Barcoding Genetic com proteínas fluorescentes para Aplicações Multiplexados

Summary

Desde a descoberta do gene da proteína fluorescente verde, as proteínas fluorescentes têm impactado a biologia celular molecular. Este protocolo descreve como a expressão de proteínas fluorescentes distintas por meio da engenharia genética é usada para codificar células individuais. O procedimento permite rastrear populações distintas em uma mistura de células, o que é ideal para aplicações multiplexadas.

Abstract

Proteínas fluorescentes, corantes fluorescentes e fluoróforos em geral revolucionaram o campo da biologia celular molecular. Em particular, a descoberta de proteínas fluorescentes e seus genes permitiu a engenharia de fusões de proteínas para localização, a análise da ativação transcricional e tradução de proteínas de interesse ou o rastreamento geral de células individuais e populações de células. O uso de genes de proteínas fluorescentes em combinação com a tecnologia retroviral permitiu ainda a expressão dessas proteínas em células de mamíferos de maneira estável e confiável. Aqui é mostrado como se pode utilizar esses genes para dar às células dentro de uma população de células sua própria bioassinatura. Como a bioassinatura é alcançada com a tecnologia retroviral, as células são codificadas com código de barras 'indefinidamente'. Como tal, eles podem ser rastreados individualmente dentro de uma mistura de células com código de barras e utilizados em aplicações biológicas mais complexas. O rastreamento de populações distintas em uma mistura de células é ideal para aplicações multiplexadas, como a descoberta de drogas contra uma infinidade de alvos ou o perfil de ativação de diferentes promotores. O protocolo descreve como desenvolver e amplificar elegantemente células de mamíferos com código de barras com marcadores fluorescentes genéticos distintos e como usar vários marcadores ao mesmo tempo ou um marcador em diferentes intensidades. Finalmente, o protocolo descreve como as células podem ser utilizadas em combinação com ensaios baseados em células para aumentar o poder de análise por meio da multiplexação.

Introduction

Tecnologias como a espectroscopia de fluorescência, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo, todos dependem de fluorescência, uma propriedade amplamente explorado em aplicações bioquímicos, biomédicos e químicos. A fluorescência, quer intrínseca ou por meio de rotulagem, tem sido explorada para a análise dos padrões de expressão de proteína, e os perfis de destino celular, as interacções proteína e funções biológicas ^1-9, e através de fluorescência / Förster transferência de energia de ressonância para a detecção de interacções biomoleculares e alterações conformacionais ^10-13. Uma vez que o isolamento da proteína fluorescente verde victoria de Aequorea (GFP) ^14, a descoberta de proteínas fluorescentes adicionais que ocorrem naturalmente a partir de outros cnidários, em especial os corais, aumentou marcadamente o número de proteínas fluorescentes existentes com os espectros de excitação / emissão distinguíveis. Estes, em conjunto com a introdução de mutações nos seus genes ^15-19, Have expandiu ainda mais as possibilidades, a obtenção de uma verdadeira paleta de proteínas fluorescentes disponíveis para os cientistas que exploram microscopia, citometria de fluxo e outras tecnologias baseadas em fluorescência para a sua pesquisa.

Em paralelo, embora de forma independente, o desenvolvimento da tecnologia retroviral tem facilitado drasticamente a expressão estável de informação genética em células de mamíferos ectópica ^20-23. Assim, não é surpreendente que esta tecnologia tem sido utilizado para transferir genes de proteínas fluorescentes em uma ampla série de tipos de células e tecidos ou ^24-28 para a produção de animais transgénicos ^29-31. Seguindo a natureza dos retrovírus, a informação genética da proteína fluorescente ectópica é introduzido no genoma da célula ³² e a célula torna-se fluorescente `para ever'. Esta propriedade permitiu a localização de destino celular, ou de uma única célula de uma população de células. A célula agora fluorescente tem assim acquivermelho sua própria bioassinatura e pode ser definida como com código de barras. A sua bioassinatura único identifica-lo a partir de outras células e, muito importante, que distingue a partir de células geneticamente manipuladas para expressar as proteínas fluorescentes diferentes com espectros de absorção / emissão distinguíveis. Aplicações biológicas, tais como a localização dos fatores de reprogramação para pluripotência ^33, a análise dos factores subnucleares para a elucidação da localização nucleolar ^34, a construção de plasmídeos repórter fluorescentes para estudos de transcrição ³⁵ ou com a etiqueta genética de neurónios para o estudo da arquitectura da rede neuronal ³⁶ , são apenas quatro exemplos dos muitos que têm explorado diferentes genes da proteína fluorescente para a mesma configuração experimental.

