O objetivo deste protocolo é demonstrar os princípios e técnicas para medir e calcular a taxa de filtração glomerular, a taxa de fluxo de urina e a excreção de sódio e potássio em um rato. Esta demonstração pode ser usada para fornecer aos alunos uma compreensão conceitual geral de como medir a função renal.
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Artigo de método
Laboratório de Fisiologia Demonstração: Taxa de filtração glomerular em um Rat
Neste artigo
Resumo
Resumo
As medidas da taxa de filtração glomerular (TFG) e da excreção fracionada de sódio (Na) e potássio (K) são críticas na avaliação da função renal na saúde e na doença. A TFG é medida como a depuração renal da inulina no estado estacionário, que é filtrada no glomérulo, mas não secretada ou reabsorvida ao longo do néfron. A excreção fracionada de Na e K pode ser determinada a partir da concentração de Na e K no plasma e na urina. A depuração renal da inulina pode ser demonstrada em um animal anestesiado que possui cateteres na artéria femoral, veia femoral e bexiga. Os equipamentos e suprimentos usados para este procedimento são aqueles comumente disponíveis em uma instalação central de pesquisa e, portanto, tornam este procedimento um meio prático para medir a função renal. O objetivo deste vídeo é demonstrar os procedimentos necessários para realizar uma demonstração laboratorial na qual a função renal é avaliada antes e depois de um medicamento diurético. A técnica apresentada pode ser utilizada para avaliar a função renal em modelos de doença renal em ratos.
Introdução
A função mais importante do rim é a regulação homeostática da água extracelular e do conteúdo eletrolítico. Os rins regulam de perto a água extracelular, o sódio (Na) e o potássio (K) para manter os níveis fisiológicos normais. Distúrbios na função renal podem resultar em distúrbios metabólicos graves que podem ser fatais. O processo renal básico ocorre no néfron e começa com a filtração do plasma no glomérulo e termina com a excreção de urina. Outros processos que determinam a concentração final de água, Na e K na urina são secreção e reabsorção dentro do néfron. As medições da taxa de filtração glomerular (TFG) e da excreção fracionada de Na e K são críticas na avaliação da função renal na saúde e na doença. O leitor é encaminhado para artigos de revisão e livros didáticos publicados anteriormente para uma discussão mais completa da função renal1-4.
TFG pode ser medida como a depuração renal em estado estacionário da inulina que é filtrada no glomérulo, mas não secretada ou reabsorvida ao longo do néfron5. Embora essa técnica exija anestesia, preparação cirúrgica e um experimento terminal, ela é considerada o padrão-ouro da medição da TFG. Usando inulina marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC), a concentração plasmática e urinária de FITC-inulina pode ser facilmente medida em pequenos volumes e usada para calcular a TFG durante vários pontos de tempo de um experimento. A excreção fracionada de Na e K pode ser determinada a partir da concentração de Na e K no plasma e na urina.
A compreensão conceitual de como medir a função renal pode ser facilmente demonstrada em um pequeno laboratório projetado para permitir que os alunos participem ativamente de alguns aspectos do experimento. Este vídeo mostra a preparação pré-laboratorial, a demonstração da função renal e a avaliação pós-laboratorial dos resultados. As técnicas cirúrgicas necessárias para a realização de medidas da TFG são demonstradas em um rato anestesiado. Além disso, exemplos de cálculos para TFG e excreção fracionada de Na e K são mostrados antes e depois da administração de um medicamento diurético.
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Protocolo
Antes de qualquer procedimento animal, o cuidado com os animais e uso comitê institucional (IACUC) deve aprovar o protocolo. Este protocolo foi aprovado pela Michigan State University IACUC.
1. Preparação de pré-laboratório de solução de FITC-inulina
- Aqueça 20 ml de solução salina a 70 ° C e agita-se lentamente em 100 mg de FITC-inulina (5 mg / ml de FITC-inulina) de inulina é até que todo dissolvido.
- Solução arrefecer até à TA e adicionar 800 mg de albumina de soro de bovino (40 mg / ml de BSA, em pó liofilizada, essencialmente livre globulina, baixa endotoxina, ≥98% de pureza por electroforese em gel de agarose).
