Um protocolo é fornecido para usar um labirinto de campo aberto para acessar a atividade locomotora geral, ansiedade e emocionalidade em um modelo de camundongo de laboratório.
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Artigo de método
A utilização do campo aberto Maze medir Locomotor e Ansiedade-like Comportamento no Mice
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os modelos animais provaram ser inestimáveis para os pesquisadores que tentam responder a perguntas sobre os mecanismos do comportamento. O Open Field Maze é uma das plataformas mais utilizadas para medir comportamentos em modelos animais. É um teste rápido e relativamente fácil que fornece uma variedade de informações comportamentais que vão desde a capacidade ambulatorial geral até dados sobre a emocionalidade do animal em questão. No que se refere a modelos de roedores, o procedimento permite o estudo de diferentes cepas de camundongos ou ratos, criados em laboratório e capturados na natureza. A técnica também se presta prontamente à investigação de diferentes compostos farmacológicos para efeitos ansiolíticos ou ansiogênicos. Aqui, um protocolo para uso do labirinto de campo aberto para descrever comportamentos de camundongos é detalhado e uma análise simples da capacidade locomotora geral e comportamentos emocionais relacionados à ansiedade entre duas cepas de camundongos C57BL / 6 é realizada. Resumidamente, usando o protocolo descrito, mostramos que os camundongos do tipo selvagem exibiram significativamente menos comportamentos relacionados à ansiedade do que os camundongos Knock Out da mesma idade, enquanto ambas as cepas exibiram capacidade ambulatorial semelhante.
Introdução
O Open Field Maze (OFM) foi inicialmente desenvolvido em 1934 como um teste para medir a emocionalidade em roedores1. Atingiu o status de uma das medidas de comportamento mais utilizadas na psicologia animal2. Ele fornece uma avaliação fácil e bastante rápida de comportamentos bem definidos que não requerem treinamento para o sujeito do teste e pouco ou nenhum treinamento especializado para o ser humano que administra o teste. Esses atributos levaram ao uso generalizado do labirinto de campo aberto em pesquisas estendidas a outras espécies animais, como bezerros, porcos, coelhos, primatas, abelhas e lagostas3. Parte de sua popularidade decorre do fato de que os conceitos psicológicos e fisiológicos subjacentes aos testes são geralmente diretos e bem compreendidos. Por exemplo, foi postulado que as forças evolutivas selecionaram uma resposta comum em animais, de modo que a maioria das espécies exibe respostas de medo ou fuga mediadas pela ansiedade a estímulos específicos. Os roedores, por exemplo, mostram aversões distintas a ambientes grandes, bem iluminados, abertos e desconhecidos4. Podemos supor que eles foram filogeneticamente condicionados a ver esses tipos de ambientes como perigosos. Todos esses recursos são incorporados ao labirinto de campo aberto e formam a base de seu uso em testes de paradigma comportamental.
Um labirinto de campo aberto consiste em uma área fechada por paredes com altura suficiente para evitar que o sujeito escape. As formas típicas do labirinto são circulares ou quadradas com uma área grande o suficiente, com base no tamanho do assunto testado, para provocar uma sensação de abertura no centro do labirinto. Várias variáveis podem ser pontuadas no labirinto de campo aberto, com a maioria dos parâmetros envolvendo diferentes tipos de atividade motora2. A deambulação é o comportamento mais comum estudado, mas outros, como latência ou elevação, também podem ser medidos. Na maioria das vezes, o comportamento dos roedores é analisado em um labirinto nu. No entanto, a adição de objetos, um ou muitos ao chão do labirinto, adiciona a capacidade de ver como o sujeito interage com novos estímulos adicionais2. Os parâmetros relevantes quando os objetos são apresentados são normalmente o número de abordagens a um objeto ou, em alguns casos, preferência ou aversão por um objeto em detrimento de outro.