A citometria de fluxo tem sido amplamente utilizada para a análise de processos biológicos ao nível de uma única célula, tais como a expressão do gene, do ciclo celular, apoptose, e a sinalização através de fosforiloção ^37-43 .A expressão estável de genes de proteínas fluorescentes em células de mamíferos tem melhorado ainda mais a utilidade de citometria de fluxo para análise das células ^38,44 e interacções ligando-receptor ^45. Recursos avançados têm permitido citometria de fluxo para se tornar uma metodologia amplamente utilizada para alto rendimento e alto teor de triagem ^46. Apesar de o número agora se expandiu de fluorímetros e robótica tecnologias que podem sistemas de leitor de placas pares, imagens e citometria de fluxo, parece haver uma falta no projeto experimental que poderá explorar e encaixar essas capacidades tecnológicas avançadas.

Metodologias rápido, confiável, simples e robustas baseadas em células são drasticamente necessária para aplicações multiplexados que melhoram ainda mais a capacidade de alto rendimento. Isto é especialmente verdadeiro no campo da descoberta de drogas onde ensaios baseados em células de engenharia em um formato multiplex pode aumentar o poder de rastreio de alto rendimento ^39,47-50 . Multiplexing, pois permite análises simultâneas em uma amostra, aumenta ainda mais as capacidades de alto rendimento ^51-54. O código de barras genético fluorescente não só permite a multiplexagem elegante, mas também, uma vez engenharia, contorna a necessidade de protocolos que consomem tempo, reduz os custos acompanhados com anticorpos, grânulos e manchas ^39,52,55, e pode reduzir o número de telas necessários para alta aplicações de transferência. Descrevemos recentemente como a tecnologia pode melhorar retroviral multiplexing através barcoding genético fluorescente para aplicações biológicas, por expressar um ensaio previamente desenvolvido para monitorar o HIV-1 atividade protease ^56,57 com diferentes variantes clinicamente prevalentes ^58. A metodologia é explicada de forma mais descritiva com foco em como selecionar e ampliar células geneticamente com código de barras fluorescentes e como produzir painéis de populações clonais que expressam proteínas fluorescentes distintas e / ou diferente intensit fluorescênciaies. Painéis de populações celulares distintas com base nas suas características fluorescentes melhorar as capacidades de multiplexados, que pode ainda ser exploradas em combinação com ensaios baseados em células que atacam diferentes questões biológicas. O protocolo também descreve como a engenharia de um painel de células com código de barras com um dos ensaios baseados em células previamente desenvolvidos no laboratório, como exemplo ^59. Este protocolo, assim, não se destina a mostrar a tecnologia bem estabelecida retroviral / lentivírus para transferência genética, o valor de proteínas fluorescentes ou as aplicações de citometria de fluxo ^60,48 mas sim para mostrar o reforço do poder combinar os três para aplicações multiplexados.

