Barcoding Genetic com proteínas fluorescentes para Aplicações Multiplexados

Summary

Desde a descoberta do gene da proteína fluorescente verde, as proteínas fluorescentes têm impactado a biologia celular molecular. Este protocolo descreve como a expressão de proteínas fluorescentes distintas por meio da engenharia genética é usada para codificar células individuais. O procedimento permite rastrear populações distintas em uma mistura de células, o que é ideal para aplicações multiplexadas.

Abstract

Proteínas fluorescentes, corantes fluorescentes e fluoróforos em geral revolucionaram o campo da biologia celular molecular. Em particular, a descoberta de proteínas fluorescentes e seus genes permitiu a engenharia de fusões de proteínas para localização, a análise da ativação transcricional e tradução de proteínas de interesse ou o rastreamento geral de células individuais e populações de células. O uso de genes de proteínas fluorescentes em combinação com a tecnologia retroviral permitiu ainda a expressão dessas proteínas em células de mamíferos de maneira estável e confiável. Aqui é mostrado como se pode utilizar esses genes para dar às células dentro de uma população de células sua própria bioassinatura. Como a bioassinatura é alcançada com a tecnologia retroviral, as células são codificadas com código de barras 'indefinidamente'. Como tal, eles podem ser rastreados individualmente dentro de uma mistura de células com código de barras e utilizados em aplicações biológicas mais complexas. O rastreamento de populações distintas em uma mistura de células é ideal para aplicações multiplexadas, como a descoberta de drogas contra uma infinidade de alvos ou o perfil de ativação de diferentes promotores. O protocolo descreve como desenvolver e amplificar elegantemente células de mamíferos com código de barras com marcadores fluorescentes genéticos distintos e como usar vários marcadores ao mesmo tempo ou um marcador em diferentes intensidades. Finalmente, o protocolo descreve como as células podem ser utilizadas em combinação com ensaios baseados em células para aumentar o poder de análise por meio da multiplexação.

Introduction

Tecnologias como a espectroscopia de fluorescência, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo, todos dependem de fluorescência, uma propriedade amplamente explorado em aplicações bioquímicos, biomédicos e químicos. A fluorescência, quer intrínseca ou por meio de rotulagem, tem sido explorada para a análise dos padrões de expressão de proteína, e os perfis de destino celular, as interacções proteína e funções biológicas ^1-9, e através de fluorescência / Förster transferência de energia de ressonância para a detecção de interacções biomoleculares e alterações conformacionais ^10-13. Uma vez que o isolamento da proteína fluorescente verde <....

Protocol

1. Preparação de células de mamíferos, Produção Viral e Transdução de Código de Barras Genetic

1. Placa de 2,5 x 10 ⁶ culas aderentes em uma placa de 10 cm (ou seja, cerca de 50-60% de confluência) um dia antes da transfecção em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal de vitelo (FCS). Para uso em produção de embalagens de células-line retroviral de escolha, como Phoenix-GP (a simpática oferta do Gary Nolan, da Universidade de Stanford).
   NOTA: A linha celular de empacotamento expressa estavelmente proteínas gag e pol para a formação de partículas retrovirais em trans. Adicione certeza células são saudáveis ....

Results

Multiplexing fluorescente células geneticamente barcoded para a finalidade de aplicações biológicas só pode ser alcançado quando as populações clonais individuais foram gerados. Multiplexing é mais eficaz quando as populações códigos de barras têm características distintas fluorescentes claras com sobreposição espectral mínima. O exemplo mostrado na Figura 1 com populações clonais de células de mamífero SupT1 ilustra que as células com o código de barras mCherry e proteína fluorescente ciano (PCP) podem.......

Discussion

Aqui dois procedimentos bem estabelecidos foram combinados; através de tecnologia de engenharia genética retroviral e detecção de proteínas fluorescentes utilizando citometria de fluxo. Fluorescent barcoding genética à base de proteínas para a produção de linhagens de células únicas fornece uma maneira simples e robusta para aplicações multiplexados. Geração de células geneticamente modificadas com código de barras por meio da tecnologia retroviral, é inicialmente um processo demorado, mas permite a obtenção de, uma vez.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringas de 10 ml	BD	309604	usadas para filtrar o vírus
0,45 µ m filtro de ploytetrafluoretileno	Pall Corporation	4219	usado para filtrar o vírus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	meios de crescimento celular para células HEK 293T
PEI (Polietilenomina)	poly sciences	23966-2	concentração de 2 mg / ml usada
Centrífuga de balde suspenso (refrigerada)	Eppendorf	5805 000.017	usado para infecção por spin
PBS (solução salina tamponada com fosfato)	Corning	21-040-CV	usado para lavagem de células
Polybrene (brometo de hexadimetrinon)	Sigma-Aldrich	107689	Usado para aumentar a eficiência da infecção viral. Usado em um 5 µ g/ml.
Instrumento FACSAria	BD Biosciences		usado para classificar populações de células
FACSCanto	BD Biosciences		instrumento usado para análise celular
Phoenix-GP	Gift da linha celular Gary Nolan		usado para produzir partículas retrovirais Soro
fetal de bezerro	Mediatech	MT35015CV	usado para crescimento celular e classificação de
células SupT1	ATCC	CRL-1942	Linfoblastos T humanos
Células HEK 293T	ATCC	CRL-11268	Células renais embrionárias humanas que também contêm o grande antígeno T SV40
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	meio de crescimento celular para células SupT1