Exame de Rapid dopamina Dynamics com Fast digitalização Voltametria Cíclica Durante Intra-oral Administração saborizante em ratos acordados

Resumo

Flutuações rápidas na dopamina extracelular (DA) medeiam tanto o processamento de recompensas quanto o comportamento motivado em mamíferos. Este manuscrito descreve o uso combinado de voltametria cíclica de varredura rápida (FSCV) e administração intraoral de saborizantes para determinar como os saborizantes alteram a liberação rápida de dopamina em ratos acordados e em movimento livre.

Resumo

A liberação rápida e fásica de dopamina (DA) no cérebro de mamíferos desempenha um papel crítico no processamento de recompensas, aprendizado por reforço e controle motivacional. A voltametria cíclica de varredura rápida (FSCV) é uma técnica eletroquímica com alta resolução espacial e temporal (subsegundo) que tem sido utilizada para examinar a liberação fásica de DA em vários tipos de preparações. Experimentos in vitro em células únicas e fatias de cérebro e experimentos in vivo em roedores anestesiados têm sido usados para identificar mecanismos que medeiam a liberação e captação de dopamina em condições normais e em modelos de doenças. Nos últimos 20 anos, experimentos in vivo do FSCV em roedores acordados e em movimento livre também forneceram informações sobre os mecanismos dopaminérgicos no processamento e aprendizado de recompensas. Uma grande vantagem da preparação acordada e em movimento livre é a capacidade de examinar as flutuações rápidas do DA que estão bloqueadas no tempo para eventos comportamentais específicos ou para recompensar ou sugerir a apresentação. No entanto, uma limitação dos experimentos combinados de comportamento e voltametria é a dificuldade de dissociar os efeitos do DA que são específicos para estímulos primários recompensadores ou aversivos de flutuações concomitantes do DA que medeiam comportamentos direcionados à recompensa ou outros comportamentos motores. Aqui, descrevemos um método combinado usando FSCV in vivo e infusão intraoral em um rato acordado para investigar diretamente as respostas de DA a saborizantes orais. Nesses experimentos, os saborizantes orais são infundidos diretamente no paladar do rato - ignorando o comportamento direcionado à recompensa e o comportamento voluntário de beber - permitindo o exame direto das respostas do DA aos estímulos do saborizante.

Introdução

A liberação fásica do DA desempenha um papel importante na mediação do comportamento direcionado à recompensa ^[1-3]. No entanto, isolar e estudar como uma recompensa primária altera a liberação fásica de DA é muitas vezes complicado por processos comportamentais ou cognitivos concomitantes que também são capazes de alterar a liberação fásica de DA - como processos de tomada de decisão ou comportamento motor direcionado à recompensa para adquirir a recompensa. No presente trabalho, isolamos as respostas fásicas de DA a saborizantes por meio do uso de voltametria cíclica de varredura rápida in vivo (FSCV) combinada com entrega de saborizantes por meio de cânulas intraorais. Essa técnica ignora a escolha e a ação e nos permite examinar a liberação extracelular de DA durante a infusão direta de um saborizante no palato de um rato.

FSCV é uma técnica eletroquímica com alta resolução temporal e espacial, permitindo medidas de liberação de DA em uma área local discreta (aproximadamente 100 μm) em uma escala de sub-segundo (resolução de 10 Hz). A combinação de administração intraoral e FSCV oferece a vantagem de observar respostas rápidas e "em tempo real" de DA a um saborizante, que não pode ser examinado usando métodos convencionais de microdiálise. Além disso, a liberação fásica de DA em resposta a recompensas ou pistas associadas a recompensas ocorre em concentrações entre 20-100 nM, que está acima do limite de detecção de 10-20 nM para FSCV ^[4]. A alta resolução espacial do FSCV também permite o registro de sub-regiões de pequenas áreas cerebrais, como o núcleo accumbens (NAc). Assim, o FSCV combinado com infusões intraorais de saborizantes é um modelo ideal para estudar como os saborizantes ou outros estímulos alteram a liberação fásica de DA em animais acordados e comportados. De fato, essas técnicas permitiram experimentos investigando como saborizantes recompensadores e aversivos alteram a liberação extracelular de DA ^[5].

