Abstract
보다 효율적으로 단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)을 대상으로 개발 한 고유 REPLACE 전략이다. 그것은 잠재적 인 약물 표적의 대부분을 대표하는 이러한 결합 부위에 대한 억제제의 식별 및하는 개선 된 방법을 제공함으로써 약물 표적 가능한 공간을 확장하는 것을 목적으로한다. 본 연구의 주된 목적은 연산 및 합성 화학 접근법을 포함 REPLACE 전략의 사용과 애플리케이션의 방법론적인 개요를 제공하는 것이다. 비 ATP 경쟁 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 항 종양 치료제 억제제의 개발에의 응용을 통해 예시 교체합니다. CDKs 자주 암에 규제가 완화되고, 따라서 약물 개발을위한 중요한 대상으로 간주됩니다. S 단계에서 CDK2 / 사이클린의 억제 E2F1 경로를 통하여 p53의 독립적 인 방식으로 암 세포의 선택적 사멸을 촉진하는 것으로보고되었다. 사이클린 bindin에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 표적g 홈 (CBG)는 전사 CDKs 통해 세포주기의 특정 억제를 허용 접근법이다. CBG는 CDK 기판 및 종양 억제 단백질에서 유래 합의 시퀀스 인식 모티브 (CBM)를 결합 사이클린라고합니다. CBM은 이전에 더 충분한 활동 (RRLIF)를 유지 펜타로 절단 한 후 p21Waf (HAKRRIF)과에서 octapeptide에 최적화되었습니다. 투과성 세포되지 않습니다 일반적으로 펩타이드, 대사 적으로 불안정하고 따라서 전략 REPLACE (전산 심화 학습을 통해 부분 리간드 대안으로 교체가) 더 마약 같은 억제제를 생성하기 위해 적용되어 있습니다. 이 전략은 선택적으로 세포주기 CDK / 사이클린 복합체를 저해 조각 결찰 억제 펩티드 (뒤집)의 설계로 시작합니다. 넘겼는 반복적으로 N- 말단 (Ncaps)에서 시작하여 작은 분자 (그룹 상한) 등의 단편 HAKRRLIF / RRLIF의 잔류 물을 대체하여 생성에 교체로 추적 관찰 하였다C 말단. 이들 화합물은 항 - 종양 치료제로서 비 ATP 경쟁적 CDK 억제제의 생성에 대한 포인트를 시작하고있다.
Introduction
이 글에서, 더 약학 관련 분자에 단백질 - 단백질 상호 작용의 펩티드 억제제를 변환 전략 REPLACE (계산 농축하여 부분 리간드 대안으로 교체)을 적용하는 사례 연구 1-3을 설명한다. 프로톤 펌프 억제제가 잠재적 인 약물 표적의 풍부한하지만 underexploited 소스를 나타내는 반면, 기존의 방법론이 널리 액세스 할 수 있도록 크게 부족하다. 단편 기반 디자인 4, 하이 스루풋 스크리닝 (5, 6)은 발전을 구비 한 스테이플의 펩티드를 포함한 현재 전략은, 그러나 이들은 많은 경우에 비효율적이다. 그 결과,보다 진보하고 더 효율적인 접근 방법이 요구된다. 완전히 약물 형 및 개선 된 특성을 항 종양 치료제로서 향후 개발 잠재력이있다 키나제 억제제의 개발에서 검증 된 교체한다. 이 전략은 셀의 비 ATP 억제제의 개발을들 수있다사이클 CDKs 및 다음과 같이 포함한다 : 1) 사이클린이 홈을 바인딩 HAKRRLIF / RRLIF의 상호 작용에 대한 3 차원 구조 정보를 획득하는 단계; 2) 펩티드의 상호 작용을위한 결합 중요한 결정 인자를 결정하는 단계; 하나 이상의 결합 결정 인자를 포함하는 펩티드의 N 말단 3) 절단; 펩타이드 및 그 중 절단 된 부분에 대한 잠재적 인 작은 분자 대안 4) 전산 식별 (부분 리간드 대안, PLAS) 부모 펩타이드의 키 상호 작용을 유지; 5)의 합성 또는 PLAS 상업적 소싱 이전 삭제 펩티드 잔기 (들)에 의해 점유 된 서브 사이트와 결합하는 열심 예측; 6) 고체상 합성을 이용하여 절단 된 펩티드 가장 PLAS 결찰 통해 뒤집의 합성 바인딩 시험관에 넘겼 또는 세포 생존 분석에서 더 특성화 다음 기능 분석 (CDK / 사이클린 맥락에서 형광 편광)의 7) 테스트. 전략에서 교체의 개략도Y는. 