O objetivo deste protocolo é delinear uma abordagem cirúrgica para fornecer acesso direto ao núcleo coclear dorsal em um modelo murino.
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Artigo de método
Visualização direta do Murino Dorsal Coclear Nucleus para Optogenetic Estimulação da via auditiva
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A investigação sobre o uso da transferência de genes mediada por vírus para prender ou reverter a perda auditiva tem sido amplamente relegado para o sistema auditivo periférico. Poucos estudos examinaram transferência de genes para o sistema auditivo central. O núcleo dorsal coclear (DCN) do tronco cerebral, que contém neurônios de segunda ordem da via auditiva, é um local potencial de transferência de genes. Neste protocolo, uma técnica para exposição direta e máxima da DCN murino através de uma abordagem posterior fossa é demonstrada. Esta abordagem permite a qualquer cirurgia aguda ou sobrevivência. Após a visualização direta da DCN, uma série de experimentos são possíveis, incluindo a injeção de opsinas para o núcleo coclear e subsequente estimulação por uma fibra óptica acoplada a uma luz de laser azul. Outros experimentos neurofisiologia, como a estimulação elétrica e traçados injetores neurais também são viáveis. O nível de Visualização e a duração da estimulação realizável que esta abordagem seja aplicável a uma ampla gama de experiências.
Introdução
A transferência gênica mediada por vírus para reverter a perda auditiva tem se concentrado amplamente no sistema auditivo periférico. 1 Visando a cóclea, os investigadores examinaram uma série de vias de entrega, incluindo infusão osmótica de minibomba2, Gelfoam®2 embebido em complexo vetor-transgene 2 ou esponja de gelatina3, microinjeção direta4; numerosos vetores de transferência de genes, incluindo vetores virais adeno-associados5,6, vetores lentivirais7 e lipossomas catiônicos2; e a disseminação de vetores de transferência de genes além do tecido-alvo2. Mais recente....
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Protocolo
NOTA: Todos os procedimentos experimentais são realizados de acordo com o Cuidado e Uso Comitê Animal do Massachusetts Eye e Ear Infirmary e Harvard Medical School, que seguem as diretrizes nacionais de cuidados de animais, incluindo a Política Pública de Saúde de serviço na Humane Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, o Guia ILAR, e da Lei do Bem-Estar Animal. Procedimentos experimentais listados abaixo exposição do DCN esquerda detalhe. Usar instrumentos esterilizados durante a realização da cirurgia de sobrevivência.
1. Primária Craniotomia e Dorsal Coclear Nucleus Exposição
- Anestesia
- Anestesiar um rato, com idade 8-12 semanas, com p....
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Resultados
Parcial Cerebellar aspiração demonstra ter acesso ao núcleo coclear
Após a pele e músculo sobrejacente ao crânio são removidos, marcadores de superfície do crânio, como as linhas de sutura coronal e lamda, demonstrar a localização aproximada da craniotomia. Após craniotomia com fórceps, o cerebelo é visualizada. Aspiração cuidadosa da pequena porção de o cerebelo demonstra visualização do CN, que podem então ser injectados (Figura 1).
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Discussão
Este artigo descreve a técnica de visualização direta do DCN no modelo murino para a manipulação do sistema auditivo central. A abordagem descrita de visualização direta oferece vantagens significativas sobre a alternativa principal, que são abordagens estereotáxica. Primeiramente, a visualização direta da DCN permite confirmação imediata do local do tronco cerebral, enquanto abordagens estereotáxica não pagar a visualização direta. Em experiências que implicam o prolongados períodos de incubação, como é o caso da trans.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Financiamento: Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Bertarelli (DJL), uma subvenção MED-EL (DJL), e um dos Institutos Nacionais de Saúde Grants DC01089 (MCB).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Suporte estereotáxico | Stoelting | 51500 | |
| Manta homeotérmica | Harvard | 507214 | |
| Lâmina de bisturi #11 | Ferramentas Cirúrgicas Finas | 10011-00 | |
| Tesoura de íris | Ferramentas Cirúrgicas Finas | 14084-08 | |
| 5 Sucção Francesa | Simetria Cirúrgica | 2777914 | |
| Dental Pontos | Henry Schein | 100-8170 | |
| Cirúrgicas Finas | Bone rongeur | 16020-14 | |
| 10 µ l Seringa Hamilton | Hamilton | 7633-01 | |
| 34 gauge, agulha | Hamilton | ||
| Rongeurs | Ferramentas Cirúrgicas Finas | 16021-14 |
Referências
- Lalwani, A., Mhatre, A. Cochlear gene therapy. Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).
- Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
- Jero, J., et al.
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Reimpressões e permissões