Na última década, as análises do FSCV foram combinadas com sucesso com paradigmas de administração intravenosa ^{de drogas [6]} e autoadministração de ratos ^{[7, 8]} para identificar o papel dos mecanismos fásicos de DA em modelos de dependência de drogas. Além disso, a entrega intraoral combinada com FSCV tem sido usada para examinar como as pistas de saborizantes emparelhadas com a disponibilidade de cocaína modulam a liberação fásica de DA e as respostas comportamentais que refletem o afeto emocional ^[3]. Essa metodologia intraoral e FSCV combinada também pode ser poderosamente utilizada para examinar as respostas fásicas do DA a aromatizantes, como mentol e adoçantes orais, que são adicionados a cigarros e produtos de tabaco solúveis ^[9-11]. Embora muitos dos aromatizantes adicionados aos produtos de tabaco sejam apetitivos ^[9-11], não se sabe se esses aromatizantes aumentam a liberação fásica de DA de maneira consistente com uma valência hedônica recompensadora. De fato, os aromatizantes adicionados aos cigarros e aos produtos de tabaco solúveis podem ter efeitos diretos no sistema de recompensa do DA e podem atuar por meio de mecanismos dopaminérgicos para influenciar a valência recompensadora de cigarros e outros produtos de tabaco. Assim, a administração intraoral combinada com o FSCV pode fornecer uma nova compreensão sobre como os aromatizantes modulam a liberação rápida de DA. O uso da metodologia combinada intra-oral e in vivo FSCV, e os dados obtidos de tais estudos, também podem facilitar estudos futuros para determinar como os aromatizantes e a nicotina interagem para alterar a sinalização do DA e potencialmente modular o reforço da nicotina. Além disso, os dados obtidos com esses estudos podem ser usados para informar as decisões regulatórias sobre aromatizantes de produtos de tabaco.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee da Universidade Yale (IACUC).

Preparativos 1) Pré-cirúrgicos

1. Preparação solução oral
   1. Criar soluções de sacarose a 10% e 0,005% de L-mentol em água desionizada (pH 7,4). Armazenar estas soluções em recipientes fechados, à TA, e refazer a cada 2 semanas, para evitar a degradação.
2. Soluções de calibração de eletrodo
   1. Adicione tampão Tris (pH 7,4) em qualquer momento antes da calibração. A solução consiste em 12,0 mM de Tris-HCl, NaCl 140 mM, KCl 3,25 mM, CaCl2 1,20 mM, NaH2PO4 1,25 mM, 1,20 mM de _MgCl2, e 2,00 mM de Na ₂ SO _4.
   2. Criar uma solução estoque de 10 mM de dopamina (DA; cloridrato de dopamina) em 0,1 M de ácido perclórico. O ácido perclórico ajuda a evitar a oxidação de dopaminae. Conserva-se a solução de reserva a -20 ° C e usado para até 6 meses. Adicione várias alíquotas da solução de estoque DA para armazenamento a utilizar cada alíquota apenas uma vez.
   3. A partir do estoque 10 mM de DA, soluções diluídas em tampão Tris para concentrações de 1 uM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, e 31,25 nM.
   4. Para a calibração de pH, preparar soluções de Tris tampão com o pH de 7,2, 7,3, 7,5, e 7,6. Isto irá proporcionar soluções que imitam mudanças de pH que podem ocorrer durante a experiência in vivo.
