Caracterização funcional de Na + / H + Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática

Resumo

A primeira parte deste artigo mostra como selecionar linhagens celulares mutantes que expressam trocadores vesiculares de Na⁺/H⁺ em sua membrana plasmática. A segunda parte fornece protocolos baseados em medições de pH intracelular e rápida absorção de íons, que são usados para determinar a seletividade de íons e os parâmetros cinéticos desses trocadores.

Resumo

Acidificação endossomal é crítica para uma vasta gama de processos, tais como a reciclagem e degradação de proteínas, dessensibilização do receptor e neurotransmissor em vesículas sinápticas carregamento. Esta acidificação é descrito para ser mediada por ATPases de protões, acoplados a transportadores de cloreto clc. Altamente conservada prótons electroneutral transportadores, do Na ⁺ / H ⁺ trocadores (NHE) 6, 7 e 9 também são expressos nestes compartimentos. As mutações nos seus genes foram ligados com doenças cognitivas e doenças neurodegenerativas humanas. Paradoxalmente, seus papéis são ainda imperceptíveis, como a sua localização intracelular impediu a caracterização funcional detalhado. Este manuscrito apresenta um método para resolver este problema. Esta consiste na selecção de linhas de células mutantes, capazes de sobreviver a acidificação citosólica aguda retendo NHE intracelular na membrana plasmática. Em seguida, ele mostra dois protocolos complementares para medir a seletividade e atividade iondestes permutadores de: (i) uma base em medições de pH intracelular por meio de microscopia de fluorescência de vídeo, e (ii) uma base na cinética de absorção rápida de lítio. Esses protocolos podem ser extrapolados para medir outros transportadores não-electrogénico. Além disso, o processo de selecção aqui apresentada gera células com um fenótipo de retenção intracelular defeituosa. Por conseguinte, estas células expressam também outras proteínas da membrana vesicular na membrana plasmática. A estratégia experimental descrito aqui pode, portanto, constituir um instrumento potencialmente poderoso para estudar outras proteínas intracelulares que será, então, expressa na membrana plasmática vesicular, juntamente com o Na ⁺ / H ⁺ permutadores utilizados para a selecção.

Introdução

A maioria dos compartimentos intracelulares exibir um pH luminal ácida, o que é um parâmetro essencial para a maturação, o tráfico, a reciclagem de proteínas ou hormônios e neurotransmissores que carregam. Tem sido demonstrado que o gradiente de pH entre o teor de citosol e vesicular é gerado por vacuolar H ⁺ ATPase ^1, acoplado aos transportadores vesiculares cloreto clc ^2. Tanto em camundongos knock-out (KO) e pacientes humanos, a importância desses transportadores tem sido destacada pelos fenótipos pesados ​​causadas por mutações em seus genes ^3-6.

Os membros da família SLC9A permutadores de sódio a hidrogénio, também denominado por NHE de Na ⁺ / H ⁺ permutadores, demonstraram ser importantes efectores no pH intracelular e regulação do volume celular, bem como no transporte vectorial de equivalentes de ácido-base entre epitélios . Além dos NHE da membrana plasmática, três altamente conservada de Na ⁺ / H ⁺ permutadores de NHE 6, 7e 9 são fixados em rede trans-Golgi e no início endosomes ^7. As mutações em seus genes têm sido associados com Angelman-like ou Christianson Síndromes ^8-9, autismo base familiar ¹⁰ e Attention Deficit Disorder Hiperatividade ^11-12. Estes trocadores também foram envolvidos em problemas neurodegenerativas, como Alzheimer susceptibilidade à doença ¹³ e retardo mental genes contíguos X-ligados síndromes ^14. Tomados em conjunto, estes estudos destacam a importância desses NHEs intracelulares no desenvolvimento e / ou a função cerebral.

