Name: A Laboratory Bioassay alimentando-Fish para avaliar a actividade anti-predação de metabolitos secundários a partir de tecidos de organismos marinhos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: Aprenda a realizar bioensaios de alimentação para avaliar a atividade anti-predação de metabolitos secundários em tecidos de organismos marinhos. Este método utiliza peixes predadores modelo e matriz alimentar nutricionalmente comparável.

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Agradecemos a James Maeda e Aaron Cooke pela ajuda nas filmagens e edição deste vídeo. O financiamento foi fornecido pela National Science Foundation (OCE-0550468, 1029515).

NOTA: Passo 3 do presente protocolo envolve indivíduos animais vertebrados. O procedimento foi concebido de modo que os animais recebam o tratamento mais humano possível e foi aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade de North Carolina Wilmington. 1) extracção de tecidos <ol><li> Use tecido que está em seu estado natural de hidratação e não apertou, seca-out ou excessivamente úmido, pois isso irá alterar a concentração volumétrica de metabólitos secundários. Cortar ou cortar tecido para peças ou fatias que podem ser inseridos dentro de um tubo de centrífuga de 50 ml. Nota: O tecido fresco pode ser utilizado em alguns casos, mas muitas vezes é melhor cortar ou cortar tecido congelado, que não está sujeita a apertar, quando o corte. </li><li> Adicionar porções de tecido a 30 ml de uma mistura 1: 1 de diclorometano (DCM) e metanol (MeOH) em um tubo de centrífuga graduado até um volume final de 40 ml foi atingido. Certifique-se de realizar todas as etapas que envolvem a transferência desolvente em um exaustor com ventilação adequada. </li><li> Tapar o tubo e invertê-lo várias vezes, em seguida, agitar repetidamente durante um período de 4 horas de extracção. Nota: Durante este período, a água combina com o MeOH e o MeOH resultante: fase aquosa separa-se a fase de DCM. O tecido é exposto alternadamente a DCM e MeOH: água como uma emulsão como os tubos são agitados. </li><li> Transferir o extracto de DCM para um balão de fundo redondo e evapora-se até à secura num evaporador rotativo usando-se o calor baixo (&lt;40 ° C). Usando solvente mínima, transferir o extracto seco a um frasco de cintilação de 20 ml. Montar o frasco com um adaptador evaporador rotativo e evapora-se novamente até à secura num evaporador rotativo usando-se o calor baixo (&lt;40 ° C). Nota: O próximo passo requer o uso de um instrumento de compressão caseiro que pode ser montado por aparafusamento os seguintes artigos em ordem sequencial na extremidade de uma haste roscada (1) da porca (2), louça, e (3) da porca de bolota. A máquina de lavar ou deve ser perfurado oumontado de modo que seja menor que o diâmetro interno de um tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Voltando para o tubo de centrífuga graduado que contém o tecido e o MeOH: extracto de água, espremer o meio de extracção para fora do tecido por meio de compressão. Transferir o MeOH: extracto de água ao mesmo balão de fundo redondo e armazenar refrigeradas (&lt;10 ° C). </li><li> Adicionar MeOH para o tubo de centrífuga graduado até que o tecido já desidratado está submerso para uma segunda extracção de 2 a 6 horas de duração, em seguida, transferir o extrato MeOH novo para o balão de fundo redondo arrefecido contendo o MeOH: extracto de água. Se houver alguma preocupação de que o tecido não tem sido totalmente extraída, repetir a 2 a 6 horas de extracção de MeOH. </li><li> Seque o MeOH num evaporador rotativo usando-se o calor baixo (&lt;40 ° C). Transferir o extracto aquoso remanescente a partir do balão de fundo redondo para o frasco de cintilação contendo o extracto não polar seco, usando um volume mínimo de MeOH para lavar o frasco de fundo redondo. </li><li> Evaporate o extracto aquoso até à secura utilizando calor baixo (&lt;40 ° C) num concentrador de vácuo. O frasco de cintilação agora contém o extracto em bruto seco orgânico total de 10 ml de tecido. Evacuar o espaço superior do frasco com gás N2 para evitar a oxidação, feche bem e armazenar congelados (-20 ° C). </li></ol> 2) Preparação de Alimentos <ol><li> Prepare pó liofilizado manto squid. Nota: manto Squid fornece uma fonte de alimentação que é comparável à de outros invertebrados bentônicos, e irá ser utilizada como um ingrediente nos sub-passos de 2,2. <ol><li> Anéis congelados descongelamento do manto squid em deionizada quente (DI) de água, em seguida, purê-los em um misturador de alta velocidade. </li><li> Verter uma fina camada de manto puré lulas em uma assadeira rasa e congelamento (-20 ° C), em seguida, romper a folha de puré lulas congeladas em pequenos pedaços para ser liofilizada. </li><li> Liofiliza os congelados purê manto lula seguindo os procedimentos operacionais da freeze de cabelo. </li><li> Pulverizar as peças liofilizadas de lula purê manto em um liquidificador de alta velocidade para formar um pó. </li><li> Em um exaustor, despeje o manto squid em pó em uma peneira rotativa e peneire a farinha para separar grandes pedaços de tecido a partir do pó fino. </li><li> Transfira a multa manto squid em pó para um recipiente lacrado. Evacuar o espaço de cabeça do recipiente com gás N2 para evitar a oxidação e armazenar congelada (-20 ° C). </li></ol></li><li> Preparar a mistura de alimentos. Nota: Quando executando vários ensaios consecutivos, é prático para preparar ~ 100 ml de mistura