3. Fabricação eletrodo
   1. Por sucção a vácuo, aspirar uma T-650 de fibra de carbono (7 um de diâmetro) num tubo capilar de vidro de borossilicato (comprimento 10 mm, diâmetro exterior de 0,6 milímetros, de diâmetro interno 0,4 mm).
   2. Coloque capilar de vidro preenchido com fibra de carbono em um eletrodo extrator vertical. Para os parâmetros iniciais, definir o aquecedor para 55,0 e desligue o ímã. No entanto, uma maior optimização pode ser necessário que ambos aquecedor e configurações magnéticos variar from laboratório para laboratório.
      Nota: O eléctrodo deve ser de pelo menos, 5,5 cm de comprimento (incluindo a conicidade) de modo que possa facilmente encaixar-se no micromanipulador e ser inserido, pelo menos, 6,9 milímetros abaixo da dura no cérebro de rato. Se o eléctrodo é demasiado curto, gravações de porção ventral do núcleo accumbens não será possível. Por outro lado, o comprimento total do eléctrodo não deve exceder 6,5 centímetros caso contrário, será demasiado grande para caber na micromanipulador.
   3. Usando um microscópio de luz, cortar o exposto de fibra de carbono de modo que ela se estende 75-100 uM para além da extremidade do vidro. Verifique se o eletrodo tem um muito apertado, quase imperceptível, vedação entre o eletrodo de vidro e fibra de carbono, o que irá produzir o mínimo de ruído durante a gravação posterior. Descarte o eletrodo, se houver rachaduras visíveis no vidro ou se o selo está solto, o que é indicativo de um selo pobre. Para obter instruções mais detalhadas, consulte [12] e [13].
4. Montagem do eletrodo no microfoneromanipulator
   1. Obter um 3 em, fio 30G que é isolado ao longo de metade do comprimento do fio e utilizar um pequeno pincel para aplicar uma fina camada de prata pintar directamente para o fio. Imediatamente após a aplicação da pintura de prata, inserir o fio no orifício na parte superior do eléctrodo para proporcionar uma ligação física e eléctrica para a fibra de carbono. Sob um microscópio, certifique-se de que o fio de prata faz contato com a fibra de carbono.
   2. Prenda o fio de prata e eletrodo para o micromanipulador usando psiquiatra do calor.
   3. Inserir o eléctrodo de fibra de carbono preparada em álcool isopropílico purificado (IPA) durante pelo menos 10 minutos para limpar a superfície do eléctrodo e para aumentar a sensibilidade subsequente à dopamina. Após a imersão no IPA, lavar a fibra de carbono com água da torneira para remover o IPA.
5. Referência fabricação eletrodo
   1. Pegue um fio de 13 milímetros de prata contendo uma aproximadamente 6 mm Ag / Ag Cl mesh (fio de prata 7 milímetros sozinho, seis milímetros de malha, 0,4 mm de diâmetro),cortar a porção de prata até aproximadamente metade do seu comprimento original e soldar a porção do fio de prata a um pino de ouro.
   2. Aplicar epóxi sobre a solda no pino.
   3. Mergulhar o Ag / Ag Cl malha extremidade a um copolímero de 5% politetrafluoretileno e perfluoro-3,6-dioxa-4-metil-7octene-sulfónico ácido 5 vezes, com 30 min períodos de secagem ao ar entre cada mergulho.
   4. Permitir que o revestimento Ag / Ag Cl malha para o ar seco O / N.
   5. Da cura em forno a 120 ° C durante 1 h.

