A primeira parte deste artigo mostra como selecionar linhagens celulares mutantes que expressam trocadores vesiculares de Na+/H+ em sua membrana plasmática. A segunda parte fornece protocolos baseados em medições de pH intracelular e rápida absorção de íons, que são usados para determinar a seletividade de íons e os parâmetros cinéticos desses trocadores.
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Artigo de método
Caracterização funcional de Na
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Acidificação endossomal é crítica para uma vasta gama de processos, tais como a reciclagem e degradação de proteínas, dessensibilização do receptor e neurotransmissor em vesículas sinápticas carregamento. Esta acidificação é descrito para ser mediada por ATPases de protões, acoplados a transportadores de cloreto clc. Altamente conservada prótons electroneutral transportadores, do Na + / H + trocadores (NHE) 6, 7 e 9 também são expressos nestes compartimentos. As mutações nos seus genes foram ligados com doenças cognitivas e doenças neurodegenerativas humanas. Paradoxalmente, seus papéis são ainda imperceptíveis, como a sua localização intracelular impediu a caracterização funcional detalhado. Este manuscrito apresenta um método para resolver este problema. Esta consiste na selecção de linhas de células mutantes, capazes de sobreviver a acidificação citosólica aguda retendo NHE intracelular na membrana plasmática. Em seguida, ele mostra dois protocolos complementares para medir a seletividade e atividade iondestes permutadores de: (i) uma base em medições de pH intracelular por meio de microscopia de fluorescência de vídeo, e (ii) uma base na cinética de absorção rápida de lítio. Esses protocolos podem ser extrapolados para medir outros transportadores não-electrogénico. Além disso, o processo de selecção aqui apresentada gera células com um fenótipo de retenção intracelular defeituosa. Por conseguinte, estas células expressam também outras proteínas da membrana vesicular na membrana plasmática. A estratégia experimental descrito aqui pode, portanto, constituir um instrumento potencialmente poderoso para estudar outras proteínas intracelulares que será, então, expressa na membrana plasmática vesicular, juntamente com o Na + / H + permutadores utilizados para a selecção.
Introdução
A maioria dos compartimentos intracelulares exibir um pH luminal ácida, o que é um parâmetro essencial para a maturação, o tráfico, a reciclagem de proteínas ou hormônios e neurotransmissores que carregam. Tem sido demonstrado que o gradiente de pH entre o teor de citosol e vesicular é gerado por vacuolar H + ATPase 1, acoplado aos transportadores vesiculares cloreto clc 2. Tanto em camundongos knock-out (KO) e pacientes humanos, a importância desses transportadores tem sido destacada pelos fenótipos pesados causadas por mutações em seus genes 3-6.
Os membros da família SLC9A permutadores de s....
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Protocolo
1. H + Matar Seleção
- As linhas celulares
- Estavelmente NHE-transfectar células deficientes (por exemplo, a linha celular derivada de CCL39 PS120 16) usando qualquer combinação de vector de expressão de mamífero e transfecção método que produza rendimentos eficientes de transfecção e selecção numa linha de células de fibroblastos.
NOTA: Para muitos anos de Fosfato de Cálcio precipitação 19 foi utilizado com bons rendimentos de transfecção. Este foi substituída mais recentemente por reagentes comerciais, tais como Lipofectamine2000, as transfecções ser realizadas seguindo as instruções do fabricante. <....
- Estavelmente NHE-transfectar células deficientes (por exemplo, a linha celular derivada de CCL39 PS120 16) usando qualquer combinação de vector de expressão de mamífero e transfecção método que produza rendimentos eficientes de transfecção e selecção numa linha de células de fibroblastos.
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Resultados
Seleção:
A selecção H + matando baseia-se na difusão da amónio base fraca, tal como representado na Figura 1A. O efeito de bases fracas e ácidos difusão no pH intracelular foi iniciada por Walter Boron e colaboradores 22. A idéia elegante para usar este fenômeno para produzir uma acidificação letal para a seleção genética positiva foi então desenvolvido por Jacques Pouysségur 17. De acordo com um protocolo deste tipo, o pH intracelular cai pa.......
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Discussão
Este protocolo descreve como para seleccionar células que expressam intracelular de Na + / H + permutadores na membrana plasmática, sem alterar a sua sequência primária por mutagénese dirigida ao local. Estes trocadores de agora pode ser caracterizado.
Este método baseia-se na toxicidade celular de protões intracelulares para seleccionar linhas celulares que expressam vesicular de Na + / H + permutadores na membrana plasmática. Pode ser possível, e.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores estão profundamente gratos a todos os membros da comunidade científica que trabalham com pH e transporte de íons, que originaram e aprimoraram as medições descritas aqui. Eles agradecem particularmente ao Dr. Jacques Pouysségur, que originou a técnica de seleção de eliminação de H+ usada aqui. Eles agradecem à Universidade de Nice-Sophia Antipolis, ao CNRS, ao ANR (JCJC SVSE1 NHEint) e ao ICST Labex pelo apoio.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| padrão de cultura de células | Usado para seleção de eliminação de H+ composta por muitos dispositivos com diferentes números de catálogo | ||
| Incubadora com CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubadora sem CO2 | Heraeus instrumento | BB6220 | |
| Capa de fluxo laminar PSM1200NF | Fisher | ||
| DMEM sigma médio | D5796 | ||
| FBS ouro | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilina/estreptomicina | PAA | P11-010 | |
| Tripsina 10x | PAA | L11-003 | |
| Espectrômetro de absorção atômica com sistema de forno Zeeman | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Ácido Nítrico | sigma | 438073 | |
| Conjunto de videomicroscopia de fluorescência | Leica | Composto por muitos dispositivos com diferentes números de catálogo | |
| Microscópio automatizado invertido | Leica | DMI6000B | |
| suporte para microscópio | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11888377 | |||
| fluorescência incidente | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| suporte do motor | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| Luz de transmissão LED | Leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| placa | |||
| 11531172 | |||
| 11521734 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| Saída da câmera | Leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| software de aquisição/análise de imagens | Leica | 11888375 | |
| óptica | leica | 11506507 | |
| 11506243 11506203 | |||
| fluorescência Lâmpada de xenônio | câmera DMI6000 leica | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor | 11640905 | ||
| sonda sensível ao PH, BCECF-AM | tecnologias de vida | B1170 | |
| Nigericina | Sigma | N7143 |
Referências
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CL....
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Reimpressões e permissões