de alimentos, no entanto esta receita pode ser dimensionada para volumes menores, se necessário. <ol><li> Combinar uma mistura de 3 g de ácido algínico e 5 g de pó liofilizado manto lulas com 100 ml de água desionizada numa proveta de 150 ml. Agita-se vigorosamente com um microspatula durante alguns minutos até que o pó é completamente hidratada e a mistura é homogénea. NOTA: Se desejar, corante alimentar pode ser adicionado neste step: ele é mais fácil de adicionar à mistura de corante alimentar que vai gerar as duas misturas de controlo e tratados (mascarar o pigmento natural do extracto na mistura tratados com extracto) em vez de tentar fazer corresponder a cor da mistura tratada por adição de extracto tingir para a mistura de controlo. Uma cor esverdeada ou acastanhada alimentos é muitas vezes desejável para mascarar quaisquer pigmentos no extracto em bruto. </li><li> Coloque exactamente 10 ml da mistura de alimentos para uma seringa graduada. Tome cuidado para evitar a inclusão de bolhas de ar durante este processo. </li><li> Retirar o frasco de cintilação de 20 ml com extracto orgânico bruto seco do congelador. Adicionar uma ou duas gotas de MeOH, em seguida, misture o extrato em uma mistura homogênea com um microspatula. </li><li> Ejectar o carregado seringa de 10 ml de matriz de alimentos para o frasco de cintilação de 20 ml e agita-se com uma microspatula para homogeneizar a mistura de alimentos tratados com extracto. Nota: Pode ajudar a ejetar a seringa em incrementos menores (ou seja, ejetar 2 ml e homogeneizar, em seguida, r.epita até que todos os 10 ml foram homogeneizados). </li></ol></li><li> Prepare os grânulos de ensaio. <ol><li> Carregar um volume muito pequeno da mistura de extracto (~ 1 ml) com uma seringa, e submergir a ponta da seringa em uma solução de 0,25 M de CaCl2. Injectar o conteúdo da seringa para formar uma longa, cadeia espaguete semelhante. </li><li> Depois de alguns minutos, retire o fio endurecido, cortá-la em 4 mm de comprimento pelotas em uma placa de corte de vidro com uma lâmina de barbear, e depois enxaguar em água do mar. </li><li> Repita os passos 2.3.1 e 2.3.2 sem incluindo o extrato de tecido para fazer pelotas de controle. Certifique-se para tratar a pellets de controlo com um volume equivalente de solvente (ver adição de MeOH a mistura tratada no passo 2.2.3) para controlar a adição de solvente. Se um controlo negativo é desejado para confirmar que os peixes ensaio pode ser impedido de alimentação, adicionar benzoato de denatónio, a uma concentração de 2 mg ml-1 para a mistura de alimentos crus 27. </li></ol></li></ol> 3) A palatabilidadeBioensaios <ol><li> Realizar ensaios de alimentação com amarelo-fase Wrasse bluehead selvagens capturados, Thalassoma bifasciatum, mantidos em grupos de três em compartimentos opaco face de aquários laboratório. </li><li> Entregar pelotas de alimentos a partir de um copo de água do mar com uma pipeta de vidro com um bulbo de borracha. Nota: Pode demorar alguns dias para treinar peixes para receber o alimento desta forma. Um estímulo condicionado (por exemplo, alguns toques da pipeta no vidro do aquário) que precede a entrega de alimentos pode ser útil para treinar o peixe que esperar a adição de grãos de ração. </li><li> Pontuação peletes. Considere-se uma pelete aceite se prontamente consumida pelos peixes. Considere um pellet rejeitado se não comido depois de um mínimo de três tentativas por parte de um ou mais peixes para levá-la em sua cavidade bucal, ou se o pellet é abordado e ignorado após uma tentativa nesse sentido. </li><li> Amostras de pontuação. Nota: O procedimento de ensaio é descrito como um fluxograma na Figura 1, grupos de peixe que se recusam a comer.pelotas de controle em qualquer etapa do protocolo não são considerados ainda mais. Há dois resultados potenciais de uma única execução do ensaio: a amostra é aceitos ou rejeitados. <ol><li> Comece com uma bolinha de controle para confirmar que o grupo de peixes é cooperativa. Oferecer um pellet tratada. Se os peixes aceitar o pellet tratada, marcar a amostra que foi aceite. Se os peixes rejeitar o sedimento tratado, oferecer uma pelete de controlo subsequente para determinar se os peixes tenham cessado de alimentação. Se os peixes aceitar o pellet controle posterior, marcar a amostra como rejeitada. </li></ol></li><li> Replication. Repita o procedimento de ensaio com dez grupos independentes de peixe para cada extrato. </li></ol> 4) Importância Avaliando <ol><li> Avaliar a significância das diferenças no consumo de controle vs pelotas tratados com uma versão modificada do teste exato de Fisher 26. Modificar o teste para que os totais marginais para o controle e pelotas tratados são fixos, Tratando-os como duas amostras aleatórias. Nota: Este fornece p = 0,057 quando 7 pelotas são consumidos; Assim, qualquer extracto é considerada impedimento se 6 ou menos pelotas são comidos, e saboroso se 7 ou mais pelotas são comidos. </li><li> Para comparar a palatabilidade relativa entre os grupos de extractos, calcular um número significativo de peletes consumidos dentro de cada grupo. Manter o limiar a 6 peletes assim um grupo de extractos replicados são considerados dissuasor se o número médio de peletes consumidos + erro padrão (SE) ≤6. Nota: Nos resultados representativos, o trabalho de grupo é espécie, assim replicar extratos provenientes de indivíduos distintos e a palatabilidade relativa pode ser comparada entre as espécies. </li></ol>

