Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

Rena Brauer; Peter Chen

doi:10.3791/52421

Artigo de método

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

DOI:

10.3791/52421

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19 de março de 2015

Rena Brauer¹ , Peter Chen¹

¹Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Ovos férteis de galinha são amplamente utilizados para produzir grandes quantidades de vírus da gripe humana A, pois fornecem um sistema conveniente e econômico para provar altos rendimentos de vírus.

Resumo

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A infecção por influenza está associada com cerca de 36.000 mortes e mais de 200 mil internações por ano nos Estados Unidos. O surgimento contínuo de novas estirpes do vírus da influenza, devido a mutação e de re-sortido complica o controlo do vírus e necessita o desenvolvimento permanente de novas drogas e vacinas. O estudo baseado em laboratório da gripe requer um método confiável e de custo eficaz para a propagação do vírus. Aqui, um protocolo global prestada para influenza A propagação do vírus em ovos de galinhas férteis, que consistentemente produz stocks virais título elevado. Em breve, isentos de agentes patogénicos (SPF) de ovos de galinha fertilizados de soro são incubadas a 37 ° C e 55-60% de humidade durante 10-11 dias. Durante este período, o desenvolvimento do embrião pode ser facilmente monitorizado utilizando um candler ovo. A inoculação do virus é realizada por injecção de estoque de vírus na cavidade alantóide usando uma agulha. Após 2 dias de incubação a 37 ° C, os ovos sãorefrigeradas durante pelo menos 4 horas a 4 ° C. A casca de ovo de cima do saco de ar e a membrana corioalantóica são então cuidadosamente aberto e o fluido alantóide que contém o vírus é colhido. O fluido é limpa de detritos por centrifugação, aliquotado e transferido para -80 ° C para armazenamento a longo prazo. A grande quantidade (5-10 ml de fluido por ovo contendo vírus) e título de alta vírus quais geralmente são obtidas com este protocolo fez com que o uso de ovos para a preparação de vírus nosso método favorável, em particular, para estudos in vitro que necessitem de grandes quantidades de vírus em que são necessárias doses elevadas da mesma reserva de vírus.

Introdução

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Influenza A continua a ser uma grande ameaça para a saúde humana. É uma doença respiratória potencialmente devastador com uma grande carga global causando até 500.000 mortes no mundo anualmente ^1. Os vírus da gripe estão na família Orthomyxoviridae e levar de cadeia simples RNA 8 negativas-sense em seu genoma ^1,2. A mutabilidade alta (isto é, "deriva" antigénico) do genoma viral impede a imunidade a longo prazo. Além disso, a gripe é cada vez mais resistentes aos medicamentos anti-virais ^3.

A pandemia de gripe H1N1 2009 em destaque todas as questões desafiadoras associados à doença influenza (esti....

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Protocolo

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NOTA: Observações gerais: executar todos os procedimentos que envolvem a manipulação do ovo em condições estéreis, e uma técnica estéril deve ser usado em conformidade. Pré-limpa todos os equipamentos com etanol 70% antes do uso. Em geral, a inoculação e colheita vírus influenza deve ser realizado em um laboratório BSL-2. No entanto, se esse protocolo é usado para propagar muito mais patogênico vírus da gripe (por exemplo, cepas pandêmicas e pré-pandemia, estirpes que representam um perigo para as aves de capoeira e, cepas altamente patogênicas da gripe aviária, o H1N1 estirpe 1918 gado), níveis de biossegurança mais elevadas e em alguns casos, as precauções....

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Resultados

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Vários métodos têm sido desenvolvidos para titular o vírus da gripe. Uma consideração na escolha de um método adequado é que alguns determinar partículas totais, independentemente da viabilidade (por exemplo, o ensaio de hemaglutinina), enquanto outros são baseados em infectividade, que avaliará virions viáveis (por exemplo, teste de placas) ^6. Aqui, o título virai de líquido alantóico recolhidas a partir de ovos de galinha inoculados com um vírus da gripe adaptada-rato (A / PR / 8/34) foi.......

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Discussão

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Influenza provoca uma grande carga global de doenças, eo trabalho continua para a compreensão da patogênese da lesão pulmonar ^7. Para facilitar a investigação nesta doença mortal, vários métodos têm sido desenvolvidos para propagar o vírus da gripe ^6. Aqui, descrevemos uma técnica para produzir vírus influenza em ovos de galinha. A vantagem deste método é que é altamente reprodutível e resulta em grandes quantidades de estoques de vírus de título elevado gripe, o que é muitas vezes necessário p.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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O presente estudo foi apoiado pelo NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.) e pelo American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Cellgro	21-040-CV
ovos de galinha fertilizados sem patógenos (SPF) de soro	VALO BioMedia
	FARM iNNOVATORS	Modelo 2100
virador de ovos automático	FARM iNNOVATORS	Modelo 3200
veleiro de ovos	FARM iNNOVATORS	Modelo 3300
Seringa de 1 ml	BD Bioscience	309659
agulha 18G	BD Bioscience	305196
agulha 20G / 22G	BD Bioscience	305176 / 305156
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Etanol>99,5%	Sigma-Aldrich	459844	diluído a 70% usando pistola de cola de água
"Ad tech Hi Temp Projeto Pro"	Tecnologia de anúncios, Adhesive Technologies, Inc.	Cola modelo 1105
"Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"	Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.	220-34ZIP30
células MDC	ATCC	CRL-2935
lavaram glóbulos vermelhos de peru agrupados, 10%	Lampire Biological Laboratories	724908

Incubadora de ovos umidificados

Referências

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Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y.

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