그림 1에 나타낸다이 글에서, 교체 전략의 반복을 논의하고 CDK2 / 사이클린에 응용 프로그램이 상세하게 설명. CDKs는 직접 또는 간접적으로 종양의 대부분의 규제가 완화 될 것으로 생각되며, 따라서 적절한 항암제 대상 7 여겨진다. CDKs는 완전한 활성화를 위해 사이클린과 연관이 필요하고이어서 세포주기 조절에 관여하는 주요 8 단백질 인산화. CDKs의 두 주요 그룹은 세포주기 체크 포인트를 제어 이소 타입 [G1 / S (CDK4 / 사이클린 D, CDK6 / 사이클린 D 및 CDK4 / 사이클린 E), S 상 (CDK2 / 사이클린 A) 및 G2 / M (CDK1 / 아르 사이클린 B)] 및 인산화를 통해 RNA 중합 효소의 규제 (CDK7 / 사이클린 H, CDK8 / 사이클린 C, 경우, Cdk9 / 사이클린 T). E2F1 전사 인자 후 DNA에 결합하고 유전자 전사를 개시 DP 단백질과 복합체를 형성 할 때 S 단계 진행에서 중요한 단계가 발생한다. CDK2 / 사이클린은 E2F1의 전사를 중화하는 데 필요한인산화를 통해 활동함으로써 E2F1-DP의 복잡하고 그 이후의 저하의 출시 선도. CDK2 / 사이클린의 억제는 그 DNA 결합 상태를 지속적으로 활성화 선도 E2F1을 유지하는 것으로 여겨진다. E2F-1 활성의 생성 수준은 따라서 치료 전략을 제안하는 p53의 독립적 아폽토시스를 유도하는 데 필요한 임계치를 능가 할 것이다. 인해 E2F-1 p53의 규제 완화와 PRB 경로, 높은 수준으로 빈번하게 종양에서 아폽토시스를 선택적으로 유도한다 암세포 및 CDK2 / 사이클린 억제 발생 및 암 검증 대상 (7)으로 간주 될 수있다.
임상 연구 CDK 억제제는 인간의 kinome에서보다 큰 500 단백질 키나제 중 반응성을 건너 이어지는 매우 보존 ATP 결합 부위를 대상으로 잠재적 효과와 독성 (9)쪽으로 상승을주는. 또 다른 방법은 CBG을 통해 기판의 채용을 대상으로 비 ATP 경쟁 저해입니다사이클린 긍정적 인 규제 서브 유닛에 존재하기 때문에 별개의 사이트 (10, 11)를 결합 ATP로부터 멀리 떨어져있다. CBG 주로 사이클린, 사이클린 D 및 사이클린 E에 존재하는 홈이고, 소수성 기판 및 종양 억제에 위치한 공통 서열을 인식하는 것으로 나타났다. 격리 된 펩타이드로서, 사이클린 결합 모티프 (CBM)는 CBG 결합하고 세포주기 CDKs의 키나제 활성을 억제하는 것으로 나타났다. CBM은 약물에 대한 분자량 사이 좋은 타협을 나타내는 펜타에 또한 절단 (HAKRRLIF, CDK2 / 사이클린 IC (50) 0.07 ± 0.02 μM, CDK4 / 사이클린 D IC (50) 0.88 ± 0.34 μM) octapeptide과 최적화 된 형상과 힘 (RRLIF, CDK2 / 사이클린 IC (50) 1.01 ± 0.17 μM, CDK4 / 사이클린 D, IC (50) 25.12 ± 2.97 μM) 12, 13. CBGs는 acidi에 의해 브리지되는 큰 주와 작은 차 소수성 포켓으로 구성C 지역은 (Glu220, Glu224 및 Asp283 포함). HAKRRLIF의 키 바인딩 결정은 산성 영역 및 기본 친 유성 사이트와 Leu6과 Phe8의 상보성의 높은 수준 Lys3,의 Arg 4 Arg5의 2 소수성 포켓, 이온 쌍과 수소 결합을 갖는 Ala2의 상호 작용을 포함한다. Ile7가 주 포켓 최적의 접촉을 허용하는 스페이서 잔기로 작용하면서 또한, 다수의 수소 결합은 펩타이드 골격으로부터 기여된다. 바인딩 모드와 CBG와 HAKRRLIF의 상호 작용은 그림 2에 표시됩니다.
CBM / CBG 단백질 - 단백질 상호 작용을 표적으로하는 CDK2 / 사이클린 A, CDK2 / 사이클린 E 및 CDK4 / 사이클린 D의 키나제 활성을 억제하며, 정상 세포 (7)에 영향을주지 않으면 서이 E2F1에게 암 세포 매개 세포 사멸을 유발한다. CBM 유래 펩타이드가 세포주기 CDKs의 효과적인 저해제가 있지만, 그들로 인해 대사 약물로서 유용 할 것 같지는 않다불안정과 세포 투과성의 일반적인 부족. 이를 위해, 우리는 CDK2 / 사이클린을 억제 규제 완화 E2F1을 이용한 항암 치료제의 발전을 위해 더 많은 약물 같은 화합물로 이러한 강력한 펩타이드 억제제를 변환하기 위해 교체 전략을 적용했습니다. 다음 프로토콜은 사이클린 홈에 교체의 응용 프로그램에서 완성 된 작품을 요약 한 것입니다. 첫번째 예에서, HAKRRLIF의 N 말단 테트라위한 약물과 같은 캡핑기를 교체가 확인되었다. 또한이 그룹의 개선은 교체에 대한 추가 검증 연구에서 조사 하였다. 이 연구에서 대표 결과도 제공됩니다.
