A Laboratory Bioassay alimentando-Fish para avaliar a actividade anti-predação de metabolitos secundários a partir de tecidos de organismos marinhos

Ecologia química desenvolvido com a colaboração de químicos e ecologistas. Embora a especialidade da ecologia química terrestre tem sido em torno de algum tempo, o de ecologia química marinha é apenas algumas décadas de idade, mas tem fornecido importantes contribuições para a ecologia e comunidade estrutura evolutiva dos organismos marinhos ^1-8. Aproveitando-se das tecnologias emergentes de mergulho e espectroscopia de RMN, químicos orgânicos rapidamente gerou um grande número de publicações que descrevem novos metabolitos de invertebrados marinhos bentônicos e algas na década de 1970 e 1980 ^9. Supondo-se que metabólitos secundários devem servir para alguma coisa, muitas dessas publicações atribuídas propriedades ecologicamente importantes para novos compostos sem evidência empírica. Mais ou menos ao mesmo tempo, os ecologistas também foram aproveitando o advento do mergulho e descreve as distribuições e abundâncias de animais bentônicos e plantas já conhecidas frosou métodos de amostragem relativamente ineficazes, como a dragagem. A hipótese dos pesquisadores foi que nada sésseis e de corpo mole deve ser quimicamente defendidas para evitar o consumo por predadores ^10. Em um esforço para introduzir o empirismo ao que foi o trabalho de outra forma descritiva em abundância das espécies, alguns ecologistas começaram extrapolando defesas químicas a partir de ensaios de toxicidade ^11. A maioria dos ensaios de toxicidade envolveu a exposição dos peixes inteiros ou em outros organismos para suspensões aquosas de extratos brutos da tecidos de invertebrados, com posterior determinação das concentrações de massa seca de extratos responsáveis ​​por matar metade dos organismos de ensaio. No entanto, os ensaios de toxicidade não imitar a maneira pela qual os predadores potenciais percebem presas em condições naturais, e estudos posteriores não encontraram nenhuma relação entre a toxicidade e palatabilidade ^12-13. É surpreendente que as publicações em revistas de prestígio utilizadas técnicas tendo pouca ou nenhuma ecological relevância ^14-15 e, hoje, que esses estudos ainda são amplamente citado. Ele é ainda mais alarmante notar que estudos baseados em dados de toxicidade continuam a ser publicados ^16-18. O método de bioensaio aqui descrito foi desenvolvido no final de 1980 para fornecer uma abordagem ecologicamente relevantes para os ecologistas marinhos químicos para avaliar as defesas químicas anti-predação. O método requer um modelo de predador para provar um extrato bruto do organismo alvo em uma concentração natural em uma matriz alimentar comparável nutricionalmente, fornecendo dados palatabilidade que são ecologicamente mais significativo do que os dados de toxicidade.

A abordagem geral para a avaliação da actividade anti-predação dos tecidos dos organismos marinhos inclui quatro critérios importantes: (1) um predador generalista apropriado devem ser usadas em ensaios de alimentação, (2) de todos os metabolitos orgânicos polaridades deve ser exaustivamente extraído do tecido do organismo alvo, (3) os metabolitos deve be misturados em um alimento nutricionalmente adequada experimental com a mesma concentração volumétrica como encontrado no organismo a partir do qual foram extraídos, e (4) o desenho experimental e abordagem estatística deve fornecer uma métrica significativa para indicar distastefulness relativa.

O procedimento descrito a seguir é projetado especificamente para avaliar as defesas químicas anti-predação de invertebrados marinhos do Caribe. Nós empregamos o bodião bluehead, Thalassoma bifasciatum, como um peixe predatório do modelo, porque esta espécie é comum em recifes de corais do Caribe e é conhecido por experimentar uma grande variedade de invertebrados bentônicos ^19. De tecido do organismo alvo é extraído em primeiro lugar, em seguida, combinada com uma mistura alimentar, e finalmente oferecido para grupos de T. bifasciatum observar se eles rejeitam os alimentos tratados com extrato. Dados de ensaio usando este método forneceram importantes insights sobre a química defensiva de organismos marinhos ^12,20-21, lhistória ife trade-offs ^22-24 e ^25-26 comunidade ecologia.