Muitos testes comportamentais de ansiedade são baseados na atividade corporal e locomoção do animal em questão5. A interpretação de testes comportamentais para emotividade enquanto separa fatores de confusão não emocionais, como a atividade motora, tem sido objeto de intenso debate6,7. Como o OFM foi originalmente descrito, duas medidas de emocionalidade podem ser deduzidas, atividade locomotora e depósitos de bolos fecais ou defecação1. No entanto, essas duas medidas demonstraram em alguns estudos não estarem relacionadas, apoiando a conclusão de que a emocionalidade em roedores é multidimensional5. Independentemente disso, discrepâncias na literatura em relação a essas medidas e emocionalidade ou ansiedade em modelos de camundongos podem ser atribuídas a diferenças nos critérios de análise ou diferenças nos procedimentos de teste. Estudos vincularam conclusivamente os resultados da análise OFM com outras medidas de ansiedade ao comparar modelos de camundongos8.
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Protocolo
NOTA: Todos os procedimentos aqui realizados foram submetidos e aprovados pelo IACUC (Office of Compliance Research) e foram realizadas seguindo as diretrizes do NIH. Ratos usado no paradigma testes comportamentais eram ingênuas e não utilizados para outros testes. O C57BL / 6 selvagem Tipo e bater para fora ratos utilizados no presente protocolo têm sido descritos anteriormente 9 e os dados aqui apresentados são de que manuscrito.
1. Preparação da sala de teste e campo aberto Apparatus
- Usar um campo aberto labirinto unidade múltipla (OFM) que consiste em quatro câmaras de actividade foi usado para esta análise (Figura 1). Cada câmara medido 50 cm (comprimento) x 50 cm (largura) x 38 cm (altura) e foi feita a partir de alta densidade branco e plástico não-porosa.
- Textura os andares do labirinto para a tração durante a deambulação, enquanto as paredes do labirinto eram lisas. Maze quadrantes foram completamente vazio para o objectivo do presente ensaio. Tendo em consideração o resto deste protocol, um único quadrante do labirinto acima descrito, irá ser utilizada para demonstrar a OFM.
- Limpe a câmara com um 95% de etanol antes do uso e antes dos testes subsequentes para remover quaisquer indícios de cheiro deixados pelo mouse assunto anterior.
- Permitir que o etanol se evaporar completamente antes de testar ratinhos. Isso pode levar 5-10 min entre cada sessão de testes.
- Para esta análise, use o software SMART Video Rastreamento de Panlab / Harvard Apparatus para registrar e avaliar o movimento do mouse.
NOTA: Qualquer câmera de monitoramento de vídeo comercial e software pode ser usado para rastrear o assunto de teste e avaliar os resultados do labirinto campo aberto. É muito importante para o usuário final para entender como calibrar e executar o software usado para cada análise individual. Independentemente da câmera de vídeo e software de rastreamento usado, os melhores resultados são obtidos quando a câmera e software estão corretamente calibrados de acordo com as instruções do fabricante. - Realize o teste ipadrão na iluminada sala capaz de conter o aparelho labirinto eo computador necessário para executar o software. Suspender a câmera de vídeo acima do labirinto ou anexando-o para o teto ou usando qualquer sistema de apoio elevada que permite que a lente da câmera para ver toda a área do labirinto (Figura 2).
- Como administrador humano do teste, certifique-se de ter espaço suficiente no quarto para ser completamente não-observável pelos assuntos de teste no labirinto de modo a não influenciar o comportamento dos camundongos.
2. Preparar o Software para medir a atividade
- Abra o software de vídeo Rastreamento.
- Uma vez que o software é aberto, mova o cursor até a opção "rastreamento individual de cada disciplina", localizada na aba "Aquisição de Dados" e único clique para abrir esta opção.
- Escolha a opção "Antecedentes estático", localizado na parte inferior do ecrã.
- Depois de escolher o "fundo Static" é escolhidon, que é necessário para usar o software para tomar uma imagem do labirinto antes da adição dos sujeitos de teste. Para fazer isso, mova o cursor para o botão "Photo" localizado na parte inferior da tela e único clique.
NOTA: O software irá tirar uma foto do cenário sem o assunto de teste que será subtraído da imagem tomada durante o processo de acompanhamento. Isto resulta em apenas o movimento do sujeito a ser analisada pelo software. - Confirmar que a imagem de fundo tomada de cima é completamente removida pelo software de seguimento movendo o cursor para o botão de "teste", localizado na parte inferior da tela e clicar uma vez. Um campo sólido branco será mostrado se a imagem de fundo é completamente removido a partir da imagem de rastreamento. Se as condições de iluminação ou mudar o labirinto é acidentalmente movido, você vai ver negros "sombras" neste domínio, indicando as duas imagens não se adequam perfeitamente coincidentes. Para remediar esta situação, basta repetir step 2.4 supra.