Protocol

1. Preparação de células de mamíferos, Produção Viral e Transdução de Código de Barras Genetic

1. Placa de 2,5 x 10 ⁶ culas aderentes em uma placa de 10 cm (ou seja, cerca de 50-60% de confluência) um dia antes da transfecção em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal de vitelo (FCS). Para uso em produção de embalagens de células-line retroviral de escolha, como Phoenix-GP (a simpática oferta do Gary Nolan, da Universidade de Stanford).
   NOTA: A linha celular de empacotamento expressa estavelmente proteínas gag e pol para a formação de partículas retrovirais em trans. Adicione certeza células são saudáveis ​​e aderiu à placa numa monocamada, antes da transfecção.
2. 24 horas mais tarde, se preparar a mistura de transfecção de ADN.
   1. Para 125 uL de meio DMEM isento de soro, adicionar 3 ug Vírus da Estomatite Vesicular vector glicoproteína do envelope (pCI-VSVG) e 3 ug de vector de transferência que transporta o gene da proteína fluorescente de interesse. Misture e adicione 15 mL de polietilimina (2 mg / ml).
   2. Incubar mistura à temperatura ambiente durante 15 min e adicionar às células gota a gota.
      NOTA: polietilimina é adicionada à mistura homogénea de ADN como reagente de transfecção para a formação de poliplexos. A fim de se obter partículas virais contendo diferentes marcadores de proteínas fluorescentes, executar cada transfecção, de forma independente com o marcador de escolha. Lembrar que o vector de transferência retroviral é de aproximadamente 7 kb de comprimento e não podem ser embalados se acima de 10 kb.
3. Incubar as placas a 37 ° C. A fim de aumentar a produção de placas virais lugar a 30 ° C ou 32 ° C em seu lugar.
   NOTA: 24 h pós meios de transfecção pode ser substituído com 7 ml de meio fresco, e embora isto possa melhorar a saúde das células, pode diminuir a carga viral no sobrenadante.
4. 48 horas após a transfecção coletar as partículas virais contendo sobrenadante e filtro com um filtro de 0,45 mM de politetrafluoretileno. Use sobrenadante viral recém coletado para a transdução. OthDe outra manter sobrenadante em aliquotas a -80 ° C e evitar a congelação-descongelação. Lembre-se que título viral provavelmente diminuirá até 50% em cada ciclo de congelamento-descongelamento.
5. Linha celular placa de escolha de 24 horas antes da transdução se aderente, ou imediatamente antes de transdução se não-aderente. Semente de 2,0 x 10 ^5-3,0 x 10 ⁵ células aderentes (aqui Huh 7.5.1 e HEK 293T) ou 5,0 x 10 ⁵ a 1 x 10 ⁶ células não-aderentes (aqui SupT1) por poço numa placa de 6 poços.
   Nota: certifique-se para calibrar o número de células a ser semeado antes da transdução, especialmente para células aderentes, de modo que as células atingir uma confluência de cerca de 60% no tempo de transdução.
6. Adicionam-se 5 ug / ml de polibreno (brometo de hexadimethrene) para células semeadas e, em seguida, adicionar o sobrenadante viral previamente recolhidas para se obter cerca de 20-40% de infecção (aqui 2 ml).
   NOTA: O MOI ou a percentagem de infecção é mais arbitrário, como triagem vai permitir a amplificar qualquer subpopulatião de células. Obviamente, um aumento da taxa de infecção facilita e acelera o processo de amplificação.
7. Transduzir as células por centrifugação num rotor de cesto de suspensão a 1500 xg durante 32 min a 120 ° C. Ressuspender as células não aderentes por meio fresco antes da incubação. Para as células aderentes, substitua por fresco media 24 horas após a transdução.
   NOTA: Recomenda-se a selar as placas antes da centrifugação com parafilme para evitar transbordando. Para aumentar a diversidade de células geneticamente com código de barras, a transdução de células com as partículas virais portadoras diferentes proteínas fluorescentes (obtidos a partir do passo 1.4). Ao escolher marcadores fluorescentes, verifique se eles são compatíveis com a instrumentação e eles têm parâmetros fluorescentes distinguíveis.

2. Escolha e amplificação de células geneticamente com código de barras

1. Analise as células de mamíferos transduzidas por citometria de fluxo, pelo menos, 72 horas de pós transdução para quantificar a taxa percentual de transdução. Utilize uma linha de células não transduzidas comparável como controlo negativo.
   NOTA: Como triagem são utilizados para purificar as populações de células de códigos de barras individuais, uma alta taxa de transdução inicial, embora não necessário, deverá acelerar o processo de amplificação.
2. Utilizar a célula-classificador de escolha para obter as células que expressam a proteína de interesse.
   1. Para o efeito, assegurar as portas estão devidamente posicionados nos canais certos.
      1. Para isso utiliza a linha de células naïve como controlo negativo e ajustar a tensão parâmetro / canal de modo a que a população negativa é inferior ao valor de ³ a 10 em cada eixo fluorescente. Determinar gating por fluorescência positiva como eventos que aparecem acima da do controlo negativo para cada canal fluorescente.
   2. Esteja ciente de que cada instrumento pode variar e a voltagem correta para determinar gating devem ser ajustados em conformidade, fazendo controles positivos e negativos imperativos em cada expconfiguração erimental.
      1. Para a detecção de fluorescência nesta configuração experimental usar o canal FITC (filtro 530/30 passa banda passou por um filtro de 502 passe longo) para eGFP, o canal PE (filtro 585/42 passa banda passou por um filtro de 556 passe longo) para td Tomato eo canal APC (filtro passa banda 660/20) para E2 Carmesim.
         NOTA: O laser de 488 nm excita eGFP e td Tomato enquanto E2 Carmesim está animado com o laser de 633 nm.
3. Ordenar em 15 ml tubos cónicos com 1 ml de 100% de FCS.
   NOTA: O processo de triagem de populações de células fluorescentes não é obrigatório, como se pode proceder directamente com o tipo de clones individuais (ver abaixo). Classificando populações apertados com base em fluorescência escolhido garante uma população de backup para futura seleção de clones individuais. Tenha em mente que as células individuais são, por vezes, difícil de crescer, enquanto uma grande parte da população de células pode ser facilmente congelado, descongelado e depois amplificado e, numa fase posterior.
4. Spem baixo as populações classificadas num rotor de centrífuga balde suspensão em 524 g a 32 ° C durante 5 min para sedimentar as células. Re-suspender em 1 ml de meio fresco, e re-placa de modo a que as células de confluência de células é inferior a 60% para permitir o crescimento e divisão para pelo menos dois dias.
   1. Por exemplo, as células aderentes a placa cerca de 3 x 10 ⁵ células em 2 ml de meio por poço numa placa de 6 poços e 2 x 10 ⁶ células em 2 ml de meio em uma placa de 6 cm. Use DMEM para células aderentes e meio RPMI para células não-aderentes (ou qualquer meio especificado, se necessário). Coloque células plaqueadas numa incubadora a 37 ° C durante vários dias para permitir a amplificação.