2) a cirurgia combinada intra-oral e cirurgia intracraniana Canulação (aproximadamente 75 min)

1. Fabricação do cateter Oral
   1. Adicione o cateter por via oral, e esterilizar por esterilização por óxido de etileno, pelo menos 10 dias antes da cirurgia.
   2. Corte PE 100 tubos em seis centímetros segmentos longos.
   3. Usando um ferro de soldar, derreter uma extremidade da tubagem de PE e imediatamente pressionar de encontro a uma superfície sólida para arrefecer a tubagem de PE. O resultado deve criarum disco pequeno, plana numa extremidade do tubo de PE e não deve ser flangeado. Utilize uma agulha (18 L) ou empurrar o pino para criar um buraco no centro do disco.
   4. Na outra extremidade do tubo de PE, confortavelmente inserir a extremidade embotada de uma agulha G 18 para dentro do tubo.
   5. Usando um furador de papel padrão, soco várias peças circulares de uma folha de politetrafluoretileno (3,18 milímetros de espessura, 6 mm de diâmetro) para criar arruelas politetrafluoretileno.
   6. Criar um buraco no centro da máquina de lavar. Aqui a agulha ligado ao tubo de PE e empurrá-lo completamente através da máquina de lavar. Uma vez que a agulha está completamente, deslizar a anilha para a parte inferior do tubo de PE de modo a ficar à face contra a anilha.
2. Cirurgia oral
   1. Após esterilização a instrumentos cirúrgicos, cânula (aparado a 2,5 mm abaixo do pedestal antes da esterilização), e o eléctrodo de referência, anestesiar ratos com uma injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg).
      1. After 5 min, aplique um teste de estímulo nocivo (pé ou cauda pitada) para avaliar o nível de anestesia. Se o sujeito apresenta qualquer reacção física para o teste estímulo nocivo (recuar resposta, aumento da taxa respiratória ou do coração), administrar um impulso cetamina de 10% a 15% da dose original e repetir o protocolo de estímulo nocivo acima.
   2. Depois que o rato é totalmente anestesiado e não mostra reação ao teste estímulo nocivo, usar máquinas de cortar cabelo de animais para raspar a pele do rato dos olhos de cerca de 2 mm atrás das orelhas. Em seguida, coloque o rato sobre a recirculação de água de aquecimento almofada fina para manter a temperatura corporal durante a cirurgia. Aplique lubrificante ocular. Administrar o fármaco não esteróide anti-inflamatório (NSAID), carprofeno (5 mg / kg), por injecção intraperitoneal, antes de realizar quaisquer incisões e antes da inserção de cânulas intra-orais. Utilizar técnicas assépticas em todos os momentos.
   3. Aplicar betadine seguido de etanol a 70% para limpar a pele. Repita 3 vezes.
   4. Place o rato em sua parte traseira, e abra a boca com um cotonete estéril. Encontre o primeiro molar superior.
   5. Insira a agulha no tecido entre a bochecha eo primeiro molar superior até a agulha sai logo atrás e medial para os ouvidos.
   6. Pierce a agulha através da pele até que o tubo de PE sai da pele e é acessível.
   7. Puxe a cânula (agarrando pela própria cânula e não a agulha) e fixe a máquina de lavar politetrafluoretileno para os molares, de modo que o cateter permanece no lugar.
      Nota: Cortando a máquina de lavar em uma forma trapezoidal e prendendo-o contra os molares com o lado plano voltado para a face torna esta etapa mais fácil.
   8. Pegue outra máquina de lavar politetrafluoretileno e deslize-o sobre a agulha exposta, até o tubo de plástico, e encostar contra a incisão.
   9. Para proteger a máquina de lavar politetrafluoretileno, use fita esterilizados para criar uma "bandeira" triangular para que a máquina de lavar não deslizar para cima. Fixe a lavagemer contra a pele do rato e a fita esterilizada.
   10. Corte o cateter exposta para permitir 2-4 cm de tubo para ser exposto acima da cabeça do rato.
   11. Repita os passos através 2.2.1 2.2.10 para o outro lado da boca.
3. Cirurgia intracraniana para voltammetry
   1. Coloque o rato no quadro estereotáxico e limpar couro cabeludo do animal usando um matagal fase dois (um matagal betadine seguido por um matagal etanol a 70%, se apresentar com uma repetição 3 ciclo).
   2. Use uma pinça de nariz de agulha esterilizadas e uma tesoura cirúrgica para cortar uma seção de 15 x 15 mm de tecido do couro cabeludo.
   3. Limpe suavemente a superfície do crânio utilizando esterilizados aplicadores com ponta de algodão. Além disso limpar o crânio através da aplicação de 2 a 3 gotas de 3% de peróxido de hidrogénio.
   4. Use uma broca estereotáxica para fazer 3 pequenos (1 mm de diâmetro) buracos no crânio para inserção posterior de parafusos, um buraco para a cânula guia, um buraco para o eletrodo estimulante e um buraco para os eleitos de referênciacavalgava.
   5. Para gravações no núcleo NAc, posicione o guia cânula de 1,2 mm anterior e 1,4 mm lateral para Bregma. Abaixe o aparelho cânula até a base de plástico fique nivelada com o crânio.
   6. Coloque o eletrodo de referência esterilizado no hemisfério contralateral à cânula guia. Diminuir a referência cerca de 2 mm abaixo da dura-máter.
   7. Posicionar o eléctrodo estimulante de 5,2 mm posterior e 1,0 mm lateral em relação ao bregma e abaixada 8,0 milímetros abaixo da dura para atingir a área tegmental ventral (VTA).
   8. Use uma chave de fenda pequena cirúrgico esterilizado para garantir parafusos no crânio. Em seguida, insira o eletrodo de referência, estimulando eletrodo, e orientar cânula. Finalmente, proteger todos os componentes usando cimento cranioplastia.
   9. Durante as primeiras 48 horas de cuidados pós-operatórios, administrar o fármaco não esteróide anti-inflamatório não esteróide (AINE) Carprofeno por injecção subcutânea (5 mg / kg). Permitir que pelo menos uma semana para recuperação cirúrgica completa antes de realizar voltammetry gravação.
      1. Durante cuidados pós-operatórios, cateteres orais lavar diariamente com água. Fornecer alimentos saturado em água durante 2 dias para auxiliar o animal na mastigação e comer. Fornecer monitoramento diário para potenciais sinais de estresse da dor (devido à infecção leve ou desidratação) e as intervenções apropriadas conforme necessário (incluindo administração de fluidos, a administração tópica de anti-sépticos, e ou administração de AINE Carprofen a 5 mg / kg).

