Visualização direta do Murino Dorsal Coclear Nucleus para Optogenetic Estimulação da via auditiva

Resumo

O objetivo deste protocolo é delinear uma abordagem cirúrgica para fornecer acesso direto ao núcleo coclear dorsal em um modelo murino.

Resumo

A investigação sobre o uso da transferência de genes mediada por vírus para prender ou reverter a perda auditiva tem sido amplamente relegado para o sistema auditivo periférico. Poucos estudos examinaram transferência de genes para o sistema auditivo central. O núcleo dorsal coclear (DCN) do tronco cerebral, que contém neurônios de segunda ordem da via auditiva, é um local potencial de transferência de genes. Neste protocolo, uma técnica para exposição direta e máxima da DCN murino através de uma abordagem posterior fossa é demonstrada. Esta abordagem permite a qualquer cirurgia aguda ou sobrevivência. Após a visualização direta da DCN, uma série de experimentos são possíveis, incluindo a injeção de opsinas para o núcleo coclear e subsequente estimulação por uma fibra óptica acoplada a uma luz de laser azul. Outros experimentos neurofisiologia, como a estimulação elétrica e traçados injetores neurais também são viáveis. O nível de Visualização e a duração da estimulação realizável que esta abordagem seja aplicável a uma ampla gama de experiências.

Introdução

A transferência gênica mediada por vírus para reverter a perda auditiva tem se concentrado amplamente no sistema auditivo periférico. ¹ Visando a cóclea, os investigadores examinaram uma série de vias de entrega, incluindo infusão osmótica de minibomba², Gelfoam®2 embebido em complexo vetor-transgene ² ou esponja de gelatina³, microinjeção direta⁴; numerosos vetores de transferência de genes, incluindo vetores virais adeno-associados^5,6, vetores lentivirais⁷ e lipossomas catiônicos²; e a disseminação de vetores de transferência de genes além do tecido-alvo². Mais recentemente, o vírus adeno-associado (AAV)-1 foi introduzido na cóclea para tratar a surdez em camundongos devido à perda do transportador vesicular de glutamato-3. ⁸ Além disso, a aplicação da optogenética no sistema auditivo periférico foi descrita recentemente. ⁹

Poucos estudos, no entanto, examinaram a transferência de genes para o sistema auditivo central. O núcleo coclear dorsal (DCN) do tronco encefálico contém neurônios de segunda ordem da via auditiva. Embora as técnicas de transferência de genes no núcleo coclear (NC) possam ser utilizadas para uma série de investigações, a transferência de genes de opsinas, proteínas sensíveis à luz, para o DCN também pode ser utilizada para permitir técnicas experimentais baseadas em optogenética. Após a entrega de transferência de genes mediada por vírus de uma opsina, como a channelrodopsina-2 (ChR2), os neurônios do DCN tornam-se sensíveis a estímulos luminosos. A transferência de genes optogenéticos foi previamente tentada em várias regiões do tronco encefálico, incluindo o núcleo retrotrapezóide de rato, locus coeruleus de camundongo, colículo superior de macaco e área tegmental ventral de camundongo. ^10-14

Recentemente, os investigadores examinaram o uso da optogenética no DCN. ^15,16 O DCN é o local de colocação de implantes auditivos de tronco encefálico em humanos, tornando-se uma parte atraente do sistema auditivo para estudo de estudos translacionais em neuropróteses auditivas. No entanto, dada a localização do DCN, a exposição cirúrgica é um desafio. A técnica aqui descrita fornece um protocolo para exposição máxima do DCN por meio da abordagem da fossa posterior para permitir a transferência de genes do vetor viral e experimentos baseados em optogenética em um modelo murino. Estudos anteriores usaram microinjeção estereotáxica no DCN com canalrodopsina-2. ¹⁶ As injeções estereotáxicas, no entanto, são potencialmente menos precisas do que as injeções feitas por visualização direta, especialmente em um núcleo tão pequeno e profundo ao longo do tronco cerebral quanto o DCN. Camundongos transgênicos que expressam proteínas específicas do tecido no NC também são uma opção atraente e evitariam a necessidade de transferência de genes. Nosso protocolo de exposição ao DCN também funcionaria em camundongos transgênicos, pois o DCN precisaria ser exposto diretamente para estimulação óptica. Essa técnica de exposição cirúrgica das DCN é adaptada de protocolos anteriores envolvendo registros do nervo auditivo e do núcleo coclear em modelos de camundongos e ratos. ^15,17-20