- Filtra-se a solução de inulina-BSA com papel de filtro (grau 1). Coloque a solução filtrada em uma seringa de 20 ml com um filtro de seringa com ponta (0,2 um) e cobrir com folha de a proteger da luz.
2. Anestesia e Cirurgia
- Coloque o rato em uma câmara de indução preenchido com 5% de isoflurano para induzir a anestesia. Grave bodpeso y (250-350 g) e colocar o rato numa plataforma cirúrgica aquecido concebido para manter 37 ° C a temperatura do corpo durante todo o experimento. Segurar cuidadosamente o rato para a plataforma com fita de laboratório sobre as patas. Manter a anestesia com 1-2% de isoflurano com classe médica 100% O 2 a taxa de fluxo de ar de 0,8-1,0 L / min.
- Inserir um cateter cônico (OD ponta intravascular, 2.7F) na artéria femoral para pressão arterial e monitoramento da freqüência cardíaca, e coleta de sangue.
- Inserir um cateter (PE-50) na veia femoral para infusão de inulina. Prenda o cateter ao tecido com 5-O trançado de seda de sutura cirúrgica 6 circundante.
- Fixe o cateter arterial a um transdutor de pressão calibre de tensão. Pressão arterial e freqüência cardíaca registro usando o software de aquisição de dados e exibição em uma tela de computador em tempo real. Esta técnica é demonstrado em detalhe em vídeo 6.
- Expor a bexiga através de uma incisão suprapúbica. Corte um pequenoorifício na ponta da bexiga e da inserção de uma cânula (PE-190) com uma ponta de calor queimado no interior da bexiga para a recolha de urina. Fixe a cânula para a bexiga com uma sutura em bolsa.
3. urina e coleta de sangue
- Colocar a seringa de FITC-inulina em uma bomba de seringa com velocidade de fluxo definido de 1 ml / h por 100 g de peso corporal (3 ml / h durante um rato pesando 300 g). Fixe a seringa para o cateter na veia femoral. Iniciar a infusão de inulina e permitir um período de equilíbrio de 1-2 horas. Manter seringa coberto de uma camada para proteger da luz.
- Determinar se o ritmo de fluxo de urina é estável e adequado para a análise de amostras (20 ul / min) através da recolha de uma amostra de urina de uma pré-pesados para um frasco de recolha período de 10 min. Determinar o volume de urina por gravimetria com uma balança digital. Um volume de urina suficiente durante um período de recolha de 10 min é de 0,2 ml. Continuar a recolher amostras de urina até duas coleções consecutivos indicam uma taxa de fluxo de urina de 20 l / mou mais.
- Amostras pré-droga
- Recolher uma amostra de urina durante um período de 20 min. Recolher uma amostra de sangue (0,5 ml) a partir do cateter arterial, no ponto médio do período de recolha de urina. Tenha o cuidado de limpar completamente o cateter arterial de solução salina antes de coletar uma amostra de sangue em um frasco contendo uma coleção U heparina. Use frascos de coleta com marcações de volume para facilitar a recolha de 0,5 ml de sangue arterial.
- Lave o catéter arterial com heparina-solução salina (20 U / mL) para limpar o cateter de sangue (aprox. 0,1 mL). O comprimento do cateter arterial deve ser tão curto quanto possível, para limitar o volume de solução salina de heparina-necessária para descarregar.
Nota: as amostras de sangue diluído produzir cálculos imprecisos de TFG e excreção fracionada de Na e K. - Aguarde 10 minutos e repita a cobrança de uma segunda urina Pré-drogas e amostra de sangue.
- Após a coleta de duas amostras de pré-droga, administrar um diurético drug, a furosemida (10 mg / kg), através do cateter arterial. Lave o cateter arterial com solução salina heparinizada para limpar o cateter de drogas. Ter o cuidado de evitar a injecção de ar através do cateter arterial. Anote o tempo da injeção de furosemida.
- As amostras post-droga: Em cada um dos três pontos de tempo a seguir, recolher uma amostra de urina durante um período de recolha de 10 min, e uma amostra de sangue (0,5 ml) no ponto médio do período de recolha de urina.
- Para Sample Post-Drogas 1 - coletar cinco minutos após a furosemida.
- Para Post-Drogas Amostra 2 - recolher dez minutos após a furosemida.
- Para Sample Post-Drogas 3 - recolher quinze minutos após a furosemida.