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<li>Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antifeedant+triterpene+glycosides+from+the+Caribbean+sponge+Erylus+Formosus%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Letters%22%5BJournal%5D)">New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus.</a> Natural Product Letters. 15 (4), 275-285 (2001).</li>
<li>Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+the+odor+from+sponges+of+the+genus+Ircinia+protect+them+from+fish+predators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators.</a> Journal of Chemical Ecology. 28 (6), 1103-1115 (2002).</li>
<li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defenses+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+I.+Assays+with+hermit+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).</li>
<li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+II.+Assays+with+sea+stars%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).</li>
<li>Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-predatory+defenses+of+Red+Sea+and+Caribbean+sponges.+I.+Chemical+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense.</a> Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).</li>
<li>Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+for+defensive+synergy+in+Caribbean+sponges%3A+Bad+taste+or+glass+spicules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322 (1), 67(2005).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O procedimento aqui descrito fornece um protocolo laboratorial relativamente simples, ecologicamente relevantes para a avaliação defesas químicas anti-predação em organismos marinhos. Aqui vamos rever os critérios importantes que sejam satisfeitas por este conjunto de métodos: (1) A condição de predador. Este ensaio alimentação emprega o bodião bluehead, Thalassoma bifasciatum, um dos peixes mais abundantes nos recifes de coral em todo o Caribe. O bluehead é um carnívoro ge...

Ecologia química desenvolvido com a colaboração de químicos e ecologistas. Embora a especialidade da ecologia química terrestre tem sido em torno de algum tempo, o de ecologia química marinha é apenas algumas décadas de idade, mas tem fornecido importantes contribuições para a ecologia e comunidade estrutura evolutiva dos organismos marinhos 1-8. Aproveitando-se das tecnologias emergentes de mergulho e espectroscopia de RMN, químicos orgânicos rapidamente gerou um grande número de publicações que descrevem novos metabolitos de invertebrados marinhos bentônicos e algas na década de 1970 e 1980 9. Supondo-se que metabólitos secundários devem servir para alguma coisa, muitas dessas publicações atribuídas propriedades ecologicamente importantes para novos compostos sem evidência empírica. Mais ou menos ao mesmo tempo, os ecologistas também foram aproveitando o advento do mergulho e descreve as distribuições e abundâncias de animais bentônicos e plantas já conhecidas frosou métodos de amostragem relativamente ineficazes, como a dragagem. A hipótese dos pesquisadores foi que nada sésseis e de corpo mole deve ser quimicamente defendidas para evitar o consumo por predadores 10. Em um esforço para introduzir o empirismo ao que foi o trabalho de outra forma descritiva em abundância das espécies, alguns ecologistas começaram extrapolando defesas químicas a partir de ensaios de toxicidade 11. A maioria dos ensaios de toxicidade envolveu a exposição dos peixes inteiros ou em outros organismos para suspensões aquosas de extratos brutos da tecidos de invertebrados, com posterior determinação das concentrações de massa seca de extratos responsáveis ​​por matar metade dos organismos de ensaio. No entanto, os ensaios de toxicidade não imitar a maneira pela qual os predadores potenciais percebem presas em condições naturais, e estudos posteriores não encontraram nenhuma relação entre a toxicidade e palatabilidade 12-13. É surpreendente que as publicações em revistas de prestígio utilizadas técnicas tendo pouca ou nenhuma ecological relevância 14-15 e, hoje, que esses estudos ainda são amplamente citado. Ele é ainda mais alarmante notar que estudos baseados em dados de toxicidade continuam a ser publicados 16-18. O método de bioensaio aqui descrito foi desenvolvido no final de 1980 para fornecer uma abordagem ecologicamente relevantes para os ecologistas marinhos químicos para avaliar as defesas químicas anti-predação. O método requer um modelo de predador para provar um extrato bruto do organismo alvo em uma concentração natural em uma matriz alimentar comparável nutricionalmente, fornecendo dados palatabilidade que são ecologicamente mais significativo do que os dados de toxicidade. A abordagem geral para a avaliação da actividade anti-predação dos tecidos dos organismos marinhos inclui quatro critérios importantes: (1) um predador generalista apropriado devem ser usadas em ensaios de alimentação, (2) de todos os metabolitos orgânicos polaridades deve ser exaustivamente extraído do tecido do organismo alvo, (3) os metabolitos deve be misturados em um alimento nutricionalmente adequada experimental com a mesma concentração volumétrica como encontrado no organismo a partir do qual foram extraídos, e (4) o desenho experimental e abordagem estatística deve fornecer uma métrica significativa para indicar distastefulness relativa. O procedimento descrito a seguir é projetado especificamente para avaliar as defesas químicas anti-predação de invertebrados marinhos do Caribe. Nós empregamos o bodião bluehead, Thalassoma bifasciatum, como um peixe predatório do modelo, porque esta espécie é comum em recifes de corais do Caribe e é conhecido por experimentar uma grande variedade de invertebrados bentônicos 19. De tecido do organismo alvo é extraído em primeiro lugar, em seguida, combinada com uma mistura alimentar, e finalmente oferecido para grupos de T. bifasciatum observar se eles rejeitam os alimentos tratados com extrato. Dados de ensaio usando este método forneceram importantes insights sobre a química defensiva de organismos marinhos 12,20-21, lhistória ife trade-offs 22-24 e 25-26 comunidade ecologia.