3) voltamétricos Recordings em Awake, Rat livremente em Movimento

1. Abaixar o eletrodo e adquirir um conjunto de treinamento DA.
   1. No dia do experimento, verificar a desobstrução da cânula oral, através da infusão de 200 mL de água e observando as respostas orofaciais (para verificar se o rato está provando a água).
   2. Anexar headstage FSCV ao rato através da inserção do eléctrodo estimulante (no andar de entrada) para o eléctrodo bipolar estimulante Cannula (no rato). Assim, o andar de entrada (miniaturizado conversor de corrente-tensão) liga-se directamente ao eléctrodo bipolar estimulante.
   3. Remover a cânula manequim do aparelho cânula e aplicar duas gotas de solução de heparina a 50% para dentro da cânula. Em seguida, insira suavemente uma cânula manequim (ligeiramente mais longo que a cânula dummy que foi previamente removido) para limpar os coágulos de sangue ou cicatriz glial que possam ter ocorrido, que vai quebrar eletrodos de fibra de carbono que serão posteriormente inseridos durante o experimento. Estender a cânula utilizada para limpar os coágulos de 3-4 mm abaixo do crânio (pelo menos 2 mm acima do local de gravação).
   4. Inserir o micromanipulador, com eléctrodo, na cânula guia e colocar o anel em posição omega "bloqueado".
   5. Conecte o fio do eletrodo de referência do headstage para o pino apropriado. Em seguida, conecte o fio do eletrodo de trabalho desde o micromanipulador para o fio apropriado no headstage.
   6. Abaixe os eleceléctrodo de cerca de 4-4,5 mm abaixo do crânio.
   7. Usar um potenciostato para aplicar uma forma de onda triangular (400 V / s, -0,4 a +1,3 V). Aplicar a forma de onda para o eletrodo a 60 Hz por pelo menos 10 min, em seguida, alterar a frequência de aplicação de forma de onda para 10 Hz para gravações experimentais subsequentes.
      Nota: A etapa de aplicação de forma de onda de 60 Hz produz uma superfície de fibra de carbono estável e irá ajudar a evitar a deriva elétrica
   8. Aplicar estimulação eléctrica à VTA utiliza frequências diferentes (10 a 60 Hz) impulsos (de 10 a 30 pulsos) e as correntes (50 a 150 mA), todos com uma largura de impulso de 2 ms / fase, para evocar diferentes concentrações de DA e de libertação de pH turnos. Adquirir pelo menos 5 concentrações diferentes de liberação DA e 5 turnos de pH diferentes. Esperar (2-3 minutos no mínimo) entre as estimulações para permitir a recarga vesicular [14].
      Nota: É importante a obtenção de estimulações que produzem concentrações de DA em toda a gama que vai ser recolhida durante o subsequenteexperimento, uma vez que será usado como um conjunto de treinamento para Análise de Componentes Principais (ver secção 5.1).
   9. Abaixe o eletrodo no núcleo NAc (6,3 milímetros ventral a dura). Subsequentemente diminuir o eléctrodo em incrementos de 100 um no interior do núcleo NAc até que os eventos de libertação de DA transientes são observadas com frequências de, pelo menos, 1 por min.
   10. Ligue o tubo (diâmetro interior de 1/32 ", diâmetro exterior de 3/32") para uma seringa de 20 ml, ligado a uma bomba de seringa. Na outra extremidade do tubo, usar uma agulha biselada 23 L para ligar a tubagem a cânula do rato. Certifique-se de que a tubulação é preenchida completamente com o saborizante desejado e verifique se não há bolhas de existir na tubulação.
       Nota: Tipicamente, administrar uma pequena quantidade de saborizante na boca do rato antes da gravação para assegurar que a primeira infusão para a gravação proporcionam a quantidade total de infusão e não qualquer água residual ou de ar na tubagem. Além disso, isto permite que o animal ter alguma experiência prévia sagacidadeh desde o saborizante novos tastants, mesmo aqueles apetitivas, pode ser aversivo inicialmente devido à sua novidade.
   11. Para coleta de dados, infundir 200 mL de saborizante (6,5 seg usando uma bomba e tubulação descrito anteriormente). Infundir o saborizante cada 1-3 min. Infundir um total de 25 vezes por saborizante. Cada infusão proporciona 200 ul de solução.
   12. Se vários tastants estão sendo entregues em um único experimento, lave o cateter por via oral com água após a coleta de dados para um saborizante e aguarde pelo menos 20 minutos antes da infusão da nova saborizante.
   13. Após a sessão de gravação DA, preparar-se para verificação histológica através da criação de uma pequena lesão no local de gravação. Para preservar o eletrodo de fibra de carbono para a calibração posterior, primeiro retrair o eléctrodo e retire o micromanipulador. Em seguida, usar uma nova micromanipulador com um microeléctrodo de vidro e um fio de tungsténio (que se estende de 100 um para além da ponta de vidro) com a mesma profundidade (abaixo da dura) que o original carbono fmicroeletrodos iber.
   14. Para verificação histológica, criar uma pequena lesão por aplicação de 3 V com o fio de tungsténio e aumentando a tensão em incrementos de 1 V, a cada 10 segundos, até que a configuração 10 V é atingido.
   15. Se uma curva de concentração padrão já foi criado utilizando eletrodos múltiplos de fibra de carbono, realizar a etapa de lesão acima (3.1.14), aplicando o potencial diretamente o eletrodo de fibra de carbono.
       Nota: Este método lesão irá danificar a fibra de carbono e prevenir a calibração posterior com esse eletrodo específico.
   16. Eutanásia do animal utilizando uma injecção letal de pentobarbital (150 mg / kg, ip).
   17. Desalojar o headcap com as cânulas usando um alicate, puxando para cima diretamente no headcap. Não torça o headcap porque isto poderá causar danos desnecessários ao cérebro e torná-lo desafiador para identificar a localização do eletrodo durante a histologia.
       1. Remover o cérebro e em lugar de 4% de formalina durante 3 dias, seguido por 30% de suCrose por 1 semana. Criar 30 uM fatias utilizando um criostato, de montagem em lamelas e fatias examinar com um microscópio óptico para identificar a localização da fibra de carbono ou lesão de tungsténio.
          Nota: Perfusão é opcional para 3.1.17.