NOTA: Passo 3 do presente protocolo envolve indivíduos animais vertebrados. O procedimento foi concebido de modo que os animais recebam o tratamento mais humano possível e foi aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade de North Carolina Wilmington.

1) extracção de tecidos

1. Use tecido que está em seu estado natural de hidratação e não apertou, seca-out ou excessivamente úmido, pois isso irá alterar a concentração volumétrica de metabólitos secundários. Cortar ou cortar tecido para peças ou fatias que podem ser inseridos dentro de um tubo de centrífuga de 50 ml. Nota: O tecido fresco pode ser utilizado em alguns casos, mas muitas vezes é melhor cortar ou cortar tecido congelado, que não está sujeita a apertar, quando o corte.
2. Adicionar porções de tecido a 30 ml de uma mistura 1: 1 de diclorometano (DCM) e metanol (MeOH) em um tubo de centrífuga graduado até um volume final de 40 ml foi atingido. Certifique-se de realizar todas as etapas que envolvem a transferência desolvente em um exaustor com ventilação adequada.
3. Tapar o tubo e invertê-lo várias vezes, em seguida, agitar repetidamente durante um período de 4 horas de extracção. Nota: Durante este período, a água combina com o MeOH e o MeOH resultante: fase aquosa separa-se a fase de DCM. O tecido é exposto alternadamente a DCM e MeOH: água como uma emulsão como os tubos são agitados.
4. Transferir o extracto de DCM para um balão de fundo redondo e evapora-se até à secura num evaporador rotativo usando-se o calor baixo (<40 ° C). Usando solvente mínima, transferir o extracto seco a um frasco de cintilação de 20 ml. Montar o frasco com um adaptador evaporador rotativo e evapora-se novamente até à secura num evaporador rotativo usando-se o calor baixo (<40 ° C).
   Nota: O próximo passo requer o uso de um instrumento de compressão caseiro que pode ser montado por aparafusamento os seguintes artigos em ordem sequencial na extremidade de uma haste roscada (1) da porca (2), louça, e (3) da porca de bolota. A máquina de lavar ou deve ser perfurado oumontado de modo que seja menor que o diâmetro interno de um tubo de centrífuga de 50 ml.
5. Voltando para o tubo de centrífuga graduado que contém o tecido e o MeOH: extracto de água, espremer o meio de extracção para fora do tecido por meio de compressão. Transferir o MeOH: extracto de água ao mesmo balão de fundo redondo e armazenar refrigeradas (<10 ° C).
6. Adicionar MeOH para o tubo de centrífuga graduado até que o tecido já desidratado está submerso para uma segunda extracção de 2 a 6 horas de duração, em seguida, transferir o extrato MeOH novo para o balão de fundo redondo arrefecido contendo o MeOH: extracto de água. Se houver alguma preocupação de que o tecido não tem sido totalmente extraída, repetir a 2 a 6 horas de extracção de MeOH.
7. Seque o MeOH num evaporador rotativo usando-se o calor baixo (<40 ° C). Transferir o extracto aquoso remanescente a partir do balão de fundo redondo para o frasco de cintilação contendo o extracto não polar seco, usando um volume mínimo de MeOH para lavar o frasco de fundo redondo.
8. Evaporate o extracto aquoso até à secura utilizando calor baixo (<40 ° C) num concentrador de vácuo. O frasco de cintilação agora contém o extracto em bruto seco orgânico total de 10 ml de tecido. Evacuar o espaço superior do frasco com gás _N2 para evitar a oxidação, feche bem e armazenar congelados (-20 ° C).

