Artigo de método

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

DOI:

10.3791/52482

⸱

3 de maio de 2015

 ,  , 
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institute of Health

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito descreve a detecção de sumoylation e ubiquitinação de proteínas cinetócoro, Ndc10 e Ndc80, na levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As modificações pós-traducionais (PTMs), tais como fosforilação, metilação, acetilação, ubiquitinação, e sumoilação, regular a função de muitas proteínas celulares. PTMs de proteínas cinetócoro que se associam com DNA centromeric mediar segregação cromossômica fiéis para manter a estabilidade do genoma. Abordagens bioquímicas, tais como espectrometria de massa e análise de transferência de western são mais comumente utilizado para a identificação de PTMs. Aqui, um método de purificação de proteínas está descrito que permite a detecção de ambos sumoilação e ubiquitinação das proteínas cinetocoro, Ndc10 Ndc80, e em Saccharomyces cerevisiae. Uma estirpe que expressa polihistidina-Flag-etiquetado Smt3 (HF-Smt3) e marcada com myc Ndc10 ou Ndc80 foi construída e utilizada para os nossos estudos. Para a detecção de sumoylation, eu inventei um protocolo para purificar por afinidade proteínas sumoylated His-tag usando esferas de níquel e usado western blot com anti-Myc anticorpo para detectar sumoylated Ndc10 umnd Ndc80. Para a detecção de ubiquitinação, que concebido um protocolo para a imunoprecipitação das proteínas Myc-tag e utilizada a análise de Western blot com um anticorpo anti-Ub para mostrar que Ndc10 e Ndc80 são ubiquitinadas. Os nossos resultados mostram que o epitopo marcado com proteína de interesse na sua bandeira-tagged Smt3 estirpe facilita a detecção de vários PTMs. Estudos futuros deverão permitir a exploração desta técnica para identificar e caracterizar as interações proteína que são dependentes de um PTM específico.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubiquitinação e sumoilação permitir a conjugação de ubiquitina e modificador pequeno Ubiquitina-like (SUMO; Smt3 em S. cerevisiae 1) para uma proteína-alvo, respectivamente. PTMs de proteínas cinetócoro afectar os níveis celulares e interacções proteína-proteína durante as diferentes fases do ciclo celular para assegurar a segregação cromossómica fiel. Por exemplo, os níveis celulares de Cse4 / CENP-A e proteína cinetócoro exterior Dsn1 são regulados através de proteólise mediada por ubiquitina para assegurar a estabilidade do genoma 2-5. A desestabilização das ligações cinetócoro-microtúbulo incorrectas requer a IPL1 / Aurora B-quinase, que fosforila e Dam1 Ndc80 complexos que interagem directamente com os microtúbulos 6-8. Apesar da identificação de mais de setenta proteínas cinetócoro, há muito poucos estudos que investigam as modificações dessas proteínas com PTMs, por exemplo, ubiquitina e SUMO. Uma limitação importante é a capacidade de preservar a PTMs durante a purificação e a escassez de anticorpos para a detecção de mercadorias, tais como PTMs sumoilação, fosforilação, metilação, e outros. Caracterização de proteínas cinetócoro sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1, e Ndc80 utilizou um anticorpo costume 9. Além disso, Ndc10 tem sido implicado como um substrato para ubiquitinação 10. Hec1 Humano (Ndc80 em S. cerevisiae) é também substrato para ubiquitinação, regulamentada pelo APC / C-hCdh1 E3 ligase 11. Portanto, Ndc10 e Ndc80 são bons candidatos para otimização do protocolo para detectar tanto sumoylation e ubiquitination em S. cerevisiae.