A localização intracelular destes trocadores impede medições precisas de sua seletividade ion, direcção de transporte, parâmetros cinéticos, e regulamentação. Como é o caso para todos os transportadores expressos em compartimentos intracelulares, que é extremamente difícil de avaliar as suas actividades bioquímicas e, consequentemente, para compreender totalmente os seus papéis fisiológicos e o mechanismos subjacente suas implicações patológicas. Para a concentração de K ⁺ cytosolic alta, a hipótese mais comumente aceita era de que eles estavam trabalhando como K ⁺ acoplados transportadores de efluxo de prótons. A existência de uma tal fuga de protões tinham sido implicado, como pode contrabalançar bombeamento de protões pelos V-ATPase, a fim de manter um pH vesicular estado estacionário. O objectivo deste artigo visual é (i) para demonstrar um método que permite a selecção genética de linhas celulares que expressam estes transportadores vesiculares na sua membrana plasmática, e (ii) mostram duas abordagens independentes para medir as funções destes transportadores.

Três décadas atrás, Pouysségur e Franchi foram pioneiras na abordagem genética que permitiu a clonagem molecular e caracterização dos membros da família NHE ^15. Este baseou-se na toxicidade de protões intracelulares, como um método de rastreio. O primeiro passo foi a obtenção de linhas celulares deficientesem qualquer troca ⁺ / H ⁺ Na expresso na membrana plasmática, usando a reversibilidade deste transportador. Os fibroblastos (linha celular CCL39) foram pré-carregado com Na ⁺ ou Li ⁺ e, em seguida, colocado num meio extracelular ácida (pH 6,5) durante 2 h. Isto levou à morte de células que expressam um funcional de Na ⁺ / H ⁺ e para a troca de selecção de células antiportador-deficiente (linha celular PS120 ^16). Quando cultivado em meio isento de bicarbonato, estas células são muito sensíveis à acidificação intracelular aguda. Por conseguinte, a expressão de qualquer mecanismo de efluxo de protões funcional na membrana de plasma vai ser seleccionadas positivamente (ver ^17), se tais células são submetidas a acidifications intracelulares agudas. Tais técnicas de acidificação pode ser utilizado para isolar as linhas celulares com defeitos tráfico que permitam a expressão forçada de NHE intracelulares WT na membrana plasmática.

Como eucariota Na ⁺ / H⁺ Trocadores são electroneutral, eles não são mensuráveis ​​pelas abordagens eletrofisiológicos que têm sido utilizados com grande sucesso para medir canais. Assim, o presente artigo propõe demonstrar como medir a atividade desta trocador por medições de pH intracelulares e rápida cinética de absorção de lítio. Como os conceitos subjacentes são o mesmo, é interessante notar que muitos dos processos desenvolvidos para a secção de selecção, também são utilizados directamente para medições funcionais.

Curiosamente, observou-se que o defeito tráfico presentes nas linhas de células seleccionadas utilizando a abordagem descrita neste manuscrito conduz a uma maior expressão de outras proteínas vesiculares na membrana do plasma, tais como o canal de potássio vesicular TWIK1 ^18. Isso aponta para a seleção de um mecanismo geral defeito de retenção de proteínas transmembrana vesiculares. Assim, este processo de selecção e as células que gera Maioconstituem uma ferramenta promissora para a comunidade científica que trabalha em proteínas da membrana de compartimentos intracelulares. Como bem as técnicas de medição apresentados aqui podem ser aplicáveis ​​para o estudo de outros transportadores não-electrogénico.