<table><tbody><tr><td>Diclorometano</td><td>Fisher Scientific</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A41220</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio Anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>Cryocool Fluido de Transferência de Calor</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-548-146</td><td>Para concentrador a vácuo</td></tr><tr><td>Sal de Sódio de Ácido Algínico Alta Viscosidade</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td>154723</tr><tr><td>Anéis de manto de lula</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pode ser comprado em supermercado</td></tr><tr><td>Benzoato de denatônio</td><td>Aldrich</td><td>D5765</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga graduado de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cintilação de 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpadas de borracha para pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpadas vermelhas para entrega de pellets</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-27</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de fundo redondo de 250 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-067E</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de frasco de cintilação para rotavap</td><td>Fisher Scientific</td><td>K747130-1324</td><td></td></tr><tr><td>Weightboats</td><td>Microespátula Fisher Scientific</td><td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td></td> Seringa graduada <td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr> 5 <tr><td>ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-53</td><td></td></tr><tr><td>Seringa graduada de 10 ml</td> Lâmina de barbear <td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S17302</td><td></td></tr></tbody></table>

a laboratory bioassay alimentando-fish para avaliar a actividade anti-predação de metabolitos secundários a partir de tecidos de organismos marinhos

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

A ecologia química marinha é uma disciplina jovem, tendo surgido da colaboração de químicos de produtos naturais e ecologistas marinhos na década de 1980 com o objetivo de examinar as funções ecológicas de metabólitos secundários dos tecidos de organismos marinhos. O resultado tem sido uma progressão de protocolos que refinaram cada vez mais a relevância ecológica da abordagem experimental. Aqui apresentamos a versão mais atualizada de um bioensaio de laboratório de alimentação de peixes que permite aos investigadores avaliar a atividade antipredatória de metabólitos secundários dos tecidos de organismos marinhos. Os metabolitos orgânicos de todas as polaridades são exaustivamente extraídos do tecido do organismo alvo e reconstituídos em concentrações naturais numa matriz alimentar nutricionalmente adequada. Pellets de alimentos experimentais são apresentados a um predador generalista em ensaios de alimentação em laboratório para avaliar a atividade antipredatória do extrato. O procedimento aqui descrito usa o bluehead, Thalassoma bifasciatum, para testar a palatabilidade de invertebrados marinhos do Caribe; no entanto, o design pode ser facilmente adaptado a outros sistemas. Os resultados obtidos usando este ensaio de laboratório são um prelúdio importante para experimentos de campo que dependem das respostas alimentares de um complemento completo de predadores potenciais. Além disso, este bioensaio pode ser usado para direcionar o isolamento de metabólitos dissuasores de alimentação por meio de fracionamento guiado por bioensaio. Este bioensaio de alimentação avançou nossa compreensão dos fatores que controlam a distribuição e abundância de invertebrados marinhos nos recifes de coral do Caribe e pode informar investigações em diversos campos de investigação, incluindo farmacologia, biotecnologia e ecologia evolutiva.

Aqui nós relatamos resultados deste ensaio biológico para seis espécies de esponjas do Caribe comuns (Figura 2). Estes dados foram inicialmente publicado em 1995 por Pawlik et al. 12 e demonstrar o poder dessa abordagem para examinar as diferenças de estratégias de defesa química entre taxa co-ocorrência. Os resultados foram relatados como uma média do número de peletes de alimento comido + erro padrão (SE) para cada espécie. Quase não há sedimentos foram consumidos em ensaios com ex...

Este bioassay emprega um modelo de peixes predadores para avaliar a presença de metabólitos alimentação-de dissuasão a partir de extratos orgânicos de tecidos de organismos marinhos em concentrações naturais utilizando uma matriz alimentar comparável nutricionalmente.

