Correlacionando DNA Alterações metilação específico do gene com expressão e transcrição Atividade de astrocítica KCNJ10 (Kir4.1)

Summary

A metilação do DNA é capaz de manter níveis estáveis de expressão gênica, além de permitir mudanças dinâmicas na expressão gênica em resposta a uma variedade de estímulos. Detalhamos técnicas que permitem o estudo de alterações específicas de genes na metilação do DNA e o efeito dessas mudanças na expressão gênica.

Abstract

A metilação do DNA serve para regular a expressão gênica através da ligação covalente de um grupo metil na posição C5 de uma citosina em um dinucleotídeo citosina-guanina. Embora a metilação do DNA forneça mudanças duradouras e estáveis na expressão gênica, os padrões e níveis de metilação do DNA também estão sujeitos a alterações com base em uma variedade de sinais e estímulos. Como tal, a metilação do DNA funciona como um regulador poderoso e dinâmico da expressão gênica. O estudo da neuroepigenética revelou uma variedade de estados fisiológicos e patológicos associados a mudanças globais e específicas de genes na metilação do DNA. Especificamente, existem correlações marcantes entre mudanças na expressão gênica e metilação do DNA em distúrbios neuropsiquiátricos e neurodegenerativos, durante a plasticidade sináptica e após lesão do SNC. No entanto, como o campo da neuroepigenética continua a expandir sua compreensão do papel da metilação do DNA na fisiologia do SNC, delinear relações causais em relação às mudanças na expressão gênica e metilação do DNA é essencial. Além disso, em relação ao campo mais amplo da neurociência, a presença de vastas diferenças específicas de regiões e células requer técnicas que abordem essas variações ao estudar o transcriptoma, proteoma e epigenoma. Aqui descrevemos a classificação FACS de astrócitos corticais que permite o exame subsequente de uma transcrição de RNA e metilação do DNA. Além disso, detalhamos uma técnica para examinar a metilação do DNA, análise de fusão de alta resolução sensível à metilação (MS-HRMA), bem como um ensaio de promotor de luciferase. Através do uso dessas técnicas combinadas, pode-se não apenas explorar mudanças correlativas entre a metilação do DNA e a expressão gênica, mas também avaliar diretamente se as mudanças no estado de metilação do DNA de uma determinada região do gene são suficientes para afetar a atividade transcricional.

Introduction

Epigenética é o estudo de modificações químicas que podem afetar a atividade transcricional do genoma. Essencialmente, sem uma alteração na sequência de DNA, modificações epigenéticas como metilação do DNA, acetilação de histonas e metilação de histonas são suficientes para alterar reversivelmente os padrões de expressão gênica ¹. A metilação do DNA, um potente regulador da expressão gênica, é a modificação epigenética mais bem caracterizada. A metilação do DNA é a ligação covalente de grupos metil na posição C5 de uma citosina, normalmente a citosina de um dinucleotídeo citosina-guanina, também conhecido como sítio CpG. As áreas que contêm uma alta densidade de locais CpG são conhecidas como ilhas CpG (CGIs). Os CGIs são frequentemente associados a locais de início de transcrição (TSS) e promotores de genes ^1-3. Assim, embora as mudanças na metilação do DNA em CGIs nem sempre sejam concomitantes com mudanças na expressão ou função celular, as mudanças na metilação do DNA em CGIs podem exercer uma regulação poderosa na atividade transcricional ².