- Depois de todas as amostras foram coletadas, eutanásia do rato em conformidade com os procedimentos institucionais por toracotomia e remoção do coração. Remova ambos os rins. Decapsulate (remover a membrana que envolve) e apagar os rins para remover o excesso de sangue. Pesar os rins.
4. Análise Amostra
- Meça todos os volumes de amostras de urina por gravimetria com uma balança digital, e pesos recordes.
- Amostras de sangue total de centrifugação, utilizando uma centrífuga de bancada (1800 x g) para separar o plasma. Transferir as amostras de plasma para pequenos frascos rotulados.
- Analisar as concentrações de sódio e potássio em amostras de urina e plasma com um analisador de sódio / potássio.
- Medição de FITC-inulina no plasma e urina
- Dilui-se a urina de pré-droga (de 1: 200 a 1: 400), e na urina pós-fármaco (1:10) com tampão HEPES (500 mM, pH 7,4).
- Adicionar 40 ul de padrão ou de amostra ul e 60 de tampão HEPES numa placa de 96 cavidades (uma amostra por cavidade) e deixa-se misturar durante 10 min enquanto se coberto com folha de alumínio.
- Gerar uma curva padrão para FITC-inulina, relativamente às concentrações de 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug / ml (Figura 1). Determinar a fluorescência de FITC-inulina em amostras e padrões usando um leitor de microplacas com excitação e comprimentos de onda de emissão de 485 e 538 nm, respectivamente.
- Encaixe os valores fluorescentes para os padrões de uma análise de regressão função logística de 4 paramter. Os parâmetros da função de regressão são usados para calcular a concentração de FITC-inulina em amostras de plasma e de urina (Tabela 1).
5. Pós-laboratório Análise de Resultados: Cálculos
- Calcular Urina Taxa de Fluxo (UV; ml / min): [volume de urina recolhida (ml)] ÷ [tempo da recolha (min)]
- Calcular Taxa de Filtração Glomerular (GFR; ml / min): [a concentração de inulina urina (ug / ml) x UV (ml / min)] ÷ [inulina conc plasma. (Ug / ml)]
- Calcular filtrada Carga de sódio (pmol / min): concentração de sódio no plasma (nmol / ml) x TFG (ml / min)
- Calcular excreção de sódio Classificação (U Na V; umol / min): concentração de sódio na urina (pmol / ml) x UV (ml / min)
- Calcule Fractional excreção de sódio (FE Na;%): [L Na V (pmol / min)] ÷ [Carga de sódio filtrado (pmol / min)] x 100
- Calcular carga filtrada potássio (pmol / min): a concentração de potássio no plasma (nmol / ml) x TFG (ml / min)
- Calcular excreção de potássio Classificação (L K V; umol / min): concentração de potássio da urina (pmol / ml) x UV (ml / min)
- Calcule Fractional excreção de potássio (K FE;%): [U K V (mmol / min)] ÷ [Load potássio filtrado (mmol / min)] x 100
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Resultados
O diurético usado no laboratório demonstração foi furosemida que muito rapidamente inibe a reabsorção de Na e K filtrada pelo rim, resultando em aumento de Na, K, e a excreção de água dentro de minutos após a administração da droga. Por seu mecanismo primário, furosemida deve ter efeitos mínimos sobre a TFG e da carga filtrada de Na e K, mas vai aumentar o fluxo de urina, e fração de excreção de Na e K.
Os resultados representativos da Tabela 3 mostram que, num rato anestesi...
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Discussão
Um marcador apropriado para a medição de GFR deve atender quatro critérios: ser livremente filtrada no glomérulo, ser independente para proteínas do plasma, e nem ser absorvido nem secretada no néfron. A inulina é um polímero de frutose, que satisfaz estes critérios. Como resultado, a depuração renal da inulina é considerada o padrão ouro para medir GFR 7. A técnica demonstrada representa a abordagem tradicional da determinação da eliminação renal de inulina utilizando recolhas de urina cronometrados durante ...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. As opiniões ou afirmações contidas neste documento são os pontos de vista particulares do autor e não devem ser interpretadas como funcionário ou como refletindo os pontos de vista do Departamento do Exército ou do Departamento de Defesa.