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Protocol
잠재적 인 작은 분자 모자를 씌우는 그룹 1. 전산 확인
주 : 원칙적으로, 도킹 또는 pharmacophore 검색 방법의 다양한 잠재적 캡핑 그룹을 예측하는데 사용될 수있다. 바꿀 계산 연구의 주 목적은 치환 된 아미노산의 기능과 상호 작용을 유지하는 작은 분자를 확인하는 것이다.
- LigandFit 도킹 프로토콜 (14)의 검증
주 : 이전의 연구에서, 도킹 방법 (LigandFit 15, 분자 모델링 프로그램 스위트 모듈 디스커버리 스튜디오 3.0)이 알고리즘은 공지 Ncaps의 결합 모드를 재현하기 위해 결과가 얻어지는 것을 보여주기 위해 충분하다는 것을 보장하기 위해 검증 된 알 수없는 화합물 (14) 예측이다.
- 다음 단계 (1.2-1.5)를 사용하여 다음과 같이 LigandFit 최적의 파라미터를 식별 : EN PLP1포즈 생성, 생성 된 포즈의 최소화와 포즈의 분석을위한 PLP1 채점 기능 ergy 그리드.
- 얻어진 입체 형태를 제한하고 캡핑 펩타이드에 공유 결합 형성에 적절 리간드를 위치시키기 위해, 수소 결합 상호 작용을위한 필터 및로 각각 Trp217 Gln254의 인돌 질소 및 아미드의 질소 원자를 설정한다.
- 디자인 및 수용체 (2UUE)를 사이클린 / CDK2에 조각 대안의 라이브러리를 고정. 합성 및 PLP1 득점, CBG과의 상호 작용 필터 및 보완과의 상호 작용을 기반으로 상업 소싱에 대한 잠재적 인 캡 그룹을 우선 순위. 다음과 같이 LigandFit 도킹에 필요한 여러 단계가 있습니다.
- 수용체 결합 부위 (14)의 제조
- 소프트웨어의 시각화 창에 : CDK2 / 사이클린에게 결정 구조 (2UUE PDB ID)를 가져옵니다. 이 구조는 이전에 식별을 포함 FLIP 5- 메틸 -1- 페닐 -1H- 피라 11,2,4- 트리아 졸 -3- 카 복스 아미도 - (3,5- DCPT) RLIF 사이클린 홈에 결합 (도 3).
- 삭제 또는 장소 잔류 RLIF (C- 말단)에 보관하십시오. 단백질 서열이 유지되는 경우, 리간드의 상호 작용에 대한 필터로서 펩타이드의 N- 말단 아미노기를 사용한다. "수용체 - 리간드 상호 작용"도구에서 N-캡 표시 / 숨기기 사이트 영역에서 3,5- DCPT 주위의 영역을 만들 수 있습니다. 구체는 리간드 - 수용체 상호 작용은 결합하는 동안 발생할 수있는 결합 부위의 활성 영역을 정의하기 위해 생성된다.
- "선택 리간드의 볼륨으로 찾을 사이트"에서 더 결합 부위를 정의하고 단백질에서 리간드에게 3,5- DCPT을 삭제합니다. 생성 구 내에 결합의 양을 정의하기 위해,이 단계를 수행한다.
- 수소 결합에 대한 상호 작용 필터와 같은 잔류 Trp217과 Gln254의 인돌 질소와 아미드 질소 원자를 설정합니다. 상호 작용 필터를 설정하는 것이 매우 INTE 만 포즈세트 잔기의 원자 RACT 따라서 도킹 포즈에 중요한 상호 작용을 유지 도킹 과정에서 필터링 될 것이다.
- 리간드 (14)의 제조
- 분자량이 500 미만, 차 주머니 절단 펩티드 및 반 데르 발스 상호 작용을위한 적합한 소수성 기 (치환 된 페닐기)의 포함 등으로 결찰을위한 카르 복실 레이트 기의 존재를 포함한 기준에 기초하여 (100) 전위 캡핑 기의 라이브러리를 디자인 표 1.
- Trp217 및 치환체로 펩타이드 수소 결합 상호 작용을 모방하기위한 헤테로 고리를 선택 HAKRRLIF의 기본적인 측면 체인의 이온 쌍의 상호 작용을 교체 포함. 카르 보닐 산소 친 펩티드 (표 1)에서의 펩티드 백본 유사한 Gln254의 아미드의 질소 원자와 상호 작용 할 수 있도록 각각의 알데히드와 같은 분자 리간드 도킹.