4) calibração do eletrodo

1. Usando a célula de fluxo para criar um factor de conversão de corrente de concentração.
   1. A fim de determinar a sensibilidade do eletrodo, calibre eletrodos após cada experimento, utilizando um aparelho de fluxo "T-cell". Diminuir o eléctrodo na "T-célula", enquanto tampão Tris, pH soluções, ou soluções de DA são lavados sobre a superfície do eléctrodo (a uma taxa de 2 ml / min). Use um de seis posições solenóide de ar do atuador para alternar entre tampão e pH ou a solução DA.
   2. Para cada calibração, recolha de dados voltamétricas durante 5 seg aplicação de tampão Tris (linha de base), seguido de 5 seg aplicação do pH ou da solução de DA, seguido por 20 segundos de umPLICAÇÃO de tampão Tris (arquivo total 30 seg). Repita cada execução 3 vezes para cada concentração padrão de calibração, contrabalançando entre diferentes concentrações de cada norma.
   3. Para cada recolha de amostras, medir o pico DA ou corrente evocada pelo pH. Em média, a corrente de pico em cada teste para obter uma concentração versus relacionamento corrente de pico. Para obter instruções mais detalhadas, consulte [12] e [13].

5) Análise de Dados

1. Usando um conjunto de treinamento em análise de componentes principais (PCA)
   Nota: Durante uma experiência de voltametria, a saída é produzida como corrente, que é o resultado da oxidação e redução da dopamina, mudanças de pH, e ruído electroquímico. PCA permite a separação desses fatores para que se possa isolar os componentes desejados (DA e pH) e remover componentes adicionais que podem distorcer os sinais desejados (para uma descrição mais detalhada, ver ^{15, 16).}
   1. Atribuir um fator de calibração para pocorrente e de saída (aproximadamente 5-10 nA / uM) após APC para permitir que os valores de concentração de analitos a ser determinada.
   2. Use o conjunto de treinamento obtido durante um experimento para "treinar" o modelo APC para separar DA, pH, e outros fatores. APC leva o conjunto de treino voltamogramas cíclicos (recolhida na secção 3.1.8) e determina que as características essenciais do voltamograma podem ser usadas para identificar cada analito recolhidos durante gravações de voltametria in vivo.
   3. Para determinar o número de componentes principais para manter, usar um F-teste Malinowski. Normalmente, manter apenas 2 ou 3 principais componentes que normalmente explicam cerca de 95-99% da variância nos dados. Para uma discussão mais aprofundada sobre a aplicação da F-teste Malinowski, ver ^17.
      Nota: Uma vez que o número de componentes são determinadas, a análise PCA efetivamente vai projetar os voltamogramas medidos do DA e formação pH define sobre os principais componentes que foram retidos.O resultado é um conjunto de dados que foi filtrada para que somente os dados de DA (ou pH) permanece e os dados residual que não se assemelha a DA ou pH é removido (ver resultados representativos para a saída esperada). Para obter uma explicação mais detalhada e instruções passo a passo para a utilização de PCA para a análise voltamétrica veja folha de Materiais e ^{16, 17.}