O objetivo geral do protocolo é fornecer exposição direta ao NC para permitir técnicas de transferência de genes. Mais especificamente, a abordagem é compatível com cirurgia aguda e de sobrevivência e a preparação pode ser repetida no mesmo animal para testes neurofisiológicos subsequentes. A exposição direta do protocolo DCN tem implicações para a experimentação baseada em transferência de genes mediada por optogenética e vírus em outros núcleos do tronco cerebral.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos experimentais são realizados de acordo com o Cuidado e Uso Comitê Animal do Massachusetts Eye e Ear Infirmary e Harvard Medical School, que seguem as diretrizes nacionais de cuidados de animais, incluindo a Política Pública de Saúde de serviço na Humane Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, o Guia ILAR, e da Lei do Bem-Estar Animal. Procedimentos experimentais listados abaixo exposição do DCN esquerda detalhe. Usar instrumentos esterilizados durante a realização da cirurgia de sobrevivência.

1. Primária Craniotomia e Dorsal Coclear Nucleus Exposição

1. Anestesia
   1. Anestesiar um rato, com idade 8-12 semanas, com peso de 18-24 g, com xilazina 20 mg / kg de cetamina e 100 mg / kg via intraperitoneal. Confirme anestesia adequada pelo monitoramento da frequência cardíaca, frequência respiratória, bem como reflexo toe pitada retirada. Lugar vet pomada nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. Uma vez adequadamente sob anestesia, cabelo shave recobre tele couro cabeludo para fornecer acesso livre para o local da cirurgia.
2. Posicionamento cirúrgico
   1. Posicione o mouse de forma segura em um suporte estereotáxico de pequenos animais, mantido no lugar por um grampo focinho.
   2. Certifique-se de que o grampo focinho é solto o suficiente para permitir a respiração adequada, mas firme o suficiente para imobilizar completamente a cabeça do rato. Se a cabeça do mouse é solto, o animal é provável cair fora do suporte da cabeça durante a parte craniotomia de procedimento.
   3. Coloque auditivo de tronco cerebral implante de eletrodos em forma padrão, o que permite o monitoramento da frequência cardíaca. A freqüência respiratória deve ser monitorizada através da visualização. Note-se que a frequência cardíaca normal e taxa respiratória irá variar dependendo da idade do rato.
   4. Um termômetro é colocado e é assegurada euthermia via colocação em um cobertor térmico homeotérmicos.
3. Incisão da pele e exposição dos ossos interparietal e occipital do crânio
   1. Sob uma Microscope, fazer uma incisão vertical através da pele a partir da linha média, diretamente entre o pavilhão auricular, e estendendo-se até a porção caudal do occipital. Seguindo na linha média da pele incisão, deslocar a pele lateralmente. Visualize os músculos que cobrem a esquerda da face posterior do crânio.