3. Obter clonais populações de células geneticamente com código de barras em diferentes intensidades

1. Obtenção de populações clonais de células originalmente transduzidas (passo 1.7) ou a partir da população classificada (passo 2.3).
   NOTA: Este vai assegurar um nível igual ou semelhante da expressão da proteína fluorescente entre todas as célulass dentro da população (uma população apertado com uma pequena CV na intensidade de fluorescência média de até 40%).
   1. Para esse efeito, as células individuais tipo em placas de 96 poços com uma unidade de deposição de células automatizado (ACDU). Definir portas para a classificação de acordo com a população de interesse. Assegurar portões são apart definir pelo menos um log-escala para obtenção de populações distintas ao escolher células em diferentes intensidades fluorescentes. Para o procedimento mostrado aqui, utilizar a mesma citometria de fluxo montagem experimental que o descrito no passo 2.2.
2. Amplificar clones individuais em uma incubadora a 37 ° C durante pelo menos 2 semanas. Através do processo de amplificação analisar as células ao microscópio para assegurar que as populações em crescimento surgem a partir de células individuais, e não a partir de mais do que um.
   NOTA: Lembre-se que o classificador irá colocar um celular por bem, em média, e enquanto alguns poços não podem ter qualquer célula em tudo, outros podem ter mais de um.
   1. Para garantir que a população surge de uma célula só, ser extremamente gentil com a placa e nunca perturbar os poços por pipetagem. Observar a placa, bem pelo bem, sob o microscópio.
      NOTA: Enquanto as células individuais podem às vezes ser difícil de identificar, uma vez que eles começam a dividir eles serão facilmente reconhecíveis.
   2. Esteja ciente de que muitas vezes as células 'moita' ao longo das bordas. Descarte esses poços onde várias populações clonais podem ser observados e manter aqueles que têm uma população apertado.
      NOTA: É aconselhável transferir aqueles em placas maiores para a amplificação.
3. Peneirar os populações clonais putativos por analisadas por citometria de fluxo. Compará-los com um controlo negativo, utilizando o mesmo dispositivo experimental de citometria de fluxo.
   1. Analisar apenas uma porcentagem da amostra e manter o resto como backup. Escolha as populações mais nitidamente separadas com base em intensidade média e aperto da população. Amplificá-los conforme a necessidade ou congelar stocks emmeios com 20% de glicerol a congelação a -80 ° C, durante curtos períodos de tempo ou de azoto líquido para um maior tempo.
      NOTA: Lembre-se que a "verdadeira" população clonal deve ter um padrão de fluorescência muito apertado.