- Depois de confirmar as configurações de fundo, use a opção Tempo 'para configurar o modo como o tempo é controlado durante a aquisição. Para fazer isso, mova o cursor para a aba "Configuração" e clique uma vez sobre o título "intervalos". Use a nova janela aberta para inserir os parâmetros experimentais.
- Para este protocolo, escolheu a opção "tempo programado" como período de acompanhamento de 10 min. Definir o "período de latência" a 5 segundos para permitir que o utilizador coloque o rato no centro do labirinto e afastar-se antes do início do acompanhamento. Introduzir o "tempo de aquisição" de 10 min durante a duração do teste. Defina o "Pare de controle" definida como "Quando o tempo programado (10 min) é longo", que desliga-se automaticamente a câmera e a função de acompanhamento do software.
- Mova o cursor para o botão "Fechar" depois de todos os tempos foram definidos para fechar a janela. Agora você está pronto para iniciar o testeing procedimento.
3. Administração do Aberto Campo de Provas
NOTA: O pacote de software usado neste protocolo permite o rastreamento de até 16 ratos individuais ao mesmo tempo. Para facilidade de realização e, como mencionado acima, o protocolo discutidos aqui é para um único rato usando um único quadrante da OFM. Para o equipamento em uso para este protocolo, um máximo de 4 ratos individuais poderiam ser rastreados usando cada quadrante do labirinto. Se utilizando um labirinto multi-gabinete, depois de colocar o primeiro mouse assunto no quadrante definido, coloque os ratos restantes em seu respectivo quadrante labirinto para análise de rastreamento. Para efeitos do presente protocolo, mais instrução será específica para um único quadrante do labirinto.
- Traga os ratos em suas gaiolas de sua sala que abriga a sala de ensaios. Permitir que a ratinhos para se aclimatarem ao ambiente do processo durante um período mínimo de 30 minutos antes de se iniciar o teste.
- Retirar um único mOuse desde a gaiola, segurando gentilmente sua cauda e coloque o mouse no meio do labirinto campo aberto ao mesmo tempo em ativar o software SMART simplesmente clicando no botão Iniciar para começar a acompanhar o movimento do mouse. É normal que o mouse para mover imediatamente para as paredes periféricas do labirinto e do calendário de liberação e captura do mouse rastreamento deverá coincidir para gravar este movimento.
- Permitir livre e ininterrupto movimento do mouse assunto durante o respectivo quadrante do labirinto para um único período de 10 minutos durante os quais, o software de rastreamento irá gravar o movimento (Figura 3).
- No final do período de teste, pegar o mouse assunto suavemente, removendo-o do labirinto e devolvê-lo à sua gaiola.
- Antes da limpeza do labirinto, contar visualmente os peletes boli fecais presentes no labirinto e gravar os números manualmente para análise posterior.
- Remova todas as pelotas fecais e limpe todas as manchas de urina. Pulverizar o chão e as paredes do quadrante labirinto com 95% de etanol e limpe com uma toalha de papel. Permitir que a solução de etanol para secar completamente antes de testar outros ratinhos.
- Repita o procedimento com o próximo mouse.
4. Medição e Análise do Comportamento Durante procedimentos de teste
NOTA: Para a medição, três aspectos do comportamento campo aberto são facilmente caracterizados utilizando este protocolo (ver discussão). Uma breve instrução sobre como acessar essas medições no software de monitoramento de vídeo segue.
- Na tela principal do software SMART, mova o cursor para a "Zones" tab e único clique "Definition" para abrir o Editor Zone.
- Siga as instruções detalhadas no Manual do Usuário do software SMART que definir as zonas ou grades para sobrepor sobre os caminhos de rastreamento. Aqui, o software foi utilizado para definir uma grade 5 x 5 de 10 centímetros quadrados cobrindo o chão do labirinto ( Figura 4). Certifique-se de salvar o arquivo de zona criado antes de fechar o Editor Zone.