   2. Remover muscular que recobre a parietal esquerdo, interparietal, e os ossos occipital do crânio pela desarticulação de anexos musculares para seus respectivos ossos com um bisturi ou tesoura iris. Observar um pequeno grau de sangramento ao longo das bordas musculares corte. Minimizar isso por uma leve pressão com um aplicador com ponta de algodão para 10-15 seg.
4. Sobreposta craniotomia Coclear Nucleus
   1. Identificar linhas de sutura relevantes, incluindo suturas sagital e lambda linhas (Figura 1, painel da esquerda).
   2. Usando rongeurs, fazer uma craniotomia sobre o osso interparietal, à esquerda da linha média, ~ 2 milímetros caudal para a linha de sutura lambda. Esta região sobrepõe à DCN.
   3. Seguireig craniotomia, observar uma fina camada de dura-máter que se sobrepõe ao cerebelo. Usando uma lâmina de bisturi, remover a dura-máter. (Figura 1, painel médio).
      NOTA: A remoção da dura-máter pode causar um pequeno grau de hemorragia. Este processo de usar a lâmina de bisturi para remover a dura destina-se a reduzir a quantidade de perda de sangue durante a aspiração cerebelo, que vai reunir na superfície do tronco cerebral e identificação obscura do DCN. Volume total de sangue de rato é de aproximadamente 1,5 ml não deve exceder> de 15%. Se o sangramento for superior a esse valor, o rato deve ser fornecido com a suplementação com fluido.
   4. Retirar sangue coagulado sobrepondo o cerebelo com o aplicador de ponta de algodão. Opcionalmente, pingar soro fisiológico delicadamente usando um ponto dental para o cerebelo para limpar o sangue para fora do sangue.
5. Cerebelar Aspiração
   1. Usando uma sucção 5 francês, aspirar a porção mais lateral do cerebelo que se sobrepõe à esquerda DCN até o DCN é visual (Figura 1, painel da direita). Retirar cerca de 1/4 a 1/3 do cerebelo esquerdo. O principal marco adjacente à DCN é a ampola do canal semicircular superior.
      NOTA: A aspiração do cerebelo é o passo fundamental do protocolo. Dirigido aspiração do cerebelo é realizado com mais sucesso se ocorrer em uma única tentativa e não com várias passagens da sucção, pois isso irá causar sangramento. Para auxiliar na aspiração, definir o plano focal do microscópio na profundidade prevista para o CN, o qual será ligeiramente distai para a superfície do cerebelo. Definir o plano focal para o CN vai melhorar a visualização e garantir uma imagem nítida.
   2. Após aspiração, de nova hemorragia, líquido cefalorraquidiano (LCR) build-up, e deslocamento cerebelo no DCN são esperados. Instilar 0,5 cc de solução salina estéril rapidamente na craniotomia para impedir a coagulação do sangue. Uma combinação de pontuar suave com um ponto dental e sucção pode então serusado para limpar um caminho para a visualização direta da DCN. Não contactar directamente a superfície do DCN.