Para facilitar a identificação de sumoilação, construiu-se as estirpes que expressam HF-Smt3 e marcada com myc Ndc10 ou Ndc80. O uso de marcadores de epitopo (HF: His6-Flag) minimiza o fundo devido à reatividade cruzada que é frequentemente observada no soro policlonal criado contra uma proteína candidato. Eu inventei um protocolo de afinidadepurificar conjugados HF-Smt3 e, em seguida, utilizado anti-Flag comercial e anticorpos anti-myc para detectar a presença de sumolyated Ndc10 e Ndc80 na preparação Smt3 purificado. Para ubiquitination, eu inventei um protocolo de imunoprecipitação modificado que preserva ubiquitinação das proteínas cinetócoro Myc marcadas e realizadas análises de Western blot com o anticorpo anti-Ub comercial para detectar ubiquitination de Ndc10 e Ndc80.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Crescimento de Células de Levedura

  1. Inoculação das células de levedura em 30 ml de YPD (Tabela 1) em um balão pequeno. Incubar a 30 ° C durante a noite com agitação.
  2. Dilui-se as células até uma densidade óptica de 0,2 a 600 nm (DO 600 = 0,2) em 50 ml de meio YPD e incubar a 30 ° C com agitação.
  3. Crescer a cultura a uma densidade óptica de 1,0 a 600 nm (DO600 = 1,0).
  4. Centrifugar células durante 5 min a 2000 xg e desprezar o sobrenadante.
  5. Ressuspender o sedimento celular em 40 ml de água estéril e centrifugar durante 5 minutos a 2000 x g para lavar as células. Descartar o sobrenadante e o sedimento de células armazenar a -20 ° C.

2. Extracção de proteínas

  1. Ressuspender as células em 0,5 ml de tampão de guanidina arrefecido em gelo (Tabela 1) para o ensaio suspenso usando pérolas de Ni-NTA Superflow ou tampão A (Tabela 1) para imunoprecipitação. Manter tubos em gelo em todos os momentos.
  2. Transferir a 2 ml tubo de tampa de rosca.
  3. Adicionar o mesmo volume de esferas de vidro (Tabela de Materiais).
  4. Conta-bater as células de uma mini-grânulo batedor (tabela de materiais) durante 2 min à temperatura ambiente, depois colocar sobre gelo durante 2-3 minutos. Repita isso três vezes.
  5. Vortex em alta velocidade, a 4 ° C durante 30-60 min. Verificar as células por visualização sob o microscópio para garantir que as células são lisadas.
    Nota: As células lisadas aparece como fantasmas escuros e não têm um limite ou uma forma definida. Optimamente, pelo menos, 80% das células devem ser lisadas.
  6. Perfurar um buraco no fundo do tubo usando um pino do impulso e coloque em uma coleção 15 ml tubo cônico (tampa de rosca deve ser solto).
  7. Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min para recolher o lisado.
  8. Transferir o lisado para um tubo de micro centrífuga.
  9. Centrifugar a 15.000 xg durante 30 min a 4 ° C para recolher as proteínas extraídas.
  10. Medir a concentração das proteínas extraídas utilizando a proteína assay kit (Tabela de Materiais) e normalizar todos os extractos de conter a mesma quantidade de proteína. Levar o volume total a 1 ml com tampão apropriado.
    Nota: Cerca de 5 mg de proteína total é obtida a partir de 50 OD600 células.
  11. Guardar a 50 ul (250 ug de proteína, se a proteína total extraído a partir do passo 5 é 2,10 mg) como extracto celular total (WCE). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x (Tabela 1) e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Carga de 10 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot).