Historicamente, observou-se que a metilação do DNA é essencial na embriogênese, imprinting e desenvolvimento, com poucas alterações nos níveis de metilação do DNA ocorrendo em células pós-mitóticas (com exceção de alterações em genes relacionados ao câncer) ^4,5. No entanto, o campo da neuroepigenética destacou um importante papel não desenvolvimental para a metilação do DNA. Especificamente, a epigenética cognitiva redefiniu a metilação do DNA como um mecanismo altamente plástico integral na mediação da ativação transcricional e da repressão de genes essenciais para o processo de aprendizagem e memória ⁶. Além da epigenética cognitiva, estudos que modelam lesão isquêmica e dor neuropática caracterizam a metilação do DNA como um mecanismo lábil que responde rapidamente a uma variedade de insultos do SNC ^7-9. Em relação aos astrócitos, várias linhas de evidência sugerem que a metilação do DNA desempenha um papel importante na astrogliogênese. Fan et al., descobriram que o KO condicional de DNMT1 em células progenitoras neurais (NPCs) resultou no desenvolvimento precoce de astrócitos concordantes com um estado global de hipometilação ¹⁰. Além disso, Perisic et al., concluíram que os níveis diferenciais de metilação do DNA do promotor GLT-1 mediaram os níveis diferenciais de expressão do transportador de glutamato no córtex e no cerebelo, enfatizando um papel na metilação do DNA no estabelecimento de padrões específicos da região cerebral de expressão gênica astrocítica ¹¹. No geral, vários estudos ressaltam a natureza dinâmica e lábil da metilação do DNA no SNC, pois o ambiente, as drogas e as lesões demonstraram alterar a metilação do DNA e, muitas vezes, a expressão gênica ^4,9. Juntos, esses estudos neuroepigenéticos apontam para a metilação do DNA como um alvo terapêutico viável com potencial para mitigar uma variedade de patologias do SNC.

À medida que o campo da epigenética expande sua compreensão do papel da metilação do DNA no neurodesenvolvimento e na doença, o desafio de mover a metilação do DNA em direção a um alvo terapêutico é realizar estudos não apenas correlativos, mas causais que definem alvos e locais genéticos específicos. Além disso, o levantamento de mudanças na metilação do DNA específicas para a região do cérebro e o tipo de célula continua sendo um desafio contínuo e digno de tempo, exclusivo do campo da neuroepigenética. Este protocolo utiliza uma variedade de técnicas, incluindo classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de astrócitos, análise de fusão de alta resolução sensível à metilação (MS-HRM) e um ensaio de metilação luciferase para investigar o estado de metilação do DNA de KCNJ10, um gene que codifica para Kir4.1. Kir4.1 é um canal de potássio específico da glia que demonstra padrões de expressão específicos da região cerebral e da célula no SNC ^12-16. A expressão de Kir4.1 aumenta movendo-se das regiões rostral para caudal do SNC, com a maior expressão ocorrendo na medula espinhal ¹⁵. Embora o canal seja expresso em células ependimárias, oligodendrócitos e suas células precursoras, Kir4.1 é predominantemente expresso em astrócitos e considerado essencial para manter os níveis homeostáticos de potássio, bem como apoiar a captação de glutamato, definindo o potencial de membrana astrocítica em repouso em -80mV ^{hiperpolarizado 12,16-19}. É importante ressaltar que a expressão de Kir4.1 não é estática tanto durante o desenvolvimento quanto após múltiplas formas de lesão do SNC ^20-25. Queríamos examinar a regulação epigenética desse canal, especificamente em astrócitos durante o desenvolvimento. As técnicas utilizadas oferecem análises de locais CpG específicas e direcionadas a genes que fornecem evidências causais de um papel da metilação do DNA na regulação da expressão gênica KCNJ10. Essas técnicas podem ser aplicadas a outros genes.

Protocol

Todos os animais foram tratados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde orientações. O tratamento ea utilização Comitê Animal da Universidade de Alabama em Birmingham aprovou o uso animal.

1. A obtenção de RNA e DNA a partir de uma Enriched astrocítica População usando fluorescente de células activadas (FACS) de astrócitos partir de tecido cerebral Whole