Agradecimentos
A fonte de financiamento para a demonstração laboratório estava concessão NIGMS: GM077119. Agradecemos ao Dr. Joseph R. Haywood e Dr. Peter Cobbett pelo apoio do Short Couse em Integrative e Órgão Sistemas de Farmacologia. Agradecemos também a Senhora Hannah Garver por seu apoio técnico da demonstração laboratorial.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sutura Cirúrgica de Seda Trançada 5-0 | Surgical Specialties Corp | SP1033 | |
| Placa de Ensaio, 96-Well | Costar | 3922 | |
| Albumina de Soro Bovino | Sigma Chemical Co | A2934-25G | |
| Centrífuga | Beckman Coulter | MicroFuge 18, 357160 | |
| Tubos de Amostra Cônicos | Dot Scientific Inc. | #711-FTG | |
| Aplicadores com Ponta de Algodão | Solon Manufacturing Co | 56200 | |
| ADInstruments | LabChart Pro 7.0 | ||
| Balança Digital | Denver Instrument | APX-4001 | |
| FITC-Inulina | Sigma Chemical Co | F3272-1G | |
| Esponjas de Gaze | Covidien | 2146 | |
| Cama Cirúrgica Aquecida | EZ-Anestesia | EZ-212 | |
| Heparina | Sagnet | NDC 25021-402-10 | |
| HEPES | Sigma Chemical Co | H3375 | |
| Isoflurano | Abbott Animal Health | IsoFlo, 5260-04-05 | |
| Vaporizador de Isoflurano | EZ-Anestesia | EZ-190F | |
| Micro Dissecação Fórceps | Biomedical Research Instruments Inc. | Leitor de Microplacas 70-1020 | |
| - Fluoroskan | ThermoScientific | Ascent FL, 5210460 | |
| NOVA 5+ Analisador de Sódio/Potássio | NOVA BioMedical | 14156 | |
| Porta-agulhas Olsen-Hegar com Tesoura | Ferramentas de Ciência Fina | 12002-12 | |
| PE-190 (para cateter de bexiga) | BD Medical | 427435 | |
| Transdutor de Pressão& nbsp; | ADInstruments | MLT1199 | |
| Pyrex Culture Tubes | Corning Inc. | 99445-12 | |
| Cateter de Artéria Cônica Femoral de Rato | Aplicações Estratégicas Inc. | RFA-01 | |
| Salix Furosemida 5% | Intervet | # 34-478 | |
| Estrabismo Tesoura | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Tesoura Cirúrgica para Estudantes | Ferramentas de Ciências Finas | 91402-12 | |
| Luvas Cirúrgicas | Kimberly-Clark | Sterling Nitrile Gloves | |
| Bomba de seringa | Razel Scientific | R99-E | |
| Fórceps de Tecido | Fine Science Tools | 91121-12 | |
| Tesoura de Tecido | George Tiemann Co | 105-420 | |
5-0 Sutura Cirúrgica de Seda Trançada Surgical Specialties Corp SP1033 Placa de Ensaio, 96-Well Costar 3922 Albumina de Soro Bovino Sigma Chemical Co A2934-25G Centrífuga Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Tubos de Amostra Cônicos Dot Scientific Inc. #711-FTG Aplicadores com Ponta de Algodão Software de Aquisição de Dados Solon Manufacturing Co 56200 ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Balança Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulina Sigma Chemical Co F3272-1G Esponjas de Gaze Covidien 2146 Cama Cirúrgica Aquecida EZ-Anesthesia EZ-212 Heparina Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurano Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Vaporizador de Isoflurano EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Leitor de Microplacas - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Analisador de Sódio/Potássio NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Porta-agulhas com Tesoura Ferramentas de Ciência Fina 12002-12 PE-190 (para cateter de bexiga) BD Medical 427435 Transdutor de Pressão ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Cateter de Artéria Cônica Femoral de Rato Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemida 5% Intervet #34-478 Tesoura de Estrabismo Fine Science Tools 14075-11 Tesoura Cirúrgica para Estudantes Fine Science Tools 91402-12 Luvas Cirúrgicas Kimberly-Clark Sterling Luvas de Nitrilo Bomba de seringa Pinça de Tecido Razel Scientific R99-E Fine Science Tools 91121-12 Tesoura de Tecido George Tiemann Co 105-420 |
Referências
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Reimpressões e permissões