- 이전 문서로왕 저에너지 형태로 설계 리간드를 최소화하고 "리간드 준비"프로토콜을 이용하여 적절한 이온화 상태로 준비한다. 그리기 및 소프트웨어에 가져 오는 스프레드 시트에 대한 ChemDraw에서하여 .sdf 파일 형식으로 이러한 잠재적 인 N 캡을 이전에 내보낼 수 있습니다.
주 : 리간드 프로토콜을 준비하는 것은 모든 리간드를 최소화하는 데 사용되는 자신의 낮은 에너지 상태로 고정되는 이온화 전하가 적용 원자에 적용 하였다. 디폴트 매개 변수는이 단계에서 사용된다.
- 사이클린 홈 (14)에 대한 리간드의 도킹
- 소프트웨어의 수용체 - 리간드 상호 작용 프로토콜 세트에서 LigandFit 루틴을 선택합니다. 수용체이 프로토콜에 대한 입력으로 제조 된 리간드를 사용합니다.
- 에너지 그리드 이러한 실행을 선택 PLP1의 경우, 그 에너지를 최소화 할 포즈와 (10)로 생성 포즈의 수는 기본값에서 다른 모든 매개 변수를두고 있음을 지정합니다.
참고 : LigandFit입니다몬테카를로 구조적 검색 알고리즘과 결합되는 형상 기반 비교 필터를 이용하여 단백질의 활성 부위에 높은 친화도 및 잠재적 상보성의 포즈를 식별하고 생성 할 수있는 도킹 방법. 도킹 프로그램에 의해 사용되는 에너지 그리드는 리간드 - 수용체 상호 작용과 포즈 전위를 발생시키기위한 힘의 필드이다. PLP1는 특히 수소 결합 상호 작용의 우선 순위와 구분 적 선형 전위 PLP 원자 유형은 각각의 비 - 수소 원자 리간드 또는 비 - 수소 원자 수용체에 대해 할당된다.
- 결과의 분석
- 첫 번째 인스턴스에서, 디스플레이는 PLP1 점수의 값을 내림차순으로 정렬 한 다음 비주얼 프로그램에서 포즈합니다. 후보 리간드에 기초하여 고정 된 리간드의 결합 친화도가 표적 수용체와 기하 구조 및 비 - 공유 상호 작용을 포즈 추정 등 PLP1 같은 스코어링 함수를 사용한다.
참고 : 여기에, PLP1 채점 기능은 G에 발견이 수소 결합의 추정을 포함하는 것처럼 최상의 결과를 필자. - 공지 캡핑 기 값 미만 2 (상대 평균 제곱 편차 (RMSD를 갖는))와 시각 1 얻었 포즈의 상부 25 %를 분석) superimposability 2) 사이클린 홈과 상호 작용 필터 및 3) 시각 상보성 성취 . 그것은 그에서 허용됩니다 제대로 (실험 구조에 비해) 포즈 도킹 <2의 RMSD 값이 있습니다.
- 알려진 구조 활동 관계와 일치하는 방식으로 결합 포켓의 효율적인 충전을 갖는 것으로 정의된다 시각적 보완을위한 포즈를 검사합니다. 필터는 상호 결합 및 / 또는 아미드 결합 형성에 대한 정확한 기하학 전위 캡핑기를 배치 할 필요에 중요한 것으로 알려진 분자간 접촉을 필요로 묶기 원자를 포함하도록 설정된다. interactio와 수소 결합을 잠재적 인 N-상한 그룹의 도킹 포즈의 세 가지 예N 필터는도 4에 도시되어있다.
- 첫 번째 인스턴스에서, 디스플레이는 PLP1 점수의 값을 내림차순으로 정렬 한 다음 비주얼 프로그램에서 포즈합니다. 후보 리간드에 기초하여 고정 된 리간드의 결합 친화도가 표적 수용체와 기하 구조 및 비 - 공유 상호 작용을 포즈 추정 등 PLP1 같은 스코어링 함수를 사용한다.
2. 합성 및 잠재적 인 N -capping 그룹의 특성
- N 캐핑 그룹의 합성.
- 얻어진 합성, 모든 상업적인 출발 물질, 용매 및 시약을 사용한다. 기존의 합성 유기 화학 (예를 들어 그림 5 12, 13)에 의해 잠재적 인 N-상한 그룹을 합성.
- 반응을 모니터링하는 실리카겔상의 박막 크로마토 그래피 (TLC)를 수행한다.
- 이동상에 출발 물질과 반응 액 (1 mg)을 용해시키고 모세관 튜브를 사용하여 TLC 플레이트에 그 자리.
- (35:65 비율로 에틸 아세테이트 및 헥산) 이동상을 포함하는 챔버의 TLC 플레이트를 배치했다. 이동상은 TLC 플레이트의 90 %에 도달하면, 분리 판을 공기 건조.
- 눈에 보이는 반점, 출발 물질과 반응 혼합물을 검출하는 UV 광을 사용한다. 칼모든 반점의 R의 F (스폿 및 이동상에 의해 이동 거리의 비) culate.