1. Sedar animais com CO ₂ durante 1 min e, em seguida, rapidamente decapitar. Dissecar córtices como descrito em Albuquerque et ai, ^26.; não é necessário para remover das meninges.
   Nota: Ratos transgênicos expressando eGFP sob a S100β (um marcador de astrócitos) promotor foram gerados por Itakura et al ^{27 e} utilizado para triagem de FACS astrócitos..
2. Prepare homogenato de cérebro total utilizando um kit de dissociação de papaína em condições não-estéreis de acordo com o protocolo do fabricante. Calor-activar a papaina, a 37 ° C em banho-maria durante 10 min. Nota:Solução de papaína é fornecido pelo fabricante e contém L-cisteína e EDTA (Ver Tabela de Materiais).
   1. Cortar ou dremel um furo no topo de um tubo de 50 ml para tubos de permitir transportar _95% de O2: 5% de CO _{2 a} ser alimentado a um tubo cónico fechado (Figura 1A). Coloque córtices dissecadas em 10 milímetros placa de cultura contendo meio de dissociação (MEM suplementado com glucose 20 mM e penicilina / estreptomicina (500 U / ml) e equilibrou-se a _95% de O2: 5% de CO ₂₎ e utilizar uma lâmina de barbear limpa para tecido triturado em 1 x 1 mm ^{2 peças.}
3. Tecido de transferência usando 10 ml PIPETMAN manual para tubo de 50 ml contendo solução de papaína. Permitir que o tecido para resolver a parte inferior da pipeta de transferência antes da descarga para minimizar a quantidade de mídia dissociação transitadas. Manter solução de papaína equilibrada a _95% de O2: 5% de CO ₂ por meio de intercâmbio de gás de superfície para a duração da incubação. Não bolha papaína solutiligar. Incubar o tecido durante 20 minutos em 37 ° C num banho de água.
4. A seguir à incubação em solução de papaína, o tecido triturado 10 vezes com uma pipeta de 10 ml de transferência a uma velocidade lenta. Centrifugar a suspensão de células a 1000 x g turva durante 5 min à TA.
   1. Equilibrar soluo do inibidor de ADNase / albumina (fornecido pelo fabricante), através de intercâmbio de gás superficial e re-suspender as células precipitadas em 3 ml de solução / inibidor de albumina de ADNase. Prepare gradiente de densidade descontínua comercial seguindo as instruções do fabricante.
5. Gire gradiente de densidade descontínua em 1000 xg durante 6 min. Isolar as células dissociadas a partir do fundo do tubo por sucção sedimento de fundo, utilizando uma pipeta.
6. Re-suspender as células dissociadas em 2-3 ml de DPBS com 0,02% de albumina de soro bovino e 1 mg / ml de DNase ou tamponadas de HEPES preferidos meios de cultura. Passe por 40 um filtro antes de FACS (Figura 2A). Manter as células no gelo até a classificação.
   1. Execute FACS ^28.
   2. Células sedimento em 1,5 ml de tubos de centrífuga a 2000 xg durante 5 min a 4 ° C.
      Nota: astrócitos sedimentado pode ser utilizada imediatamente ou mantidas em -80 ° C até à extracção do ADN.
7. Extrair RNA e DNA usando o método de isolamento preferido ^{29 30.} Avaliar RNA e DNA e qualidade através de espectrofotómetro e ³¹ Bioanalyzer.
   Nota: Utilize apenas RNA de alta qualidade e DNA em passos subsequentes, 260/280 = 2,0-2,2 e 1,8-1,9, respectivamente. Análise Bioanalyzer é essencial para avaliar a degradação do RNA ou a fragmentação do DNA. ARN ou ADN pode ser utilizado imediatamente ou armazenado em -80 ° C ou -20 ° C, respectivamente, para os estudos subsequentes.

2. Avaliar DNA metilação status de um Gene usando metilação-sensível de alta resolução Melt Análise (MS-HRMA)

1. Digite sequência do gene de interesse em software de mapeamento on-line preferido de metilação para identificar quaisquer ilhas CpG em genede interesse ^32.
   1. Iniciadores design contra bissulfito convertido sequência de ADN ³³ e amplificar utilizando polimerase de ADN preferida de acordo com o protocolo do fabricante. Verificar o tamanho do produto amplificado, executando um gel de agarose a 1% de ADN a 100 V durante 45 min. Loja primers na concentração estoque de 20 mM em -20 ° C.
2. Bissulfito converter 500-1000 ng de ADN de cada amostra e padrões de ADN metilado que variam de 0-100% em relação à mesma espécie animal ^34. Elui-se amostras para proporcionar uma concentração de 20 ng / ul. Verificar a concentração de ADN convertido por meio de bisulfito espectrofotómetro ^31.
3. 20 ul de configuração para reacções de amplificação MS-HRM utilizando polimerase de ADN preferida e iniciadores na concentração de 5 ^ M de acordo com a Tabela 1 e 2. Executar todas as amostras, incluindo os padrões de ADN metiladas e FACS, em triplicado.
4. Dependendo de software de análise, definir pré e pós iniciar e parar parâmetrosem torno das transições da curva de fusão. Set começar a pré-melt e os parâmetros de paragem pré-fusão assim que a diferença entre os dois é 0,2-0,5 ° C. Definir início de pós-fusão e pós-melt parar de forma semelhante. Extrair dados de diferença de temperatura de pico para cada amostra.
5. Utilizar percentagem normas metilados (valor-y) e seus correspondentes diferenças médias de temperatura de pico (valor-x) gerar uma equação de regressão linear (Figura 3A-B, Tabela 3-4). Use esta equação de regressão linear para estimar estado de metilação de amostras desconhecidas ^35.