Protocolo

1. H ⁺ Matar Seleção

1. As linhas celulares
   1. Estavelmente NHE-transfectar células deficientes (por exemplo, a linha celular derivada de CCL39 PS120 ¹⁶⁾ usando qualquer combinação de vector de expressão de mamífero e transfecção método que produza rendimentos eficientes de transfecção e selecção numa linha de células de fibroblastos.
      NOTA: Para muitos anos de Fosfato de Cálcio precipitação ¹⁹ foi utilizado com bons rendimentos de transfecção. Este foi substituída mais recentemente por reagentes comerciais, tais como Lipofectamine2000, as transfecções ser realizadas seguindo as instruções do fabricante.
2. Soluções
   1. Preparar três soluções estéreis descritos como abaixo. Esteriliza-se estas soluções por meio de filtração (0,22 um).
      1. Prepara-se uma _NH4 ⁺ Carregando solução (pH 7,4) composto por 50 mM de _NH4Cl, 70 mM de cloreto de colina, 5 mM de KCl, 1 mM de _MgCl2, 2 mM de CaCl _2, 5 mM de glucose e 15 mM de MOPS a pH 7,4.
      2. Prepara-se uma solução de lavagem (pH 7,0) composta por 120 mM de cloreto de colina, 5 mM de KCl, 1 mM de _MgCl2, 2 mM de CaCl _2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,0.
      3. Prepara-se uma solução de recuperação (pH 7,4) composto por NaCl 120 mM, KCl 5 mM, _MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl _2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4.
3. Antes de iniciar a selecção, obter uma incubadora de cultura de células que pode ser utilizado a 37 ° C sem adicional de CO ₂ a partir _do tanque externo (denominado CO ₂ - incubadora "livre"), como 5% de CO ₂ resultará na memória intermédia que pode prejudicar o acidificação. Amplificar a linha celular que expressa o NHE de interesse até cerca de 2 x 10 ⁸ células (tipicamente cerca de 20 100 placas confluentes mm).
4. H ⁺ matando procedimento:
   1. Incubar as células que expressam o NHE intracelular de interesse durante 1 hora em solução a carregar, em 37 ° C na incubadora de CO ₂ -livre.
   2. Aspirar a solução de carga e, em seguida, lave-os duas vezes na solução descrita-rinse acima. Executar esta etapa eficiente para eliminar o residual extracelular _NH4Cl que prejudicaria a criação de um gradiente de NH ₄ ⁺ íngreme que irá gerar a acidificação.
   3. Elimine o meio por aspiração e lavagem incubar as células durante uma hora em solução de recuperação de novo a 37 ° C na incubadora de CO ₂ livre.
   4. Substituir o meio de recuperação com meio de cultura normal (tipicamente DMEM com 7,5% de FCS) e as células crescer em condições de cultura padrão (37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO ₂ e 95% de ar).
5. Repetir este ciclo de selecção, duas vezes por semana, até surgir clones estáveis.
   NOTA: Tome especial cuidado relativo à cultura de células e condições de seleção. Meses de trabalho pode ser arruinada por qualquer contaminação que é mais propenso a oCCur após um longo período de cultura de células e manipulações repetidas.
   1. Aqui, escolha se deseja ampliar os clones e caracterizá-los individualmente conforme descrito nas seções 2-3, ou reuni-los em conjunto para gerar uma população celular antes de caracterização.
6. Aplicar a selecção ocasional (cerca de uma vez a cada duas semanas) para reter as células resistentes à acidificação por contra-selecionar aqueles que podem ter revertido para o sensível ao ácido fenótipo parental (Figura 1B).

2. As medições de pH intracelular

2.1) Imagem de Fluorescência pH

1. Use a ratiometric sensíveis ao pH de corante fluorescente BCECF / AM, que é sensível ao pH quando excitado a 490 nm e possui uma nm ponto isosbestic 445, seguindo os protocolos do fabricante.
   1. Em alternativa, utilizar outras sondas sensíveis ao pH, seguindo os protocolos do fabricante.
2. Use um con imagem definidasisting de um microscópio invertido acoplado a uma câmera de vídeo de alta sensibilidade. Equipar este conjunto com 450 nm e 490 nm filtros de interferência de banda estreita emparelhados com quartzo adequado filtros de densidade neutra para a excitação.
   1. Se possível, use o conjunto adequado de filtros e condições de iluminação para configuração valores de fluorescência comparáveis ​​para λ1 e λ2 para que a relação se aproxima de 1. Além disso, evite valores de fluorescência basais que são definidas quer saturar ou muito baixa, tanto para λ1 e / ou λ2. Isso pode produzir artefatos importantes como então a relação pode não foi detectável embora pH intracelular está mudando.
      NOTA: Este sistema deve habilitar perfusão rápida, a excitação de lapso de tempo para os dois comprimentos de onda acima mencionados e aquisição no comprimento de onda de emissão própria (535 nm para BCECF). Equipar o sistema com software que permite a aquisição de dados automática e armazenamento.