주 : 출발 물질의 R의 F에서 볼 수없는 지점이 없을 때 반응이 완료된다.
- 반응 종료 후 수성 산 또는 적합한 염기 용액으로 세척하고 분별 깔때기에 넣어 반응 혼합물을 작동한다. 진공 하에서 얻어지는 조 생성물을 유기 용매를 모아서 회전식 증발기에서 증발 및 건조.
- 적합한 용매의 3-5 ml의 조 생성물 500 mg을 용해시키고 실리카 또는 RP18 samplet의 1g에 추가 공기 하에서 건조. 실리카 / RP SNAP 플래시 카트리지 조질 생성물을 함유 samplet 놓고 6 % 에틸 아세테이트에서 시작하여 그라데이션 뛰기 SNAP 100g 컬럼을 이용한 (제조사의 프로토콜에 따라) 자동 고성능 플래시 크로마토 그래피를 사용하여 조 물질을 정제 : 94 % 내지 50 % 에틸 아세테이트 및 헥산을 통해 50 %의 헥산15 열 볼륨.
- 건고 모든 용매를 증발시켜, 회전 증발기를 사용하여 플래쉬 크로마토 그래피로부터 회수 용매 정제 된 생성물을 건조시키고 상기 모든 잔류 용매를 제거하기 위해 진공하에 생성물을 건조. NMR, MS 및 분석 HPLC로 정제 된 제품의 특성을 수행합니다.
- 1 H NMR, 13 C NMR 들어, 정제 된 시료의 약 10 mg의 무게 적절한 중수 소화 용매에 용해하고, NMR 스펙트럼을 기록 2,14 건조 NMR 튜브에 내용을 전송.
- 1 H NMR 및 높은 필드 NMR 분광계 (최소 300 메가 헤르츠)와 13 C NMR 스펙트럼을 기록한다. QTOF (비행 질량 분석기의 텐덤 사중 1 시간)을 이용하여 질량 스펙트럼, 전기 분무 이온화 (ESI) 또는 70S VG를 취득 (이중 포커싱 섹터 자기 질량 분광계, EI)를 2,14.
- 다이오드 어레이 검출기 HPLC로 제품의 순도를 분석하고 장착C18 (2) 100, 250 × 4.6 mm, 분석을위한 5 μm의 열입니다. 30 분 동안 60 % 아세토 니트릴 (0.1 % 트리 플루오로 아세트산) 100 % 물 (0.1 % 트리 플루오로 아세트산)부터 기울기 실행을 사용하여 4 분 구배를 잡아. 226 및 254 nm의 2,14에서 크로마토 그램의 압축을 풉니 다.
참고 : 평가 화합물의 분석 순도는> 95 %이었다.
뒤집 2 세대 3. 고체상 합성
- N 덮인 뒤집의 합성
- 다음 단계를 사용하여 표준 고상 합성 방법을 통해 N 덮인 펩티드 화합물을 조립합니다.
- 2 ml의 O -Benzotriazole- N, N, N ', N'테트라 메틸 우로 늄 헥사 플루오로 포스페이트 (HBTU, 221.93 mg)을 4.4 당량의 C 말단 아미노산 (- 프의 Fmoc) 5 당량을 활성화 5 분 동안 DMF. 디 이소 프로필 에틸 아민의 6 당량을 사용하여 스케이트장 수지에의 Fmoc - 프 HBTU 혼합물을로드 (DIPEA, 103.13RT에서 1 시간 동안 mg)을 얻었다.
- 10 분 동안 DMF 3 ㎖의 20 % 피 페리 딘을 사용하는 C 말단 잔기의 Fmoc 보호기를 제거한다. 커플 이후의 아미노산 (예를 들어,의 Fmoc-일드,의 Fmoc-레우,의 Fmoc-의 Arg-PMC) 단계적으로. 각 단계에서, DIPEA (103.13 mg) 및 1 시간 동안 실온에서 DMF 2 ㎖에 HBTU (221.93 mg)을 4.4 당량의 6 당량을 사용하여 다음 아미노산의 커플 5 당량.
- 세척 사이클 상기 아미노산과 커플 링 및 Fmoc 탈 보호 단계 후 (DMF DCM의 + 5 × 10 ㎖의 5 X 10 ml)에 적용된다. 펩타이드 조립 후, 커플 RT에서 1 시간 동안 DMF 2 ㎖에 DIPEA (103.13 mg) 및 HBTU (221.93 mg)을 4.4 당량의 당량을 사용하여 6 그룹 N은 캐핑.
- 펩타이드 조립이 완료되면, 절단 혼합물을 2 ㎖와 반응 혼합물을 처리 (: 5 : 90 (5) TFA / H 2 O / TIPS) O를 / N은 보호기 측쇄를 제거하고, 쪼개짐이 수지 넘겼. 추운 디 에틸 에테르 침전과 내가 함께 그 결과 제품을 씹다회전 증발기에서 농축 F 필요한.