A Laboratory Bioassay alimentando-Fish para avaliar a actividade anti-predação de metabolitos secundários a partir de tecidos de organismos marinhos

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a atividade antipredatória de metabólitos secundários presentes nos tecidos de organismos marinhos. Olá, sou o Dr. Joseph Pollock, da Universidade da Carolina do Norte em Wilmington, e estou acompanhado pelo estudante de pós-graduação Michael Marty, que atuou como líder da equipe na elaboração deste vídeo sobre a realização de bioensaios para testar defesas químicas nos tecidos de organismos marinhos. Começamos a desenvolver os métodos que você está prestes a ver no final da década de 1980.Naquela época, os químicos de produtos naturais atribuíam funções ecológicas aos metabólitos secundários sem qualquer evidência experimental. Enquanto isso, os ecólogos extrapolavam funções defensivas a partir de ensaios de toxicidade que não tinham relevância ecológica. Aqui apresentamos uma abordagem projetada para avaliar a atividade anti-predatória dos metabólitos secundários presentes nos tecidos de organismos marinhos.Essa abordagem satisfaz quatro critérios importantes para bioensaios alimentares. Primeiro, utilizamos um predador generalista apropriado. Segundo, extraímos exaustivamente os metabólitos orgânicos de todas as polaridades a partir dos tecidos.Três, colocamos esses metabólitos em um alimento experimental na mesma concentração volumétrica encontrada no organismo. E quatro, o nosso delineamento experimental e abordagem estatística fornecem uma métrica significativa para indicar o grau relativo de palatabilidade. Nestes experimentos alimentares, utilizamos o peixe predador *Thalassoma bifasciatum* (Bloch, 1791), um modelo apropriado para ensaios que utilizam tecidos de invertebrados marinhos do Caribe, pois esta espécie é comum nos recifes de coral do Caribe e sabe-se que consome uma grande variedade de invertebrados bentônicos.Agora Michael descreverá o protocolo em detalhes. Primeiro, o tecido deve ser extraído. Adicione uma mistura um para um de dicloreto, metano e metanol a um tubo de centrífuga graduado até um volume final de 30 mililitros.Em seguida, corte fragmentos de tecido do seu organismo-alvo. Isso pode ser feito com tecido fresco ou congelado. Trabalhamos com esponjas, portanto esta demonstração em vídeo apresentará a esponja-orelha-de-elefante-laranja, *Agelas clathrodes*.Pode ser necessário cortar pedaços muito pequenos de tecido para obter o volume correto. Usando o deslocamento volumétrico, é possível extrair exatamente 10 mililitros de tecido, tampar o tubo e invertê-lo, depois agitar por quatro horas; durante esse período, a água se combina com o metanol e a fase resultante de metanol e água se separa da fase de diclorometano. O tecido é exposto alternadamente a cada meio de extração conforme os tubos são agitados.Após este período de extração, duas fases distintas estarão aparentes. A fase polar de metanol e água ficará acima da fase não polar de clorometano, utilizando uma pipeta de passagem para transferência. Transfira o extrato de diclorometano do tubo de centrífuga graduado para um balão de fundo redondo; o tubo de centrífuga graduado deve ser armazenado na geladeira.Para os próximos passos, fixe o balão de fundo redondo a um evaporador rotativo para todas as etapas no evaporador rotativo. Certifique-se de que a temperatura do banho-maria permaneça abaixo de 40 graus Celsius. Seguindo os procedimentos básicos de operação do evaporador rotativo, seque o diclorometano no balão de fundo redondo e reconstitua o extrato não polar seco utilizando uma quantidade muito pequena de diclorometano.Alguma agitação ou movimento de rotação pode ser útil para remover o material seco das paredes do frasco de fundo redondo. Em seguida, transfira o extrato de clorometano do frasco de fundo redondo para um frasco cintilador de 20 mililitros. Em vez de colocar a tampa no frasco cintilador, acople um adaptador de evaporador rotativo ao frasco cintilador e, novamente, evapore até secagem em um evaporador rotativo. O frasco cintilador com o extrato não polar seco pode ser armazenado na geladeira durante os próximos passos.Retornando ao tubo de centrífuga graduado que contém o tecido e o extrato de metanol-água, utilizaremos um instrumento caseiro que comprime o tecido para extrair o meio de extração por compressão. Em seguida, transfira o extrato de metanol-água para o balão de fundo redondo e armazene resfriado na geladeira. Adicione metanol ao tubo de centrífuga graduado até que o tecido fique submerso, para uma segunda extração com duração de duas a seis horas.Após a conclusão da segunda extração com metanol, retire o frasco de fundo redondo resfriado da geladeira, comprima o conteúdo do tubo cônico graduado e transfira esse novo extrato de metanol para o frasco de fundo redondo original, que contém o extrato aquoso de metanol obtido anteriormente. Neste ponto, caso haja alguma preocupação de que o tecido não tenha sido completamente