2.2) A medição do NHE Atacante Atividade (Extrusão dePrótons do citosol)

1. Acidifica-se as células por uma incubação de 1 h na solução de NH ₄ ⁺ Carregando (ver passo 1.4), na ausência de CO _2.
2. Adicionar BCECF-AM (5 mM concentração final) para a solução para os últimos cinco minutos e, em seguida, lave-o com NH ₄ ⁺ solução de carga para eliminar a sonda extracelular.
3. Montar as células no microscópio e tomar várias imagens para gravar uma linha de base estável. Perfundir a solução de lavagem (ver acima). Isto resulta numa queda da fluorescência correspondente à acidificação.
4. Após a estabilização do pH, perfuse qualquer uma das soluções a seguir para medir as taxas de recuperação de pH mediadas por Li ⁺ / H ^+, Na ⁺ / H ⁺ ou K ⁺ / H ⁺ câmbio. Cada solução contém um potencial catião de acoplamento para ser testado para a troca de H ^+. Se um desses é transportado, isto irá resultar em um aumento de fluorescência a 495 nm que correspgundo a um aumento no pH intracelular:
   LiCl 120 mM, KCl 5 mM, _MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl _2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4
   120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de _MgCl2, 2 mM de CaCl _2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4
   KCl 125 mM, _MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl _2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4

2.3) A medição do NHE Atividade Reversa

NOTA: O princípio aqui é inverter os gradientes iônicos transmembrana.

1. Antes da medição, carregar as células com o catião intracelular de interesse (ver abaixo).
2. Incubar-los por 5 min com BCECF / AM (veja o passo 2.2.2); lavá-los, montá-los no microscópio vídeo.
3. Perfundir a solução de carga e tomar várias imagens para gravar uma linha de base estável.
4. Depois da estabilização da linha de base, a imagem das variações de pH quando as células são perfundidos com um meio ácido extracelular contendo 120 mCloreto de colina M, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl _2, CaCl 2 ₂ mM, 5 mM de glicose e 15 mM de MES a pH 6,5.
5. Para LiCl carregamento, as células incubar durante 2 horas em uma solução composta de LiCl 120 mM, KCl 5 mM, _MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl _2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4. Lítio intracelular medido por espectroscopia de absorção atómica gera um valor de cerca de 60 mM.
6. Para carregamento de Na ^+, incubar as células durante duas horas numa solução composta por 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de _MgCl2, 2 mM de CaCl _2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4 na presença de 1 mM de ouabaina para bloquear a bomba de Na / K ATPase. Nestas condições, a concentração intracelular de Na ⁺ está na gama de 40 mM.
   NOTA: K ⁺ de carga não é necessário, como K ⁺ citosólico concentração está na gama de 140 mM e um gradiente dirigido exteriormente-K +, por conseguinte, é fácil de conseguir.

2.4) Tratamento e calibração de dados:

NOTA: Este passo é válido tanto para as medições frente e verso.

1. No final de cada experiência, perfundir as células com uma solução de KCl 140 mM, HEPES 20 mM e 5 uM nigericina ajustado a valores de pH entre 6,5 e 7,4.
2. Coletar dados como medições de fluorescência a partir das imagens (níveis de cinza que representam os níveis de intensidade) e exportação nos termos do formato de texto e tratar como explicado abaixo usando um programa de planilha.
3. Calcular os valores de pH intracelular para cada célula ou região de interesse utilizando a seguinte equação individual:
   pH = pKa + (Log (R-R min) / (R _max -R)) x F _{min (λ2)} / F _{max (λ2)}
4. Utilizar a _min F _(λ2) / F _{x ma (λ2)} proporção, se houver fuga de branqueamento ou sonda, resultando numa diminuição na fluorescência a 450 nm ao longo das experiências. Esta é no entanto muito raramente observada nas condições utilizadas no desexperimentos crita.
5. À medida que os dados de calibração estão presentes no final de cada medição de pH, verificar se os valores calculados que correspondem diferentes dos valores de pH utilizados para a calibração. Se for o caso, em seguida, ajustar todos os valores de pH experimentalmente-determinados para a calibração utilizando o seguinte procedimento:
   1. Calcula-se o seguinte quociente (Q, a diferença entre os valores medidos / diferença entre os valores de calibração). Multiplique todo o conjunto de dados por Q. fazer o ajuste final por adição ou subtração de modo que os valores calculados serão iguais aos valores de calibração correspondentes.