- 다음 단계를 사용하여 표준 고상 합성 방법을 통해 N 덮인 펩티드 화합물을 조립합니다.
- N 덮인-C 덮인 뒤집의 합성
- O와 함께 (16.1 ㎎, 0.02 밀리몰) 및 추가 [4- (3- 클로로 페녹시) 피리딘 -2- 일] 메탄 아민 (C-CAP) 달아 N 말단 캡핑 및 보호의 Arg-레우 펩티드를 용해 - 벤조 트리아 졸 - N, N, N ', N'테트라 메틸 유로 늄 헥사 플루오로 포스페이트 (HBTU; 16.7 ㎎, 0.02 mmol) 및 N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민 (DIPEA, 6.5 ㎎, 0.02 mmol)을 첨가 하였다.
- 교반하고, TLC / HPLC는 출발 물질의 완전한 소비를 표시 할 때까지 실온에서 반응을 모니터링한다. 반응 종료 후, 에틸 아세테이트와 물 사이에서 회전 증발기를 이용하여 분할 후 조 질의 반응 혼합물을 농축시킨다.
- 수성 및 유기 층을 분리; 1 N의 NaOH, 1 N 염산 및 염수로 유기층을 세척 하였다. 황산 나트륨 약 1 g과, 유기 층을 건조시키고, 회전 증발기에 생성물을 농축시킨다. 피나(: 2.5 : 2.5 트리 플루오로 아세트산 / H 2 O / 팁 95) 탈 보호에 대한 에서야 절단 혼합물과 제품 O / N을 취급합니다.
- 찬 디 에틸 에테르로하고, 회전 증발기에서 농축 필요한 모든 용매를 제거하기 위하여 건조를 완료하는 경우, 생성 된 생성물을 씹다. 또한 모든 잔류 용매를 제거하기 위해 진공하에 생성물을 건조.
- 정제 및 넘겼의 특성
- 반 예비 역상 HPLC 방법을 사용하여 원유 뒤집를 정화. 정제 된 뒤집을 동결 건조하고 2,14 질량 분석법을 사용하여 분자량을 특성화.
- 다이오드 어레이 검출기와 HPLC로 넘겼의 분석 순도를 결정하고 250 × 4.6 mm, 5 μm의 열, C18 (2) (100)를 장착. 95 % H 2 O (0.1 % 트리 플루오로 아세트산) / 5 % 아세토 니트릴 (0.1 % 트리 플루오로 아세트산) 35 % H 2 O (0.1 % 트리 플루오로 아세트산) / 65 % 아세토 니트릴 (0.1 % trifluoroace부터 구배 방법을 사용하여TIC 산) 30 분 이상 및 4 분 동안 기울기를 개최합니다. 추출은 226과 254 nm에서 크로마토 그램.
경쟁이 2,14 바인딩의 결정에 대한 분석을 결합 4. 형광 편광
- 블랙 384도 (138 μL) 다음 절차를 사용하여 판의 분석을 수행합니다.
- 샘플 트레이서 펩티드 (4 ㎚), 및 키나아제 복합체 희석 (CDK2 / 사이클린을 - 18 μg의 / ㎖, CDK4 / 사이클린 D - 37 μg의 / ㎖) 분석 완충액 (25 mM의 HEPES pH를 7, 10 mM의 필요 농도 염화나트륨, 0.01 % Nonidet P-40, 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT).
- 384 웰 플레이트의 각 웰에 추가 : CDK4D1 또는 CDK2CA (0.3 μg의 / 잘 정제 된 재조합 인간 키나아제 복잡한), 5 ㎕의 화합물 용액, 30 나노 추적 펩타이드 (fluoresceinyl-AHX-PRO-발 5 μL의 5 μL -Lys, 인수, 인수-Leu- (3ClPhe) -Gly 또는 fluoresceinyl - AHX - 프로 - 발 -리스, 인수, 인수 - 레 - 프 -의 Gly의 추적 펩타이드). 각 DMSO (6 %), buffe의 5 μl를 사용하여R, 추적 및 5 μL의 DMSO (6 %), 키나제 복잡한 제어 우물로 추적
- 모든 성분의 첨가 후, 실온에서 1 분 (41.16 XG) 500 rpm에서 플레이트를 원심 분리 한 후 RT에서 45 분 동안 교반하면서 배양 접시. 485 ㎚ / 535 nm의 여기 / 발광 필터, 다이크로 익 미러 장착 멀티 플레이트 판독기 및 검출기를 사용하여 웰 플레이트에서 각각의 형광 강도를 읽는다.
- 아래에 나타내는 식을 이용하여 모든 시료에 대한 상대적인 평균 편광 (MP)를 계산. 상대 MPS의 상관 관계 및 농도를 테스트하여 IC를 대수 회귀 50 값을 결정합니다.