extraído, o passo de extração com metanol por duas a seis horas pode ser repetido. Acople o frasco de fundo redondo a um evaporador rotativo e evapore o metanol como antes.Lembre-se de manter a temperatura do banho-maria abaixo de 40 graus Celsius. O frasco de fundo redondo conterá um extrato aquoso que deve ser combinado com o extrato não polar seco no frasco cintilador de 20 mililitros. Portanto, transfira o conteúdo do frasco de fundo redondo para o frasco cintilador de 20 mililitros.Se necessário, enxágue o balão de fundo redondo com uma pequena quantidade de metanol para recolher todo o extrato remanescente. O frasco cintilador agora contém o extrato não polar seco e o extrato polar. No entanto, o extrato polar está suspenso em um pequeno volume de líquido.Usando um concentrador a vácuo com calor baixo, evapore o extrato aquoso até secagem. O frasco para cintilação agora contém um extrato orgânico bruto seco de 10 mililitros de tecido; seque o frasco com gás nitrogênio e armazene no congelador a 20 graus Celsius negativos. Para testar a palatabilidade desses extratos de tecido, eles devem primeiro ser reconstituídos em uma matriz alimentar nutricionalmente comparável ao organismo-alvo.Anéis de manto de lula são uma fonte proteica adequada para bioensaios de tecidos de invertebrados e podem ser facilmente preparados na forma de um pó liofilizado. Para iniciar este bioensaio, coloque anéis congelados de manto de lula em água desionizada morna. Após descongelar, despreze parte da água e despeje os anéis em um liquidificador.Misture bem em velocidade alta até que o manto do lula se torne um líquido viscoso. Adicione Água se o material estiver muito espesso para misturar. Despeje uma camada fina de manto de lula liquefeito sobre uma assadeira rasa e espalhe uniformemente.Coloque a assadeira em um congelador a menos 20 graus Celsius. A lâmina de lula congelada deve ser quebrada em pedaços menores para facilitar o processo de liofilização. Pedacinhos menores são melhores porque secarão mais rapidamente.No liofilizador. Coloque os pedaços quebrados de lula congelada na câmara e siga os procedimentos operacionais do liofilizador. Uma vez liofilizados, os pedaços de lula devem ser pulverizados.Isso pode ser realizado com um liquidificador. Coloque os pedaços secos de lula no liquidificador e processe em velocidade alta até que o material pareça um Pó uniforme. O próximo passo deve ser realizado em uma capela de exaustão para reduzir a inalação de poeira particulada de lula.Despeje o pó de lula liofilizado em um peneirador rotativo. Segure um recipiente abaixo do peneirador para coletar o pó que passa pela peneira. Gire a manivela para peneirar o material de lula liofilizado.Fios grossos de tecido conjuntivo que não foram adequadamente homogeneizados nas etapas anteriores serão retidos no peneiro, resultando em um pó mais fino; se necessário, utilize um funil para transferir o pó de lula liofilizado para um recipiente vedável, purgue com gás nitrogênio e armazene congelado a menos 20 graus Celsius. Após preparar o pó liofilizado da manta da lula, estamos agora prontos para preparar um lote da mistura alimentar para o ensaio. Ao realizar múltiplos ensaios consecutivos no mesmo dia, é prático preparar um lote maior da mistura alimentar.Aqui demonstramos o processo de preparação de uma mistura com volume de 100 mililitros, utilizando um barquinho de polietileno limpo para pesar três gramas de ácido algínico e cinco gramas de pó de manto de lula liofilizado. Coloque esses ingredientes secos em um béquer de 150 mililitros antes de adicionar água. Agite suavemente os ingredientes secos com uma espátula micro para ajudar a misturá-los.Adicione 100 mililitros de água desionizada e agite vigorosamente. Pode levar alguns minutos para hidratar completamente o pó. Certifique-se de obter uma mistura homogênea antes de prosseguir para a próxima etapa.Se optar por colorir a matriz alimentar com uma cor uniforme, adicione o corante nesta etapa. Encha uma seringa graduada com exatamente 10 mililitros da mistura alimentar. Nesta etapa, a precisão volumétrica é fundamental, portanto, tenha extremo cuidado para evitar a inclusão de bolhas de ar.Retire o frasco de 20 mililitros com extrato orgânico bruto seco do congelador e adicione uma ou duas gotas de metanol. Não adicione muito metanol. Isso impedirá que a matriz alimentar solidifique.Usando uma espátula microscópica e o mínimo de solvente, reconstitua o extrato em uma mistura homogênea. Certifique-se de raspar as paredes do frasco para garantir que todo o extrato seja reconstituído. Ejecte a seringa com 10 mililitros da matriz alimentar no frasco de cintilação de 20 mililitros contendo o extrato homogeneizado reconstituído.Agite esta mistura com a espátula micro até ficar homogênea. Carregue um volume muito pequeno da mistura extrata. Um mililitro é suficiente em uma seringa.Mergulhe a ponta da seringa em uma solução de cloreto de cálcio 0,25 molar e ejete o conteúdo da seringa para formar um longo filamento semelhante