3. Avaliação Hyper-metilado Promotor Atividade via uso de ensaio de luciferase

1. Identificar ilhas CpG do gene alvo (Passo 2.1). PCR amplificar regiões de interesse ^{36 e} clone a montante do Firefly gene repórter de luciferase luc2 para produzir plasmídeos CpG-island-luc2 ^37.
2. Linearizar 30 ug do plasmídeo CpG-island-luc2 via restriçãodigestão enzimática ^38. Verifique sites para digestão de restrição e evitar cortes de casal usando software cortador de ³⁸ preferida. Calor-inactivar enzimas, à temperatura e duração apropriada, após digestão de acordo com o protocolo do fabricante. Perda mínima de ADN ocorre durante a etapa de linearização.
3. Metilato de plasmídeos linearizados utilizando CpG metilase (M.Sssl) O / N a 30 ° C ou deixam protocolo fabricante seguinte sem tratamento, exceto para os seguintes ajustes.
4. Realizar 50 reações ul.
5. Use 5 unidades de CpG metilase para metilar 700 ng do plasmídeo linearizado.
6. Execute reações O / N para 13-19 h.
7. Após reacção CpG metilase, executar a limpeza do DNA usando o padrão, comercialmente membrana de gel de sílica disponíveis limpar kit de acordo com o protocolo do fabricante. Perdas significativas de DNA ocorrem após reação metilase CpG, perda de 30-60%.
8. Verificar a metilação dos plasmídeos através de uma digestão de restrição Hpall.
9. Tomar 1 ug de ADN metilado ou não metilado e digestão de restrição com Hpa II durante 1 hora a 37 ° C. Use 5-10 unidades de Hpa II para cada ug de ADN. Após a digestão Hpa II, executar a limpeza DNA usando membrana comercialmente disponível sílica-gel limpar kit preferido,. Executar tanto CpG metilados plasmídeos e não metilados no ADN de um gel de agarose a 1% em tampão TAE ou TBE a 100 V durante 45 min para visualização (figura 4B).
10. Plasmídeos Assunto tanto metilados e não metilados a dupla digestão com enzimas de restrição apropriadas para liberar full-length luc 2 (vector) e ilha CpG (insert) fragmenta ^38. Execute dupla digestão O / N à temperatura adequada e enzimas inatividade ao calor após digestão de acordo com o protocolo do fabricante. Perda mínima de concentração de DNA ocorre durante a restrição dupla digestão.
11. Executar plasmídeos duplamente digerido em gel de agarose a 1% de ADN a 100 V durante 1 h para permitir a separação óF vector e inserção (Figura 4C). Cuidado. Vestindo protetor rosto protetor UV, coloque gel DNA em uma luz negra tabletop para visualizar bandas. Com base no tamanho, consumo de inserção metilado e não metilado e não metilado vector utilizando uma lâmina cirúrgica limpo.
12. Extracto de gel de ADN utilizando fenol saturado, pH 6,6. Resumidamente, pesar de gel contendo o vector de ADN ou de inserção. Use 100 ul de fenol por 0,1 grama de gel de ADN. Homogeneizar em gel de ADN de fenol Dounce de vidro usando homogeneizador.
13. Adicionar clorofórmio (utilizando 1/5 do volume de fenol) e agitar amostras por 20 s. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 2-3 minutos. Centrifugar durante 15 minutos à velocidade máxima (16,1 x 1000 x g) a 4 ° C.
14. Remover solução aquosa e adicionar o volume de 0,1X de 3 M de acetato de sódio e o volume de 2,5X de etanol. Incubar as amostras durante 1 hora a -80 ° C. Após a incubação, remover o etanol e re-suspender o ADN em 30 ul de tampão preferido. Perda significativa de DNA ocorre isolamento seguimento de inserções e vetores, 30-50% loss.
15. Re-ligar inserções metilados e não metilados para não metilado vector utilizando DNA ligase T4 ^38. Usar uma proporção de 1: 4 de vector para inserir para reacções de ligação. Reação de configuração de acordo com as instruções do fabricante. Utilizar um volume total de 50 ul por reacções e incubar O / N à temperatura de -20 ° C ou sobre gelo com a tampa sobre o balde de gelo.
16. Após a ligação, executar a limpeza DNA usando membrana comercialmente disponível sílica-gel limpar kit preferido,. Uma perda significativa de ADN ocorrem após reacção de ligação, uma perda de aproximadamente 30-50% do DNA. Verifique re-ligação, executando em 1% de gel de agarose de ADN a 100 V durante 45 min e avaliar a concentração de plasmídeos re-ligado (Figura 4D).
17. Transfectar plasmídeos metilados ou não metilados nas células D54 usando um reagente de transfecção comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Células D54 sementes Onto de 12 poços na placa de 0,14 x 10 ⁶ células / poço.
18. Na sequência de 24 horas, as células transf with concentrações iguais de ambos (1) plasmídeo não methyated CpG-luc2 + Renilla ou outro vector controle luciferase ou (2) metilado plasmídeo CpG-luc2 + Renilla ou outro vector controle luciferase.
19. Permitir que as células transf durante 24 horas antes de realizar ensaio de luciferase duplo. Realizar ensaio de acordo com as instruções do fabricante. Realizar as leituras utilizando um luminómetro. Leia cada poço em triplicado.
20. Calcular a relação da actividade da luciferase do pirilampo ou de Renilla para outra actividade de luciferase de controlo. Normalizar Firefly metilado: atividade luciferase controle para Firefly não metilado: atividade luciferase controle dividindo atividade luciferase metilado pela atividade luciferase não metilado