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Representative Results
사이클린 홈에 HAKRRLIF의 상호 작용은 그림 2에 나타내었다. 키 바인딩 결정을 나타내는 펩타이드 잔류 물은 다른 잔류 물이 작은 기여 12,13,18를 제공하여 Ala2, Arg4, Leu6 및 Phe8을 포함한다. 이 사례 연구에서 교체 전략은 주로 Ala2 및 Arg4의 상호 작용을 흉내 낸 HAKRRLIF의 N- 말단 테트라에 잔류에 대한 단편 대안을 찾기 위해 이용되고있다. 전위 NCAP 프래그먼트 (표 1)의 라이브러리는 기준에 따라 제조 하였다. 각 분자는 사이클린 A (: 2UUE의 PDB ID)와 그 결정 구조에서 N 캐핑 기의 절단에 의해 생성 비워진 결합 부위에 고정시켰다. 잠재적 리간드 친 화성이 대안의 예측 행세 분석 및 PLP1 스코어링에 기초하여 선택 하였다 (도킹 포즈의 예는도 4에 도시 됨). 확인 NCAP (1- (3- 클로로 페닐) -5- 메틸 - (1)의 합성H-1,2,4- 트리아 졸 -3- 카르 복실 산)은이 분자가 세 단계로 생성 및 자동화 플래쉬 크로마토 그래피 (보충도 1)에 의해 정제하여,도 5에 도시된다. 1 HNMR, 대표적인 화합물 1- (3- 클로로 페닐) -5- 메틸 -1H-1,2,4- 트리아 졸 -3- 카르 복실 산 13 CNMR, MS 및 HPLC 특성화 데이터가 보충 1-5에 나타낸다 피규어 각각. N - 캡핑 튀기고 N 캡핑-C 캡핑 뒤집의 합성은도 7 및도 8에 나타낸 것으로 특성화 데이터는 표 2에 나타내었다. 두 CDK2 / 사이클린에 대한 결합 친화도 및 CDK4 / 사이클린 D는 사용하여 측정 하였다 기재 FP 분석 및 결과를 표 3에 나타낸다. 화합물 시험, 트리아 기반 N-캡 CDK2 / 사이클린 및 CDK4 / 사이클린 D 대표 화합물에 대한 최대 친화도를 갖는 것으로 판정 하였다 함유 뒤집S는 세포 기반 분석에서 시험 하였다. 전체적으로 식별 FLIP 분자와 같은 더 많은 약물로하고 HAKRRLIF의 octapeptide의 상호 작용의 대부분을 유지하는 것으로 밝혀졌다. 출장 선수 tetrapeptides (표 3 및 4)의 RRLIF 펜타 필적 활성이 있었다 HAKRRLIF에 비해 낮은 효능을 갖고. 이 결과는 얻어진 화합물은 향상된 약물 형상을 가지고 있지만, 이것은 다소 손상된 결합력의 비용으로 얻어 짐을 보여준다.
항 증식 활성이 CGI 리간드를 평가하고, 30 μM 이하 셀룰러 IC (50 ') (S)는 U2OS DU145 및 암 세포주에서 관찰되었다.
교체 전략의 그림 1. 개요. 카스티하세요 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 ICK.
CBG 그림 바인딩 (2)와 HAKRRLIF의 상호 작용 왼쪽 패널 :. CBG에 결합 HAKRRLIF의 모델링 구조. 큰 차 포켓 (오른쪽, Leu6 및 Phe8에 의해 점유)과 빨간색으로 묘사 산성 잔류 물에 의해 브리지되는 작은 보조 (왼쪽, Ala2에 의해 점유) 포켓 - 사이클린 홈 두 소수성 포켓으로 구성되어 있습니다. 오른쪽 패널 :. 다른 중요한 상호 작용, 그리고 (Glu220, Glu224, Asp283)와 펩타이드의 세 가지 기본 잔류 이온 페어링 상호 작용 (Trp217, Gln254, Ile281로) 펩타이드 백본의 수소 결합 연락처를 포함 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.
441 / 52441fig3.jpg "/>
CBG에 3,5- DCPTRLIF 그림 3. 바인딩 모드. 3,5- DCPT - RLIF의 결합이 Trp217과 Gln254의 사이드 체인 원자와 (녹색 점선으로 도시) 수소 결합 상호 작용으로 표시됩니다. 을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.
