilizando uma versão modificada 18 G cateter com uma abertura Teflon tecido (Figura 3- Ca & Figura 4A). Coloque a distal do cateter para o TEV em tecido arterial nativo.
    1. Sutura do bolso para a parede arterial com 5/0 Ethibond para controlar qualquer hemorragia. Use ciclohexanona a aderir o tubo de orifício micrométrico para o cateter que foi lavada com solução salina. Use a tubulação, como uma linha de extensão.
    2. Usar um adaptador Luer 20 L curtas com um plug Injection Surflo para vedar a extremidade do tubo exteriorizado (Figura 4B). Para manter a permeabilidade do cateter, se obter o volume de escorvamento da linha e lavá-la com 10 ml de solução salina e, em seguida, 5.000 U / ml de heparina de sódio injecção a cada 2-3 dias.
  13. Grave a distância entre a sonda de fluxo ultra-sons e os cristais, bem como a distância entre a sonda de fluxo e o cateter. Esta velocidade de onda de pulso permitirá a ser calculado em conjunto com o software. Se tais cálculos não são necessários, não implante de um cateter.
  14. Obter uma leitura intra-operatória, se desejar para garantir todo o hardware implantado é funcional (ver secção 3).
  15. Fixe linhas implantadas e fios para musculatura próxima usando 2/0 de seda e uma agulha cônica (Figura 3).
    1. Posicione o fluxo vascular sonda fio paralelo ao navio, com o caudal da sonda e o fio que se estende no sentido cranial, e, em seguida, fazendo um "U-Turn" em direção a musculatura lateral. Fixar o cabo de musculatura adjacente, utilizando seda 2-0 em uma agulha conicidade em dois locais, de modo que o fio ou sonda de fluxo não é capaz de colocar qualquer pressão sobre o recipiente. Certifique-se suturas são confortável, mas não aperte demasiado e estrangular musculatura (Figura 3).
    2. Sutura da linha de fios de cristal e cateter arterial para a musculatura lateral, permitindo a ~ 1,5 centímetros de folga, semelhantes aos passos anteriores para fixar sonda de fluxo (Figura 3).
    3. Grupo todos os fios e linhas juntas e ancorá-las a musculatura pouco antes de sair para fora através de túnel subcutâneo, similar às etapas anteriores.
  16. Feche o local da cirurgia com um 2-0 Vicryl sutura em camadas usando um padrão de sutura em execução no tablier e subdérmico, correndo colchão pontos na pele (tablier, agulha não cortante; pele, agulha cortante). Feche a 1,5 centímetros incisão no pescoço dorsal ao redor dos fios e linhas exteriorizados usando 2/0 Vicryl e uma agulha de corte.
  17. Coloque fios da sonda de fluxo, linhas e fios, cateteres de ultra-sons de cristal em uma bolsa (10 cm x 10 cm) que está firmemente suturadas na pele das ovelhas (Figura 5 - depois de recuperação).
  18. Gradualmente desmamar as ovelhas off anestesiaeo ventilador volume corrente, em seguida, extubação as ovelhas quando a respiração espontânea é retomada. Remover o angiocath inserido na veia cefálica e curativo, se necessário.
  19. Enfaixar o pescoço usando pomada antibiótica tripla sobre as incisões, uma almofada de Telfa, gaze rolo estiramento, e elasticon.
  20. Administrar analgesia pós-operatória: meglumina flunixin 2,2 mg / kg IM uma vez durante a recuperação, em seguida, 1,1 mg / kg IM, uma vez por dia durante dois dias, a buprenorfina 0,005-,01 mg IV ou IM, duas vezes por dia, durante um dia.

