Análise das Alterações Gene expressão no Rat Hippocampus Após Estimulação Cerebral Profunda do Anterior Thalamic Nucleus

Resumo

O mecanismo subjacente aos efeitos terapêuticos da cirurgia de Estimulação Cerebral Profunda (DBS) precisa de investigação. Os métodos apresentados neste manuscrito descrevem uma abordagem experimental para examinar os eventos celulares desencadeados pela ECP, analisando o perfil de expressão gênica de genes candidatos que podem facilitar a neurogênese pós-cirurgia de ECP.

Resumo

A estimulação cerebral profunda (DBS) cirurgia, tendo como alvo várias regiões do cérebro, como os gânglios basais, tálamo e regiões subtalâmico, é um tratamento eficaz para vários distúrbios de movimento que não conseguiram responder à medicação. Os progressos recentes no campo da cirurgia DBS começou a alargar a aplicação desta técnica cirúrgica para outras condições tão diversas como obesidade mórbida, depressão e transtorno obsessivo compulsivo. Apesar dessas indicações em expansão, pouco se sabe sobre os mecanismos fisiológicos subjacentes que facilitam os efeitos benéficos da cirurgia DBS. Uma abordagem a esta questão é a realização de análise de expressão gênica em neurônios que recebem a estimulação elétrica. Estudos anteriores demonstraram que a neurogénese no giro dentado de ratos é induzida em DBS segmentação do núcleo anterior do tálamo ^1. Cirurgia DBS visando a ATN é amplamente utilizado para o tratamento da epilepsia refratária. É, portanto, de muito interest para nós para explorar as mudanças de transcrição induzidos ao estimular eletricamente o ATN. Neste artigo, são apresentadas as nossas metodologias para estereotaxicamente-guiada cirurgia DBS visando a ATN em ratos Wistar machos adultos. Discutimos também as etapas subseqüentes para dissecção dos tecidos, o isolamento do RNA, a preparação de cDNA e RT-PCR quantitativo para medir as mudanças de expressão gênica. Este método pode ser aplicado e modificado para estimular os gânglios da base e em outras regiões do cérebro normalmente clinicamente alvo. O estudo de expressão gênica descrito aqui assume uma abordagem gene alvo candidato para descobrir jogadores moleculares que poderiam ser direcionando o mecanismo para DBS.

Introdução

A história por trás do desenvolvimento de estimulação profunda do cérebro como uma técnica neurocirúrgica remonta à década de 1870, quando a possibilidade de estimular eletricamente o circuito cerebral foi explorada ^2. O uso da estimulação de alta frequência crônica como tratamento para distúrbios neuronais começou na década de 1960 ^3. Mais tarde, na década de 1990, com o advento de eléctrodos de implantação crónica de DBS ^4-6, o número de distúrbios neuronais que foram tratados por DBS continuou a aumentar. A estimulação cerebral profunda foi usado pela primeira vez nos Estados Unidos como um tratamento para o tremor essencial ^6....

Protocolo

Declaração de Ética: NOTA: Todos os procedimentos descritos neste manuscrito estão em conformidade com as diretrizes do NIH para Pesquisa Animal (Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório) e são aprovados pelo Comitê IACUC Escola de Medicina de Harvard.

Preparação 1. Pré-cirúrgica

1. Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos são esterilizados por autoclave ou seja pela limpeza com a solução e / ou etanol anti-séptico, conforme necessário. Sempre que possível, use o material descartável estéril como bisturis, agulhas e seringas.
2. Cobrir a bancada de trabalho com campos cirúrgicos e garantir que não é ....

Resultados

As Figuras 1A e 1B mostram a expressão relativa de BDNF e GABRD em relação ao controlo do gene da β-actina. BDNF, uma neurotrofina é freqüentemente associada com efeitos neuroprotetores em muitas doenças neuronais ^38-41. Por isso, é interessante analisar o perfil de BDNF expressão em resposta à estimulação da ATN que rende benefícios terapêuticos para doentes epilépticos. Na Figura 1A, que mostra o perfil de expressão gênica de BDNF entre os pontos temporais .......

Discussão

Após o trabalho de Marco por Benabid et al. Em usar estimulação cerebral profunda para tratar a doença de Parkinson e tremor essencial, a técnica cirúrgica DBS foi investigado com muito interesse ao longo da última década para tratar vários distúrbios neurológicos ^6,10,43. DBS estudos que visam várias regiões neuro-anatômica dos circuitos cerebrais são atualmente realizados por vários grupos para abordar as principais doenças neuronais e estão em várias fases de ensaios clínicos. A estimulação do núc.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
			de Estimulação Cerebral
Profunda Quadro Estereotáxico	Kopf Instruments	Modelo 900
Broca	Dremmel	7700, bisturi de 7,2 V
	BD	372610
Cetamina	Patterson Veterinária	07-803-6637	Anexo III Substância Controlada, aquisição, uso e armazenamento de acordo com as regras institucionais
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Anexo III Substância Controlada, aquisição, uso e armazenamento de acordo com as regras institucionais
Grampos cirúrgicos	ConMed Corporation	8035
Suturas (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Seringa (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Estéril, uso para administração de anestesia por via intraperitoneal
Seringa (3 ml, 25 G)	BD	309570	Estéril, uso para administração de analgesia por via subcutânea
Agulhas	BD	305761	Estéril, uso para limpar pedaços de ossos quebrados dos orifícios de rebarbas
Etanol	Fisher Uso científico	S25309B	para esterilização geral
Lubrificante para os Olhos	Fisher Scientific	19-898-350
Estimulador	Medtronic	Modelo 3628
Eletrodos DBS	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100 mm	Os eletrodos são de platina, concêntricos e bipolares
Betadine (Povidona-Iodo)	PDI	S23125	Swabsticks de uso único, use para esterilizar o couro cabeludo antes de fazer a incisão
Isolamento do tecido do Cérebro e Isolamento
Microscopia Eletrônica	Matriz Cerebral de Roedores Acrílicos	Ciências 175-300 www.emsdiasum.com
Lâmina de Barbear	V W R	55411-050
Tesoura de Guilhotina	Clauss	18039	Para decapitação, certifique-se de que estas tesouras são mantidas em condições limpas e de funcionamento
Tesoura	Codman Classic	34-4098	Use para remover o cérebro do crânio
Fórceps	Microscopia Eletrônica Ciências	72957-06	Use para remover o cérebro do crânio e para manuseio durante a dissecção
Tampolado com fosfato Salino	Boston Bioproducts	BM-220
Extração de RNA e preparação de
Tri Reagent	Sigma	T9424	Sempre use em uma capela de exaustão e use óculos de proteção durante o manuseio; evite contato com a pele
Seringa (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use para homogeneização de tecidos
Clorofórmio	Fisher Scientific	BP1145-1	Sempre use em uma capela de exaustão e use óculos de proteção durante o manuseio; evite contato com
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glicogênio	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Microcentrífuga de Mesa	Eppendorf	5415D
PCR quantitativo
Kit de PCR Verde SYBR	Qiagen	204143
Oligos	Invitrogen	10668051
Placas de PCR (96 poços)	ópticas Denville	Scientific C18080-10
livre de nuclease
Máquina de PCR de tempo	aplicada Biosystems	7500

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