2. Microinjection Pressão para mediada-Virus Gene Transferência e recuperação cirúrgica

1. Após a DCN é livre de sangue sobrejacente e CSF e é claramente visível, fazer microinjeções de pressão no DCN usando a 10 ul Hamilton seringa durante um período de 2 min.
2. Introduzir a agulha com um micromanipulador até que a ponta já não é visível sob a superfície do DCN.
3. Para um desempenho óptimo, utilizar uma agulha de calibre 33 ou 34 (com uma seringa estanque aos gases com a agulha de calibre 34) com um chanfro raso, tal como 45 °, para minimizar o trauma sem corte e localizar o volume de injecção no interior da DCN, que é uma fina e estrutura do tronco cerebral raso (<300 mm de espessura).
   NOTA: Outros instrumentos microinjeção pode ser utilizado com base. Idealmente, a injeção instrumento deve ser flexível para permitir uma ligeira bend, se necessário, para atingir diretamente o DCN. Além disso, como o rato se move ligeiramente ao longo do processo, devido à respiração, o instrumento deve ser suficientemente robusto para resistir a pequenas quantidades de movimento.

3. Recuperação Cirúrgica

1. Imediatamente após a injecção, re-aproximar a pele e permitir que o mouse para se recuperar por procedimento padrão de recuperação. Restante cerebelo e cicatriz irá preencher a cavidade causada pela aspiração do cerebelo. Constantemente monitorar os animais até que a consciência suficiente é recuperada para manter decúbito esternal. Monitor de frequência cardíaca, frequência respiratória, bem como a capacidade para se alimentar.
   NOTA: Nenhum animal que foi submetido a cirurgia é devolvido para uma gaiola com outros animais até totalmente recuperado.
2. Se um rato começa a andar em círculos de pós-operatório (<5% dos casos), geralmente 2-4 horas após o fechamento da incisão na pele, sacrificar imediatamente o mouse, como ele provavelmente teria uma alimentação momento difícil. Tseu efeito colateral é provavelmente devido à aspiração de o cerebelo. O animal deve ser monitorado para a dor no pós-operatório, e narcóticos adequadas devem ter para garantir o conforto dos animais com base em normas institucionais. Antibióticos podem ser necessárias, se houver sinais de infecção.

4. Secundária Craniotomia e Coclear Nucleus Exposição

1. Após 2-4 semanas de cicatrização e gene transferência de incubação mediada por vírus, re-anestesiar uma previamente injetados mouse e repita o passo 1,1-1,5 tempo de incubação Optimal varia com o tipo de gene transferido.
2. Remover o tecido cicatricial no local da craniotomia por uma combinação de uma pinça, bisturi, e fórceps.
3. Após visualizar a craniotomia, identificar uma combinação de permanecer cerebelo e tecido cicatricial que recobre a DCN. Use a 5 de sucção para aspirar francês cerebelo sobreposta / tecido cicatricial (similar à aspiração cerebelar anterior).
4. Após aspiração, esperar mais sangramento, CSF build-up, e os bits restantes do cerebelo. Introduzir rapidamente em solução salina a craniotomia para impedir a coagulação do sangue. Use uma combinação de suave dabbing ponto dental e sucção para limpar o caminho para a visualização direta da DCN.
5. Observar a superfície do DCN. Realizar experimentos de fisiologia à base de optogenética como DCN é agora acessível. Introduzir um estímulo de luz, por exemplo com uma fibra óptica (Figura 2), para conduzir uma experiência baseada Optogenetics.

5. Histologia

1. Após a conclusão dos experimentos, sacrificar o mouse com uma overdose de cetamina. Perfundir do rato com soro fisiológico normal seguido por paraformaldeído a 4%.
2. Extraia o tronco cerebral a partir do crânio e pós-correção para 2 horas. Cryoprotect do tronco cerebral em 30% de sacarose por 24-48 horas. Secção do tronco cerebral utilizando um criostato padrão usando 60 mm secções.

Resultados

Parcial Cerebellar aspiração demonstra ter acesso ao núcleo coclear

Após a pele e músculo sobrejacente ao crânio são removidos, marcadores de superfície do crânio, como as linhas de sutura coronal e lamda, demonstrar a localização aproximada da craniotomia. Após craniotomia com fórceps, o cerebelo é visualizada. Aspiração cuidadosa da pequena porção de o cerebelo demonstra visualização do CN, que podem então ser injectados (Figura 1).

Discussão

Este artigo descreve a técnica de visualização direta do DCN no modelo murino para a manipulação do sistema auditivo central. A abordagem descrita de visualização direta oferece vantagens significativas sobre a alternativa principal, que são abordagens estereotáxica. Primeiramente, a visualização direta da DCN permite confirmação imediata do local do tronco cerebral, enquanto abordagens estereotáxica não pagar a visualização direta. Em experiências que implicam o prolongados períodos de incubação, como é o caso da trans...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Suporte estereotáxico	Stoelting	51500
Manta homeotérmica	Harvard	507214
Lâmina de bisturi #11	Ferramentas Cirúrgicas Finas	10011-00
Tesoura de íris	Ferramentas Cirúrgicas Finas	14084-08
5 Sucção Francesa	Simetria Cirúrgica	2777914
Dental Pontos	Henry Schein	100-8170
Cirúrgicas Finas	Bone rongeur	16020-14
10 µ l Seringa Hamilton	Hamilton	7633-01
34 gauge, agulha	Hamilton
Rongeurs	Ferramentas Cirúrgicas Finas	16021-14