2) Preparação de Alimentos

1. Prepare pó liofilizado manto squid.
   Nota: manto Squid fornece uma fonte de alimentação que é comparável à de outros invertebrados bentônicos, e irá ser utilizada como um ingrediente nos sub-passos de 2,2.
   1. Anéis congelados descongelamento do manto squid em deionizada quente (DI) de água, em seguida, purê-los em um misturador de alta velocidade.
   2. Verter uma fina camada de manto puré lulas em uma assadeira rasa e congelamento (-20 ° C), em seguida, romper a folha de puré lulas congeladas em pequenos pedaços para ser liofilizada.
   3. Liofiliza os congelados purê manto lula seguindo os procedimentos operacionais da freeze de cabelo.
   4. Pulverizar as peças liofilizadas de lula purê manto em um liquidificador de alta velocidade para formar um pó.
   5. Em um exaustor, despeje o manto squid em pó em uma peneira rotativa e peneire a farinha para separar grandes pedaços de tecido a partir do pó fino.
   6. Transfira a multa manto squid em pó para um recipiente lacrado. Evacuar o espaço de cabeça do recipiente com gás _N2 para evitar a oxidação e armazenar congelada (-20 ° C).
2. Preparar a mistura de alimentos.
   Nota: Quando executando vários ensaios consecutivos, é prático para preparar ~ 100 ml de mistura de alimentos, no entanto esta receita pode ser dimensionada para volumes menores, se necessário.
   1. Combinar uma mistura de 3 g de ácido algínico e 5 g de pó liofilizado manto lulas com 100 ml de água desionizada numa proveta de 150 ml. Agita-se vigorosamente com um microspatula durante alguns minutos até que o pó é completamente hidratada e a mistura é homogénea.
      NOTA: Se desejar, corante alimentar pode ser adicionado neste step: ele é mais fácil de adicionar à mistura de corante alimentar que vai gerar as duas misturas de controlo e tratados (mascarar o pigmento natural do extracto na mistura tratados com extracto) em vez de tentar fazer corresponder a cor da mistura tratada por adição de extracto tingir para a mistura de controlo. Uma cor esverdeada ou acastanhada alimentos é muitas vezes desejável para mascarar quaisquer pigmentos no extracto em bruto.
   2. Coloque exactamente 10 ml da mistura de alimentos para uma seringa graduada. Tome cuidado para evitar a inclusão de bolhas de ar durante este processo.
   3. Retirar o frasco de cintilação de 20 ml com extracto orgânico bruto seco do congelador. Adicionar uma ou duas gotas de MeOH, em seguida, misture o extrato em uma mistura homogênea com um microspatula.
   4. Ejectar o carregado seringa de 10 ml de matriz de alimentos para o frasco de cintilação de 20 ml e agita-se com uma microspatula para homogeneizar a mistura de alimentos tratados com extracto.
      Nota: Pode ajudar a ejetar a seringa em incrementos menores (ou seja, ejetar 2 ml e homogeneizar, em seguida, r.epita até que todos os 10 ml foram homogeneizados).
3. Prepare os grânulos de ensaio.
   1. Carregar um volume muito pequeno da mistura de extracto (~ 1 ml) com uma seringa, e submergir a ponta da seringa em uma solução de 0,25 M de _CaCl2. Injectar o conteúdo da seringa para formar uma longa, cadeia espaguete semelhante.
   2. Depois de alguns minutos, retire o fio endurecido, cortá-la em 4 mm de comprimento pelotas em uma placa de corte de vidro com uma lâmina de barbear, e depois enxaguar em água do mar.
   3. Repita os passos 2.3.1 e 2.3.2 sem incluindo o extrato de tecido para fazer pelotas de controle. Certifique-se para tratar a pellets de controlo com um volume equivalente de solvente (ver adição de MeOH a mistura tratada no passo 2.2.3) para controlar a adição de solvente. Se um controlo negativo é desejado para confirmar que os peixes ensaio pode ser impedido de alimentação, adicionar benzoato de denatónio, a uma concentração de 2 mg ^ml-1 para a mistura de alimentos crus ^27.