a um espaguete. O filamento endurecerá nesta solução. Após alguns minutos, remova o filamento endurecido e coloque-o sobre uma tábua de corte de vidro.Use uma lâmina de barbear para cortar o filamento em pelotas de quatro milímetros de comprimento. Colete as pelotas tratadas com o extrato e lave-as em água do mar. Para preparar as pelotas controle.Siga este mesmo procedimento sem a adição de qualquer extrato tecidual. Pode ser necessário adicionar corante alimentar para igualar a cor dos pellets controle e tratados. Para preparar um controle negativo que os peixes certamente recusarão consumir.Adicione deton e pó de benzoato à mistura de alimento cru numa concentração de dois miligramas por mililitro, conforme descrito por Miller e Pollock, 2013. Os ensaios alimentares são realizados com peixes Thalassoma bifasciatum na fase amarela capturados na natureza, mantidos em grupos de três em compartimentos opacos de aquários de laboratório. Um utensílio apropriado para a entrega de pellets de alimento é uma pipeta de vidro com uma bolsa de borracha.Um pellet é considerado aceito se for prontamente consumido pelo peixe. Um pellet é considerado rejeitado se não for ingerido após um mínimo de três tentativas de um ou mais peixes de levá-lo à cavidade bucal. Ou se o pellet for abordado e ignorado após uma única tentativa desse tipo.Grupos não cooperativos de peixes que se recusam a ingerir pelotas controle não devem ser considerados nos ensaios. Este fluxograma demonstra que o procedimento do ensaio, em todos os casos, começa com uma pelota controle para confirmar que o grupo de peixes está cooperativo. Ofereça uma pelota tratada.Se os peixes aceitarem o pellet tratado, essa amostra é classificada como aceita. Se os peixes rejeitarem o pellet tratado, deve-se oferecer um controle subsequente para confirmar se os peixes cessaram a alimentação. Se os peixes aceitarem o pellet controle subsequente, a amostra é classificada como rejeitada.Cada amostra deve ser realizada com 10 grupos independentes de peixes. A seguir, um exemplo de execução deste ensaio de alimentação. Primeiro, uma pastilha controle é oferecida e os peixes aceitam a pastilha controle.Em segundo lugar, é oferecido um peloto tratado. Nesse caso, os peixes rejeitam o peloto tratado. Portanto, um peloto controle subsequente deve ser oferecido.Os peixes aceitam o controle subsequente e a amostra pode ser classificada como rejeitada. Cada amostra deve ser realizada com 10 grupos independentes de peixes. A significância das diferenças no consumo de pelotas controle versus tratadas deve ser avaliada com uma versão modificada do teste exato de Fisher conforme apresentado por Low e Pollock 2014.O teste é modificado de modo que os totais marginais para as pelotas controle e tratadas sejam fixos, tratando ambos como amostras aleatórias. Isso fornece um valor P igual a 0,057 quando sete pelotas são ingeridas. Portanto, qualquer extrato é considerado desestimulante se seis ou menos pelotas forem ingeridas e palatável.Se sete ou mais comprimidos forem ingeridos. Ao comparar a palatabilidade entre grupos de extratos, o número médio de comprimidos ingeridos deve ser utilizado, conforme será mostrado nos resultados representativos. Aqui relatamos os resultados deste bioensaio para seis espécies comuns de esponjas do Caribe.Esses dados foram inicialmente publicados por Pollock et al. 1995 e demonstram o poder dessa abordagem para elucidar diferenças nas estratégias de defesa química entre táxons coexistentes. Cada categoria no eixo Y representa extratos de uma única espécie de esponja. Vários indivíduos de cada espécie foram amostrados, extraídos e testados, indicados pelo número entre parênteses após o nome da espécie.Os resultados são apresentados como número médio de pelotas de alimento ingeridas, mais o erro padrão para cada espécie. Quase nenhuma pelota foi ingerida nos ensaios com extrato orgânico bruto de alus, pleth, pheon, compressor e lycine denominada foris. Em contraste, pelotas feitas com extrato de Cali esponjoso de Vais.Geo Osa e Michel lavis foram prontamente consumidos no ensaio. Menos de seis pelotas foram ingeridas para as três primeiras espécies, de modo que podem ser consideradas significativamente desestimulantes. Em contraste, as três espécies seguintes não diferiram significativamente dos controles e podem ser consideradas palatáveis.Os métodos aqui demonstrados oferecem uma abordagem poderosa para estudar defesas químicas contra predadores em conjunto com experimentos manipulativos em campo e levantamentos. Os resultados desses bioensaios ajudaram meu grupo de pesquisa a compreender os fatores que controlam a distribuição e a abundância de invertebrados marinhos nos recifes de corais do Caribe. De forma importante, este método atende à necessidade de relevância ecológica na ecologia química para além da própria ecologia química.Os resultados desses bioensaios podem orientar investigações em diversas áreas de pesquisa, incluindo farmacologia, biotecnologia e ecologia evolutiva.

