Exame de Rapid dopamina Dynamics com Fast digitalização Voltametria Cíclica Durante Intra-oral Administração saborizante em ratos acordados

Summary

Flutuações rápidas na dopamina extracelular (DA) medeiam tanto o processamento de recompensas quanto o comportamento motivado em mamíferos. Este manuscrito descreve o uso combinado de voltametria cíclica de varredura rápida (FSCV) e administração intraoral de saborizantes para determinar como os saborizantes alteram a liberação rápida de dopamina em ratos acordados e em movimento livre.

Abstract

A liberação rápida e fásica de dopamina (DA) no cérebro de mamíferos desempenha um papel crítico no processamento de recompensas, aprendizado por reforço e controle motivacional. A voltametria cíclica de varredura rápida (FSCV) é uma técnica eletroquímica com alta resolução espacial e temporal (subsegundo) que tem sido utilizada para examinar a liberação fásica de DA em vários tipos de preparações. Experimentos in vitro em células únicas e fatias de cérebro e experimentos in vivo em roedores anestesiados têm sido usados para identificar mecanismos que medeiam a liberação e captação de dopamina em condições normais e em modelos de doenças. Nos últimos 20 anos, experimentos in vivo do FSCV em roedores acordados e em movimento livre também forneceram informações sobre os mecanismos dopaminérgicos no processamento e aprendizado de recompensas. Uma grande vantagem da preparação acordada e em movimento livre é a capacidade de examinar as flutuações rápidas do DA que estão bloqueadas no tempo para eventos comportamentais específicos ou para recompensar ou sugerir a apresentação. No entanto, uma limitação dos experimentos combinados de comportamento e voltametria é a dificuldade de dissociar os efeitos do DA que são específicos para estímulos primários recompensadores ou aversivos de flutuações concomitantes do DA que medeiam comportamentos direcionados à recompensa ou outros comportamentos motores. Aqui, descrevemos um método combinado usando FSCV in vivo e infusão intraoral em um rato acordado para investigar diretamente as respostas de DA a saborizantes orais. Nesses experimentos, os saborizantes orais são infundidos diretamente no paladar do rato - ignorando o comportamento direcionado à recompensa e o comportamento voluntário de beber - permitindo o exame direto das respostas do DA aos estímulos do saborizante.

Introduction

A liberação fásica do DA desempenha um papel importante na mediação do comportamento direcionado à recompensa ^[1-3]. No entanto, isolar e estudar como uma recompensa primária altera a liberação fásica de DA é muitas vezes complicado por processos comportamentais ou cognitivos concomitantes que também são capazes de alterar a liberação fásica de DA - como processos de tomada de decisão ou comportamento motor direcionado à recompensa para adquirir a recompensa. No presente trabalho, isolamos as respostas fásicas de DA a saborizantes por meio do uso de voltametria cíclica de varredura rápida in vivo (FSCV) combinada com entrega de saborizantes por mei....

Protocol

Todos os experimentos foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee da Universidade Yale (IACUC).

Preparativos 1) Pré-cirúrgicos

1. Preparação solução oral
   1. Criar soluções de sacarose a 10% e 0,005% de L-mentol em água desionizada (pH 7,4). Armazenar estas soluções em recipientes fechados, à TA, e refazer a cada 2 semanas, para evitar a degradação.
2. Soluções de calibração de eletrodo
   1. Adicione tampão Tris (pH 7,4) em qualquer momento antes da calibração. A s....

Results

FSCV combinado com implantação do cateter intra-oral foi usado para examinar como a sacarose, um saborizante appetitive, modula a liberação fásica DA no núcleo NAc. Antes da perfusão saborizante, a estimulação elétrica (150 mA, 60 Hz, 24 pulsos; indicado pela barra vermelha) do VTA produz aumentos robustos na liberação fásica DA no NAc (Figura 1) Figura 1 mostra um gráfico colorido com potencial diante. o eixo y, o tempo no eixo-x, e corrente (representada como falsa cor) no eixo z. Abaixo do gráfico co.......

Discussion

Entrega saborizante intra-oral combinado com FSCV permite a análise de "tempo real" respostas Da e aromatizantes orais. Existem três passos críticos no protocolo que são necessárias para as medições de DA bem sucedidas. Em primeiro lugar, a implantação adequada do cateter por via oral é crítica para o fornecimento de aromatizantes. Garantir que o cateter é inserido atrás do primeiro molar e encravado no lugar impede que o cateter de perder permeabilidade e impede a remoção acidental pelo animal. A lavagem do c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eléctrodo de estimulação	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	ao encomendar, solicite um corte de 22 mm abaixo do pedestal
Cânula para eléctrodo	BioAnalytical Systems	MD-2251
Sistemas A-M	capilares de vidro	624503
Fibra de carbono	Thornel	T650
Extrator de eléctrodos	Narishige International	PE-22
Isolador de estímulo Neurolog	Digitimer Ltd.	DS4
Fios	3M	FP-301
para eletrodos	Squires electronics	Custom	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	Univ. de Illinois em Chicago, Oficina de Máquinas	de Engenharia
Epóxi	ITW Devcon	14250	"5 minutos epóxi"
Copolímero de ácido perfluoro-3,6-dioxa-4-metil-7octeno-sulfônico e íon tetrafluoroetileno	Potência	LQ-1105	ou seja, Tinta Nafion
Silver	GC Electronics	22-023
Fonte de alimentação	BK Precision	9110
Tubulação para cateteres intra-orais	Intramedic	427426	PE 100, I.D. = 0,86 mm; O.D. = 1,52 mm
Tubo para infusão intra-oral	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Bomba de seringa para célula de fluxo	Pump Systems Inc.	NE 1000
Cimento cirúrgico	Dentsply Calafetar	675571 e 675572
Atuador de ar	VICI	A60	Interface de válvula digital de 6 posições
de válvula digital	VICI	DVI	230 VAC
Headstage quádruplo	Univ. de N. Carolina, Instalação
Fonte de alimentação UEI	Univ. de N. Carolina, Eletrônica Instalação
UEI caixa de fuga	Univ. de N. Carolina, Instalação
Fonte de alimentação para bomba de seringa de saborizante	Med Associates	SG-504
Bomba de seringa de saborizante	Med Associates	PHM-107
Microeletrodo de tungstênio	MicroProbes	WE30030.5A3
Referência de fio de prata com AgCl	InVivo Métrico	E255A
Sacarose	Sigma	80497
Cloreto de magnésio	Sigma	M8266
Cloreto de sódio	Sigma	S7653
Ácido perclórico	Sigma	244252
Ácido clorídrico (4 M)	Sigma	54435
Hidróxido de soidum	Sigma	306576
Peróxido de hidrogênio	Sigma	H1009
Cloridrato de dopamina	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	Universidade da Carolina do Norte-Chapel Hill		Deve solicitar software: clique aqui para obter o link para a página de solicitação de software