- Na tela principal do software SMART, mova o cursor para a aba "Análise" e único clique para abrir a janela de Análise de Dados.
- Mova o cursor até a guia "Arquivo" e abra o arquivo Zona criado acima.
- Mova o cursor para a aba "Configuração" e abra a opção "Track Analysis". Isso abrirá a janela "configuração análise Single-assunto".
- Mova o cursor para a aba "Standard" e mova o parâmetro "Distância Percorrida" na caixa de parâmetros disponíveis, (lado esquerdo) para a caixa de parâmetros incluídos (lado direito).
- Mova o cursor para a aba "zonas Transitions" e mover todos os parâmetros apropriados para a caixa de parâmetros incluídos como acima.
- Verifique se a caixa "Track Full" é verificada na parte inferior da janela.
- Move o cursor para o botão OK e feche a janela de configuração de análise individual de cada disciplina.
NOTA: Dependendo da análise que deseja realizar, muitas outras opções podem ser escolhidos nesta janela de explorar dados de análise. Leia o manual do seu programa específico do Usuário detalhado de parâmetros para determinar o que são os mais importantes para a análise de seus dados.
- Sob a guia Arquivo no canto superior esquerdo da janela do programa, abra a janela pista sujeito único e coloque uma marca de seleção ao lado de todas as faixas que está sendo analisado. Mova o cursor para o botão Check Mark, na parte superior da janela e clique para fechar a janela de Pista Explorer.
- Mova o cursor para o botão "Go" na janela de Análise de Dados e único clique para iniciar a análise dos dados da faixa.
- Análise de dados pode ser a saída tanto como arquivos de texto ASCII, ou pode ser exportado diretamente em uma planilha do Excel. Use as ferramentas de saída do programa de software que você está usando para a saída do data para seu próprio uso.
NOTA: A distância total percorrida e do tempo passado nas zonas indicadas será a saída seguindo as etapas de análise de dados descritos acima. Mais uma vez, salienta-se que os passos para chegar a estas medições representados aqui serão diferentes dependendo do software do usuário utilizado. Mas os dados em si e à interpretação dos resultados deve ser independente semelhante do programa de software usado. Também é importante notar que o viés administrador do teste é removido este protocolo como todos os dados coletados é quantificado dados medidos pelo software e não o administrador. Assim, não há nenhum elemento qualificável com os dados coletados, como descrito.
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Resultados
O número médio de indivíduos por estirpe de ratinhos testados, na maioria dos casos é de aproximadamente 20 para gerar relevância estatística suficiente. No entanto, este número pode estar na gama de 8-30, dependendo da disponibilidade do rato. Dependendo da medida ou comparações necessário, também é favorável utilizar pareados por idade.
O primeiro e talvez o mais importante parâmetro específico para medir no campo aberto Maze é a distância ambulatorial total. Enquanto a unidade de medida é...
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Discussão
O campo aberto Maze é uma das plataformas mais utilizadas em estudos de comportamento dos animais. Uma série de importantes parâmetros convencionais e etológicas 2,4 podem ser coletadas e analisadas durante a execução da OFM. Estes dados permitem que o pesquisador para medir comportamentos que variam de actividade global locomotor a comportamentos emocionais relacionados à ansiedade 8. No entanto, o uso de OFM não é sem suas deficiências. Uma questão de confusão é a ampla gama de variáveis estáti...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH-2RO1NS033661) e pela Estação Experimental Agrícola do Alabama (HATCH ALA021-1-09017).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Teste de campo aberto de várias unidades | San Diego Instruments, Inc. | Branco 7001-0354 | Qualquer labirinto de campo aberto de uma ou várias unidades pode ser usado |
| Software de rastreamento SMART DT | PanLab/Harvard Apparatus | 76-0695 | Qualquer software de rastreamento pode ser utilizado com este protocolo |
| Sony 990x Video Camera Recorder | Sony | CCD-TRV328 | Qualquer câmera de vídeo adequada pode ser conectada ao computador para gravar perfis de rastreamento. |
Referências
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Reimpressões e permissões