3. Monitorização In Vivo

  1. Coloque ovelhas no carrinho móvel para assegurar a contenção adequada. Isso permite que as ovelhas para manter a calma e consciente, sem comprometer o hardware. Pode ser necessário aclimatar ovelhas ao carrinho 2 ou 3 vezes por 30 minutos antes de obter gravações de instrumentação.
  2. Remova todos os fios e linhas de bolsa e conectar-se aos dispositivos de monitoramento. Conecte-sonda de fluxo a um medidor de vazão, cristais um milímetro de ultra-som ligado a TRB-USB Caixa, e do cateter linhas para transdutores de pressão. Um fluxograma desta instalação é fornecida (Figura 6).
  3. Calibrar sondas de fluxo e transdutores de pressão antes de aquisição de dados.
    NOTA: Devido à variabilidade de potencial entre as versões de software e as diferenças de equipamento utilizado, calibrações e ajustes irão variar de caso para caso.
  4. Utilize um osciloscópio para afinar a medição de cristal Sonometrics, de acordo com o protocolo do fabricante.
  5. Gravar dados usando o software de computador (Figura 7). Traços na metade superior da Figura 7 em cor branca corresponde ao TEV implantado, enquanto os traços na metade inferior da cor vermelha corresponde ao engodo / nativo. Para tanto a TEV e Sham o caudal (ml / min), a pressão sanguínea arterial (mm Hg) e do diâmetro (mm) são registadas ao vivo.
  6. Record para, pelo menos, 1 min sem perturbações. Exportar esses dados para uma análise mais detalhada. Depois da gravação, DISCONNect todos os fios e lugar de volta para bolsa suturado no pescoço das ovelhas.

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Resultados

Mais de 30 ovelhas foram submetidas a técnica cirúrgica descrita neste relatório para a implantação de TEVs (no prelo) 9. Uma tabela que resume as operações mais recentes ovelhas após a otimização de protocolo são apresentados na Tabela 2. Todos os animais recuperaram após a implantação TEV sem complicações fatais. Em alguns animais, fibrose foi observada em artéria nativa perto da ponta do cateter arterial. Não foi observado um aumento significativo de inflamação com a presença de instrument...

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Discussão

O objetivo deste relatório é fornecer um procedimento confiável e reprodutível para TEVs implante de interesse na artéria carótida ovinos. As artérias carótidas nativas dos animais utilizados neste modelo foram 0,5-0,75 mm de espessura e 4,5-5 mm de diâmetro externo. A técnica cirúrgica descrita aqui tem sido bem sucedida para a implantação TEVs de diferentes geometrias de medição 0,25-1 mm de espessura, de 4-5 mm de diâmetro externo e 4 cm de comprimento, com grande sucesso provando eficaz até duração de 3 meses, o pon...

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Divulgações

Não há divulgações a serem relatadas.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional do Coração e Pulmão (R01 HL086582) e do Fundo de Ciência Stem Cell New York (NYSTEM, Contrato #   C024316) para STA e DDS ilustrações utilizadas vídeo JoVE foram preenchidos por John Nyquist; Illustrator Medicina da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Transdutor de PressãoBecton DickinsonP23XL-1Quantidade: 1+ (1 para cada artéria).
Usado com cúpulas de diafragma cheias de água.
Caixa de amplificador e transdutorGould5900 Signal Conditioner CageQuantidade: 1.
Dois transdutores e amplificadores devem ser incluídos no cage. Embora esta unidade específica possa ser descontinuada, outros transdutores de pressão disponíveis comercialmente com uma saída BNC/analógica se comunicarão com o equipamento Sonometrics.
Console T403 com módulo de medidor de vazão perivascular TS420 (x2)Sistemas TransônicosMódulo T403 e TS420 (x2)Quantidade: 1.
As sondas de fluxo que medem o fluxo através de cada uma das artérias carótidas se conectarão a cada uma das unidades TS420.
Unidade de medição ultrassônica digitalSonometricsTR-USBQuantidade: 1
Sonda de Fluxo Precision S-Series 4  mmSistemas Transônicos Inc.MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GAQuantidade: 2
1  mm Sonometrics CrystalsSonometrics Systems1R-38S-20-NC-SHQuantidade: 2-4 (2 para cada artéria)
Cateter para implantaçãoBD (Becton Dickinson)  381447Quantidade: 1+ (1 para cada artéria).
O cateter é cortado e fixado ao tubo microbore, o stylette é utilizado para inserção.
Tubulação Microbore TygonNorton Performance Plastics(AAQ04127) Formulação S-54-HLCorte no comprimento para um conjunto de extensão
Adaptador Luer StubBD (Becton Dickinson)427564 (20 gauge)Quantidade: 1+ (1 para cada cateter arterial)
Plugue de Injeção SurfloTerumoSR-IP2Quantidade: 1+ (1 para cada cateter arterial)
MeadoxPTFE (Teflon) Felt19306Corte no tamanho.
O feltro de PTFE utilizado em nossos estudos foi descontinuado. No entanto, empresas comparáveis como " Malha cirúrgica" oferecer produtos equivalentes.

Referências

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