3 대표 N 캐핑 그룹의 그림 4. 선정 도킹 결과. 도킹 포즈가 표시됩니다. 녹색 점선으로 도시 된 바와 같이, 이들 화합물 각각은 Trp217 Gln254과의 상호 작용 필터 원자-H 결합을하고. 페닐 치환기는 보조 소수성 포켓 반 데르 발스 상호 작용을합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 1- (3- 클로로 페닐) 5. 합성을 -5- 메틸 1H-1,2,4- 트리아 졸 -3- 카르 복실 산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 고상 합성에 의해 N 덮인 뒤집 6. 합성을. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
N-CA 그림 7. 합성pped-C 덮인 전환합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도킹 된 작은 분자 및 PLP1 스코어링 함수를 이용하여 결합 에너지의 예측 결과를 표 1 라이브러리.
| 펩타이드 | 청정 | 열 치수 | 방법 | 유속 | HPLC 유지 시간 | 이론 MW | 관찰 MW |
| 5843 | > 90 % | 4.6 × 250mm | 5~65% 아세토 니트릴 / 물 / 0.1 % TFA | 1 ㎖ / 분 | 23.9 | (732) | 732.6 |
| 5773 | > 90 % | 4.6 × 250mm | 5~65% 아세토 니트릴 / 물 / 0.1 % TFA | 1 ㎖ / 분 | 22.4 | 801.77 | 800.55 |
| 5774 | > 90 % | 4.6 × 250mm | 5~65% 아세토 니트릴 / 물 / 0.1 % TFA | 1 ㎖ / 분 | 24.2 | 767.33 | 766.5 |
| 5762 | > 90 % | 4.6 × 250mm | 5~65% 아세토 니트릴 / 물 / 0.1 % TFA | 1 ㎖ / 분 | 9.0 | 731.91 | 731.65 |
| 5763 | > 90 % | 4.6 × 250mm | 5~65% 아세토 니트릴 / 물 / 0.1 % TFA | 1 ㎖ / 분 | 11.2 | 800.8 | 799.5 |
| 5764 | > 90 % | 4.6 × 250mm | 5~65% 아세토 니트릴 / 물 / 0.1 % TFA | 1 ㎖ / 분 | 10.1 | 766.34 | 765.55 |
| 5771 | > 90 % | 4.6 × 250mm | 5~65% 아세토 니트릴 / 물 / 0.1 % TFA | 1 ㎖ / 분 | 9.4 | 749.9 | 749.6 |
| 5765 | > 90 % | 4.6 × 250mm | 5~65% 아세토 니트릴 / 물 / 0.1 % TFA | 1 ㎖ / 분 | 10.1 | 766.35 | 755.65 |
| 5766 | > 90 % | 4.6 × 250mm | 5~65% 아세토 니트릴 / 물 / 0.1 % TFA | 1 ㎖ / 분 | 9.4 | 761.9 | 761.55 |
| 5767 | > 90 % | 4.6 × 250mm | 5~65% 아세토 니트릴 / 물 / 0.1 % TFA | 1 ㎖ / 분 | 20.4 | 761.9 | 761.55 |
| 5776 | > 75 % | 4.6 × 250mm | 5~65% 아세토 니트릴 / 물 / 0.1 % TFA | 1 ㎖ / 분 | 23.3 | 785.7 | 784.55 |
| 5775 | > 90 % | 4.6 × 250mm | 5~65% 아세토 니트릴 / 물 / 0.1 % TFA | 1 ㎖ / 분 | 9.9 | 751.34 | 750.45 |
CGI 바인딩 펩타이드 표 2. 분석 데이터와는 넘겼습니다.
CDK2CA 및 CDK4CD에 선택된 N 덮인 뒤집의 결합을 체외에서 표 3.
선택 N & C의 결합을 체외에서 표 4. CDK2CA과 CDK4CD로 전환 출장.
보충 그림 1-5. 정제 및 1- (3- 클로로 페닐) 특성화 -5- 메틸 -1H-1,2,4- 트리아 졸 -3- 카복실산.
제품의 보충 그림 1. 플래시 크로마토 그램, 55 % 에틸 아세테이트로 용출 주요 피크 용출 넷 피크 / 45 % 헥산 원하는 제품이 될 밝혀졌다있다 1 단계에서 얻은. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.
도 2 부가 1 1- (3- 클로로 페닐) -5- 메틸 - 1H-1,2,4- 트리아 졸 -3- 카의 HNMR 펜탄 산. NMR 스펙트럼은 3 지방족 메틸 양성자와 3 방향족 양성자를 보여줍니다. 모든 세 봉우리의 통합이 NMR 스펙트럼 다음과 같습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
부가도 3 CNMR 13 1- (3- 클로로 페닐) -5- 메틸 - 1H-1,2,4- 트리아 졸 -3- 카복실산. 각각 탄소에 대한 신호 (10)와 구조에있는 10 개의 탄소 원자, 13 CNMR있다 원자. 각 피크에 대한 통합 NMR 스펙트럼 다음과 같습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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1- (3- 클로로 페닐) -5- 메틸 -1H-1,2,4- 트리아 졸 -3- 카르 복실 산. 화합물의 분자량 4. MS (237)는 실제 분자에서 상위 피크로서 도시되어있다도 보충 화합물의 무게는 237.64이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
HPLC 크로마토 그램에 도시 된 바와 같이 부가도 1- (3- 클로로 페닐) 5. HPLC -5- 메틸 -1H-1,2,4- 트리아 졸 -3- 카복실산을 수득 하였다. 생성물의 순도는 100 %로한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, Micro pipets | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothretiol (DTT)) | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8 °C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595 nm filter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
References
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