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JoVE Journal

Environment

Ambiente

AVEXIS é uma alta taxa de ensaio interação proteína desenvolvida para a tela de forma sistemática para novas extracelular do receptor-ligante pares envolvidos em processos de reconhecimento celular. Ele é projetado especificamente para detectar interações protéicas transitórios que são difíceis de identificar com outras abordagens de alto rendimento.

Avidez baseado Triagem Interação Extracelular (AVEXIS) para a detecção escalável de baixa afinidade Extracelular receptor-ligante Interações

Uma técnica para estimativa de laboratório da rede trófica eficiência de transferência de bifenil policlorados (PCB) congêneres de peixes piscívoros de suas presas é apresentado. Para maximizar a aplicabilidade dos resultados do laboratório para o campo, o piscívoro deve ser alimentado presa peixe que são tipicamente consumidos no campo.

Estimativa Laboratório de Líquido tróficas eficiências de transferência de PCB para Lake Trout (<em&gt; Salvelinus namaycush</em&gt;) De sua rapina

Este trabalho descreve um novo protocolo para avaliar a ecotoxicidade de poluentes, incluindo contaminantes emergentes como nanomateriais, utilizando a bactéria marinha Vibrio anguillarum . Este método permite a determinação da CL 50 , ou mortalidade, da concentração que provoca uma diminuição de 50% na cultura das bactérias, após uma exposição de 6 horas.

Método Ecotoxicológico com Bactérias Marinhas<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt; Avaliar a Toxicidade Aguda dos Contaminantes Ambientais

Aqui, apresentamos um protocolo para examinar larval zebrafish e cabeção peixinho locomotoras atividades e respostas photomotor (PMR), usando um software de rastreamento automatizado. Quando incorporado em comum os bioensaios de toxicologia, análises destes comportamentos fornecem uma ferramenta de diagnóstico para examinar a bioatividade química. Este protocolo é descrito usando a cafeína, um modelo neurostimulant.

Protocolo experimental pela análise de perfis de resposta comportamental em peixes Larval: aplicação para a Neuro-estimulantes cafeína

A saúde dos peixes selvagens pode ser usada como um indicador da saúde do ecossistema aquático. Avaliações de saúde baseados em necropsia peixe fornecem documentação de lesões ou anormalidades, dados utilizados para calcular os índices de condição, bem como a oportunidade de recolher os tecidos para avaliação microscópica, expressão gênica e outros mais aprofundada análises.

Avaliação de saúde de peixes selvagens baseada em necropsia

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e caracterizar a estrutura, potência olfativa e resposta comportamental de compostos putativos feromônio de lampreias do mar.

A identificação das feromonas de lampreia do mar usando guiada por bioensaio fracionamento

Aqui, descrevemos um protocolo para obter extrato de veneno bruto da anêmona do mar e detectar sua atividade hemolítica e fosfolipase.

Identificação da Atividade Hemolítica e Fosfolipase em Extratos Brutos de Anêmonas do Mar por Bioensaões Simples

Este trabalho tem como objetivo avaliar e revisar o procedimento de bioensaio de letalidade de Artemia salina , também identificado como ensaio de letalidade de camarão em salmoura. Este método simples e barato fornece informações sobre a toxicidade geral (considerada como uma avaliação preliminar de toxicidade) das amostras, ou seja, produtos naturais.

Bioensaio de Letalidade Utilizando Artemia salina L.

Aqui, apresentamos uma bateria de teste comportamental abrangente, incluindo o novo tanque, Shoaling e testes de preferência social, para determinar efetivamente os potenciais efeitos neurotóxicos de produtos químicos (por exemplo, metanfetamina e glifosato) em peixes-zebra adultos usando um único tanque. Este método é relevante para neurotoxicidade e pesquisa ambiental.

Avaliação da Neurotoxicidade em Danio rerio Adulto utilizando uma Bateria de Testes Comportamentais em um Único Tanque

Descrevemos o fluxo de trabalho e a análise de dados de um sistema de triagem para avaliar a toxicidade de compostos químicos com base na resposta de sobressalto de vibração de embriões de peixe-zebra. O sistema registra os movimentos de embriões de peixe-zebra após exposição a um estímulo vibratório e permite uma avaliação integrada da toxicidade/letalidade geral e toxicidade neuromuscular.

Avaliando a toxicidade de produtos químicos usando um sistema de triagem de resposta de sobressalto de vibração de peixe-zebra

O artigo propõe um novo método in vitro para a avaliação rápida e sensível da toxicidade e ecotoxicidade de poluentes, baseado na motilidade dos hemócitos de Mytilus galloprovincialis . O método visa contribuir para o desenvolvimento de testes de exposição toxicológica e ecotoxicológica mais éticos e sensíveis.

Um ensaio toxicológico e ecotoxicológico baseado na motilidade dos hemócitos do mexilhão (Mytilus galloprovincialis)

Aprenda a realizar bioensaios de alimentação para avaliar a atividade anti-predação de metabolitos secundários em tecidos de organismos marinhos. Este método utiliza peixes predadores modelo e matriz alimentar nutricionalmente comparável.

A Laboratory Bioassay alimentando-Fish para avaliar a actividade anti-predação de metabolitos secundários a partir de tecidos de organismos marinhos (Vídeo) | JoVE Journal

A Laboratory Bioassay alimentando-Fish para avaliar a actividade anti-predação de metabolitos secundários a partir de tecidos de organismos marinhos

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