Results

Uma população enriquecida dos astrócitos foi adquirida via FACS classificação de eGFP-S100β animais transgênicos ^27. Devido à diminuição da qualidade das células e moléculas moleculares isoladas de animais com idade superior a 50 dias pós-parto (p50), animais com idade p0-p40 são ideais para tais experimentos. Tecido cortical foi usada para estas experiências. Córtices de dois a seis animais foram reunidas. FACS foi realizada nas instalações UAB Comprehensive Citometria de Fluxo Core. Triagem foi realizada em...

Discussion

Este protocolo descreve o isolamento de uma população enriquecida de astrócitos via FACS, bem como uma variedade de técnicas que permitem estudos correlativos e causais entre a metilação do DNA e a expressão gênica. Essas técnicas, usadas isoladamente ou em combinação, são particularmente úteis para laboratórios que trabalham com tecidos de alta heterogeneidade celular ou estão interessados no estado de metilação do DNA de um determinado gene ou região do gene versus alterações globais de metilação do DNA. Um desafio rel...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de Dissociação de Papaína	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
AllPrep DNA / RNA Mini Kit	Qiagen	80204
Metil Primer	on-line	Applied Biosystems	para localizar Ilhas CpG
Kit de metilação de DNA EZ	Zymo Research	D5001
Padrão de calibração pré-misturado de rato	EpiGenDx	80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl)	Zymo Research	E2010
QIAquick Gel Extraction	QIagen	28704	Usado para extração de gel e limpeza de DNA
Enzimas de restrição	New England BioLabs
cortador NEB	New England BioLabs	online	verificar sites de resumo de restrição
Sistema de ensaio de repórter de luciferase dupla	Promega	E1910
Luc2 vetor, pGL4.10	Promega	E6651
vetor renilla, pGL4.74	Promega	E2241
TD-20/20 Luminômetro	Turner Designs
Lipofectamine LTX e Plus Reagent	Life Technologies	A12621
Fenol, pH saturado 6.6/6.9	Fisher Scientific	BP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c Spectroftometer	ThermoScientific
MeltDoctor Master Mix	Technologies	4415440
Software de Fusão de Alta Resolução (HRM) v2.0	Life Technologies	4397808
Software AB SDS v2.3	Technologies	online
AB High Resolution Melting Guia de Introdução	Life Technologies	online
AB 7900HT Sistema rápido em tempo real	Life Technologies