3) A palatabilidadeBioensaios

1. Realizar ensaios de alimentação com amarelo-fase Wrasse bluehead selvagens capturados, Thalassoma bifasciatum, mantidos em grupos de três em compartimentos opaco face de aquários laboratório.
2. Entregar pelotas de alimentos a partir de um copo de água do mar com uma pipeta de vidro com um bulbo de borracha. Nota: Pode demorar alguns dias para treinar peixes para receber o alimento desta forma. Um estímulo condicionado (por exemplo, alguns toques da pipeta no vidro do aquário) que precede a entrega de alimentos pode ser útil para treinar o peixe que esperar a adição de grãos de ração.
3. Pontuação peletes. Considere-se uma pelete aceite se prontamente consumida pelos peixes. Considere um pellet rejeitado se não comido depois de um mínimo de três tentativas por parte de um ou mais peixes para levá-la em sua cavidade bucal, ou se o pellet é abordado e ignorado após uma tentativa nesse sentido.
4. Amostras de pontuação. Nota: O procedimento de ensaio é descrito como um fluxograma na Figura 1, grupos de peixe que se recusam a comer.pelotas de controle em qualquer etapa do protocolo não são considerados ainda mais. Há dois resultados potenciais de uma única execução do ensaio: a amostra é aceitos ou rejeitados.
   1. Comece com uma bolinha de controle para confirmar que o grupo de peixes é cooperativa. Oferecer um pellet tratada. Se os peixes aceitar o pellet tratada, marcar a amostra que foi aceite. Se os peixes rejeitar o sedimento tratado, oferecer uma pelete de controlo subsequente para determinar se os peixes tenham cessado de alimentação. Se os peixes aceitar o pellet controle posterior, marcar a amostra como rejeitada.
5. Replication. Repita o procedimento de ensaio com dez grupos independentes de peixe para cada extrato.

4) Importância Avaliando

1. Avaliar a significância das diferenças no consumo de controle vs pelotas tratados com uma versão modificada do teste exato de Fisher ^26. Modificar o teste para que os totais marginais para o controle e pelotas tratados são fixos, Tratando-os como duas amostras aleatórias. Nota: Este fornece p = 0,057 quando 7 pelotas são consumidos; Assim, qualquer extracto é considerada impedimento se 6 ou menos pelotas são comidos, e saboroso se 7 ou mais pelotas são comidos.
2. Para comparar a palatabilidade relativa entre os grupos de extractos, calcular um número significativo de peletes consumidos dentro de cada grupo. Manter o limiar a 6 peletes assim um grupo de extractos replicados são considerados dissuasor se o número médio de peletes consumidos + erro padrão (SE) ≤6. Nota: Nos resultados representativos, o trabalho de grupo é espécie, assim replicar extratos provenientes de indivíduos distintos e a palatabilidade relativa pode ser comparada entre as espécies.

Aqui nós relatamos resultados deste ensaio biológico para seis espécies de esponjas do Caribe comuns (Figura 2). Estes dados foram inicialmente publicado em 1995 por Pawlik et al. 12 e demonstrar o poder dessa abordagem para examinar as diferenças de estratégias de defesa química entre taxa co-ocorrência. Os resultados foram relatados como uma média do número de peletes de alimento comido + erro padrão (SE) para cada espécie. Quase não há sedimentos foram consumidos em ensaios com extratos brutos de clathrodes Agelas, Amphimedon compressa e cauliformis Aplysina. Em contraste, os aglomerados feitos com extratos de Callyspongia vaginalis, Geodia gibberosa e Mycale laevis foram prontamente consumido no ensaio 12. Menos de seis pelotas foram comidos para as três primeiras espécies, para que eles eram considerados significativamente impedimento. Em contraste, os segundos três espécies não foram significativamente diferentes dos controlos, e eramconsiderado aceitável.

Figura 1:. Esquemática do procedimento de ensaio Em todas as fases, a rejeição de um sedimento de controlo indica que este conjunto de ensaio de peixe não cooperam ou saciados e não pode ser usado posteriormente. O protocolo começa por oferecer cada conjunto de peixes a pelota controle seguido por um sedimento tratado. Em seguida, se o sedimento tratado é aceita a amostra é classificada como aceito. Se o sedimento tratado é rejeitada, mas a pelota controle subseqüente for aceite, a amostra é classificada como rejeitada.

Figura 2: Consumo por Thalassoma bifasciatum de pelotas de alimentos (média + SE) contendo extratos brutos da esponjas em concentrações naturais, relatada primeiramente em 1995 por Pawlik 12 peixes consumidos todos os 10 grânulos de controlo em todos os casos. Após nome de cada espécie, o número de amostras em replicado é especificado (cada réplica da extracção separada de uma amostra geograficamente distintas do tecido da esponja). Para qualquer ensaio individual, extractos foram considerados dissuasor se o número de peletes consumido foi inferior ou igual a 6 (p = 0,057, teste modificado de exacto de Fisher), como indicado pela linha a tracejado no gráfico.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.