4. Certifique-se de Capacidades de multiplexação para High Throughput Screening (HTS)

1. Combinar o número de populações clonais distintos conforme a necessidade, que pode ainda ser utilizado num formato multiplex. Escolha clones com absorção de espectros distinguíveis / emissão e / ou intensidades diferentes. Se um formato de placa de 96 poços é utilizado, o qual é adequado para HTS, sementes 50.000 células em 200 ul por poço.
   NOTA: Tenha em mente que o número de células é apenas uma estimativa e podem mudar com base no tipo de célula e se é aderente ou não.
2. Analisar a amostra utilizando a citometria de fluxo para garantir que cada uma das linhas de células independentes estabelecidas fluorescentes podem ser distinguidos um do outro. Antes da análise preparar negativoe controles de cor única para definir parâmetros e valores de compensação.
   Nota: definir os parâmetros para distinguir claramente as populações mistas lhes permitam ser mais utilizado em um formato multiplexado.

5. Adaptar linhas celulares geneticamente com código de barras para a aplicação biológica of Choice

1. Transduzir linhas de células estabelecidas geneticamente códigos de barras com partículas virais que contêm os elementos de ensaio de escolha, tal como descritos aqui em Stolp et al., 2013 ^59. Lembrar que o ensaio de escolha deve ocupar um canal fluorescente adicional e distinguíveis e, portanto, é para ser transferido para a linha celular de código de barras apropriado.
   NOTA: Cada linha celular com código de barras pode suportar um ensaio diferente.
2. Células com código de barras tipo geneticamente fluorescentes para aqueles que contêm elementos de ensaio.
   NOTA: elementos de ensaio podem ser manipuladas acoplado a um marcador fluorescente ou proteína (como uma fusão ou por meio de um local de entrada de ribossoma interno) fou detecção direta por meio de transferência de western, citometria de fluxo ou microscopia. O sistema utilizado neste protocolo baseia-se na expressão de superfície de HA epitopo sozinho, ou com expressão epitopo FLAG adicional.
   1. Corar as populações clonais contendo o ensaio com anticorpos acoplados HA e APC-fluorescentemente. Em seguida, analisar as populações clonais com anti-FLAG e coloração com anticorpo conjugado com FITC.
   2. Para rastrear o ensaio, analisar ou "decodificar" as populações no canal apropriado, onde as linhas de células geneticamente distintas códigos de barras podem ser distinguidos. Aqui, decodificar a natureza do substrato por meio da análise no canal PE td para a detecção de tomate.

Results

Multiplexing fluorescente células geneticamente barcoded para a finalidade de aplicações biológicas só pode ser alcançado quando as populações clonais individuais foram gerados. Multiplexing é mais eficaz quando as populações códigos de barras têm características distintas fluorescentes claras com sobreposição espectral mínima. O exemplo mostrado na Figura 1 com populações clonais de células de mamífero SupT1 ilustra que as células com o código de barras mCherry e proteína fluorescente ciano (PCP) podem...

Discussion

Aqui dois procedimentos bem estabelecidos foram combinados; através de tecnologia de engenharia genética retroviral e detecção de proteínas fluorescentes utilizando citometria de fluxo. Fluorescent barcoding genética à base de proteínas para a produção de linhagens de células únicas fornece uma maneira simples e robusta para aplicações multiplexados. Geração de células geneticamente modificadas com código de barras por meio da tecnologia retroviral, é inicialmente um processo demorado, mas permite a obtenção de, uma vez...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringas de 10 ml	BD	309604	usadas para filtrar o vírus
0,45 µ m filtro de ploytetrafluoretileno	Pall Corporation	4219	usado para filtrar o vírus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	meios de crescimento celular para células HEK 293T
PEI (Polietilenomina)	poly sciences	23966-2	concentração de 2 mg / ml usada
Centrífuga de balde suspenso (refrigerada)	Eppendorf	5805 000.017	usado para infecção por spin
PBS (solução salina tamponada com fosfato)	Corning	21-040-CV	usado para lavagem de células
Polybrene (brometo de hexadimetrinon)	Sigma-Aldrich	107689	Usado para aumentar a eficiência da infecção viral. Usado em um 5 µ g/ml.
Instrumento FACSAria	BD Biosciences		usado para classificar populações de células
FACSCanto	BD Biosciences		instrumento usado para análise celular
Phoenix-GP	Gift da linha celular Gary Nolan		usado para produzir partículas retrovirais Soro
fetal de bezerro	Mediatech	MT35015CV	usado para crescimento celular e classificação de
células SupT1	ATCC	CRL-1942	Linfoblastos T humanos
Células HEK 293T	ATCC	CRL-11268	Células renais embrionárias humanas que também contêm o grande antígeno T SV40
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	meio de crescimento celular para células SupT1