3. Medidas de taxas iniciais do NHE7 pelo FAST Li ⁺ Captação

1. Semear as células em placas de múltiplos poços (6 a 24 poços) e acidificam-los usando a técnica de NH ₄ ⁺ carregamento descrito acima ou, alternativamente, o / albumina de soro bovino (BSA) a acidificação nigericina descrito em ^20.
2. placas de enxaguamento duas vezes rapidamente com a solução de lavagem acima descrito e, em seguida, incubar as células em soluções de absorção que contêm 1-10 mM de lítio (ligeiramente abaixo) os valores Km e as concentrações desejadas dos catiões e / ou inibidores de interesse para a quantidade desejada de tempo.
3. Manter durações de captação de curto e consistentes (tipicamente um minuto ou abaixo) para garantir que o transporte opera em condições de taxas iniciais. Também certifique-se de que todas as soluções utilizadas para a captação são isotônicas.
4. No final do tempo de absorção, eliminar cuidadosamente a forma absorção e lavar as células quatro vezes com solução salina de fosfato gelada tamponada (PBS). Realizar estas lavagens tão rápido quanto possível (menos de 10 seg para os quatro deles é ideal) para evitar o efluxo de lítio.
5. Lisar as células em 25% de ácido nítrico. Aplicar 250 ul por poço de 25% de ácido nítrico e deixá-lo assentar durante pelo menos 1 h, em seguida, cada poço de sucata com a extremidade da ponta da pipeta e transferir toda a suspensão bem em um novo mitubo crocentrifuge.
6. Transferir o lisado em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, centrifugar-los durante 5 minutos a 15.000 x g (temperatura ambiente), para remover os detritos celulares.
7. Medir a quantidade de lítio do sobrenadante por espectroscopia de absorção atômica ^21.
   NOTA: Diferentes empresas fornecem espectrometria de absorção atômica, que têm de ser equipado com uma lâmpada de cátodo oco de lítio. Siga as instruções do fabricante como essas máquinas são muito precisos, mas também bastante delicado.

Resultados

Seleção:

A selecção H ⁺ matando baseia-se na difusão da amónio base fraca, tal como representado na Figura 1A. O efeito de bases fracas e ácidos difusão no pH intracelular foi iniciada por Walter Boron e colaboradores ^22. A idéia elegante para usar este fenômeno para produzir uma acidificação letal para a seleção genética positiva foi então desenvolvido por Jacques Pouysségur ^17. De acordo com um protocolo deste tipo, o pH intracelular cai pa...

Discussão

Este protocolo descreve como para seleccionar células que expressam intracelular de Na ⁺ / H ⁺ permutadores na membrana plasmática, sem alterar a sua sequência primária por mutagénese dirigida ao local. Estes trocadores de agora pode ser caracterizado.

Este método baseia-se na toxicidade celular de protões intracelulares para seleccionar linhas celulares que expressam vesicular de Na ⁺ / H ⁺ permutadores na membrana plasmática. Pode ser possível, e...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
		padrão de cultura de células	Usado para seleção de eliminação de H+ composta por muitos dispositivos com diferentes números de catálogo
Incubadora com CO2	Sanyo	MCO15A
Incubadora sem CO2	Heraeus instrumento	BB6220
Capa de fluxo laminar PSM1200NF	Fisher
DMEM sigma médio		D5796
FBS ouro	GE Healthcare	A15-151
Penicilina/estreptomicina	PAA	P11-010
Tripsina 10x	PAA	L11-003
Espectrômetro de absorção atômica com sistema de forno Zeeman	Thermo Scientific	ICE 3500 GFZ
LiCl	sigma	L4408
Ácido Nítrico	sigma	438073
Conjunto de videomicroscopia de fluorescência	Leica		Composto por muitos dispositivos com diferentes números de catálogo
Microscópio automatizado invertido	Leica	DMI6000B
suporte para microscópio	leica	11888906
		11888911
		11888377
fluorescência incidente	leica	11888901
		11504166
suporte do motor	leica	11888379
		11505234
		11521505
		11522106
Luz de transmissão LED	Leica	8097321
		8102034
		placa
		11531172
		11521734 11521719
		11888423
Saída da câmera	Leica	11888373
		11507807
		11888393
		11888259
		11888258
		11541510
software de aquisição/análise de imagens	Leica	11888375
óptica	leica	11506507
		11506243 11506203
fluorescência Lâmpada de xenônio	câmera DMI6000 leica	8100601
metafluor/Mmfluor		11640905
sonda sensível ao PH, BCECF-AM	tecnologias de vida	B1170
Nigericina	Sigma	N7143