Resultados

FSCV combinado com implantação do cateter intra-oral foi usado para examinar como a sacarose, um saborizante appetitive, modula a liberação fásica DA no núcleo NAc. Antes da perfusão saborizante, a estimulação elétrica (150 mA, 60 Hz, 24 pulsos; indicado pela barra vermelha) do VTA produz aumentos robustos na liberação fásica DA no NAc (Figura 1) Figura 1 mostra um gráfico colorido com potencial diante. o eixo y, o tempo no eixo-x, e corrente (representada como falsa cor) no eixo z. Abaixo do gráfico co...

Discussão

Entrega saborizante intra-oral combinado com FSCV permite a análise de "tempo real" respostas Da e aromatizantes orais. Existem três passos críticos no protocolo que são necessárias para as medições de DA bem sucedidas. Em primeiro lugar, a implantação adequada do cateter por via oral é crítica para o fornecimento de aromatizantes. Garantir que o cateter é inserido atrás do primeiro molar e encravado no lugar impede que o cateter de perder permeabilidade e impede a remoção acidental pelo animal. A lavagem do c...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Eléctrodo de estimulação	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	ao encomendar, solicite um corte de 22 mm abaixo do pedestal
Cânula para eléctrodo	BioAnalytical Systems	MD-2251
Sistemas A-M	capilares de vidro	624503
Fibra de carbono	Thornel	T650
Extrator de eléctrodos	Narishige International	PE-22
Isolador de estímulo Neurolog	Digitimer Ltd.	DS4
Fios	3M	FP-301
para eletrodos	Squires electronics	Custom	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	Univ. de Illinois em Chicago, Oficina de Máquinas	de Engenharia
Epóxi	ITW Devcon	14250	"5 minutos epóxi"
Copolímero de ácido perfluoro-3,6-dioxa-4-metil-7octeno-sulfônico e íon tetrafluoroetileno	Potência	LQ-1105	ou seja, Tinta Nafion
Silver	GC Electronics	22-023
Fonte de alimentação	BK Precision	9110
Tubulação para cateteres intra-orais	Intramedic	427426	PE 100, I.D. = 0,86 mm; O.D. = 1,52 mm
Tubo para infusão intra-oral	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Bomba de seringa para célula de fluxo	Pump Systems Inc.	NE 1000
Cimento cirúrgico	Dentsply Calafetar	675571 e 675572
Atuador de ar	VICI	A60	Interface de válvula digital de 6 posições
de válvula digital	VICI	DVI	230 VAC
Headstage quádruplo	Univ. de N. Carolina, Instalação
Fonte de alimentação UEI	Univ. de N. Carolina, Eletrônica Instalação
UEI caixa de fuga	Univ. de N. Carolina, Instalação
Fonte de alimentação para bomba de seringa de saborizante	Med Associates	SG-504
Bomba de seringa de saborizante	Med Associates	PHM-107
Microeletrodo de tungstênio	MicroProbes	WE30030.5A3
Referência de fio de prata com AgCl	InVivo Métrico	E255A
Sacarose	Sigma	80497
Cloreto de magnésio	Sigma	M8266
Cloreto de sódio	Sigma	S7653
Ácido perclórico	Sigma	244252
Ácido clorídrico (4 M)	Sigma	54435
Hidróxido de soidum	Sigma	306576
Peróxido de hidrogênio	Sigma	H1009
Cloridrato de dopamina	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	Universidade da Carolina do Norte-Chapel Hill		Deve solicitar software: clique aqui para obter o link para a página de solicitação de software