3. Purificação de HF-Smt3 Conjugados

  1. Obter os grânulos Superflow Ni-NTA (Tabela de Materiais) necessários para os experimentos (100 ul de contas por amostra) por centrifugação a baixa velocidade (800-1,500 xg) durante 1 min. Remover o sobrenadante.
  2. Grânulos lavagem 5x com 1 ml de PBS (Tabela de Materiais): Inverter top-sobre-inferior até que as contas são novamente suspensas, coletar pérolas por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante.
  3. Suspender pérolas em 1 ml de tampão de guanidina (Tabela 1) e aliquotar-los para o número de tubos correspondentes a amostras a serem processadas. Coletar pérolas por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante. Misture as contas bem invertendo top-over inferior.
    Nota: Misture bem grânulos invertendo top-over inferior.
  4. Para cada amostra, adicionar 950 ul de WCE remanescente (a partir do Passo 2.11: Extracção de proteínas) com 100 ul de contas de Ni-NTA Superflow.
  5. Incubar numa plataforma de agitação a 4 ° C durante pelo menos 4 horas ou durante a noite.
  6. Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C.
  7. Economize 50 ul como sobrenadante (SUP). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Carga de 10 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Anal Western blotysis).
  8. Lavar as pérolas uma vez com 1 ml de tampão de guanidina durante 5-10 min sobre uma plataforma oscilante.
  9. Lavar as pérolas de 5x com 1 ml de tampão de Rebentamento (Tabela 1) durante 5-10 minutos numa plataforma de agitação.
  10. Grânulos Ressuspender em 90 ul de tampão de amostra Laemmli 2x.
  11. Adicionar 10 ul de 1 M de imidazol.
    Nota: Imidazole ajuda para dissociar a proteína marcada com His a partir das pérolas de Ni-NTA, devido à interacção entre a competir imidazole e os grânulos.
  12. Incubar a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos.
  13. Vortex, em seguida, centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco.
  14. Carga 10-20 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot).
    Nota: 10-20 ul corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, se 5 mg de EOC é usado.

4. Immunoprecipitation de Myc-marcados kinetochore Proteínas

  1. Obter anti-c-Myc de afinidade em gel de agarose umtibody (Tabela de Materiais) necessários para os experimentos (25 ul de resina por exemplo) por centrifugação a baixa velocidade (800-1,500 xg). Remover o sobrenadante.
  2. Lavar 5x resina com 1 mL de tampão A: Inverter cima-baixo-cima até que a resina é ressuspensa, recolher resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante.
  3. Suspender a resina em 1 ml de tampão A e aliquotar-los para o número de tubos correspondentes a amostras a serem processadas. Recolha resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante.
    Nota: Misture a resina bem invertendo-bottom top-over.
  4. Adicionar 950 ul da WCE remanescente (a partir do Passo 2.11: Extracção de proteínas) com 25 ul de resina.
  5. Incubar numa plataforma de agitação a 4 ° C durante a noite.
  6. Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C.
  7. Economize 50 ul como sobrenadante (SUP). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Load 10 uL de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot).
  8. Lavar 5x resina com 1 mL de tampão A: Inverter cima-baixo-cima até que a resina é ressuspensa, recolher resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante.
  9. Ressuspender a resina em 100 ul de tampão de amostra SUMEB (Tabela 1).
    Nota: tampão de amostra contém SUMEB Ureia 8 M e 1% de SDS (forte condição de desnaturação).
  10. Incubar a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos.
  11. Vortex, em seguida, centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco.
  12. Carga 10-20 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot).
    Nota: 10-20 ul corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, se 5 mg de EOC é usado.

5. Análise de mancha Ocidental

  1. Coloque os extratos de proteínas em 4-12% Bis-Tris géis (Tabela de Materiais) e perfeletroforese orm a 120 V durante 90 minutos (tampão corrente: Tabela de Materiais).
  2. Transferir as proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose (Tabela de Materiais) usando um aparelho de transferência a 30 V durante 90 min (tampão de transferência: Tabela de Materiais).
  3. Bloquear a membrana em 5% leite / TBST 1x (Tabela 1) durante 1 h à temperatura ambiente.
  4. Incubar membrana com anticorpo primário (Tabela de Materiais) em 5% leite / TBST 1x durante a noite a 4 ° C. Para os anticorpos primários, usar uma diluição de 1: 1000 (os anticorpos anti-FLAG e anti-Ub) ou 1: 5000 (anticorpo anti-Myc).
  5. Lavar 3x membrana durante 10 min cada com TBST 1x.
  6. Incubar membrana com anticorpo secundário (Tabela de Materiais) em 5% leite / TBST 1x durante 1 hora à temperatura ambiente. Usar uma diluição de 1: 5000 de anticorpos secundários.
  7. Lavar 3x membrana durante 10 min cada com TBST 1x.
  8. Incubar membrana com ECL workisolução ng (Tabela de Materiais) durante 5 min.
  9. Expor a membrana sensível ao azul filme X-Ray (Tabela de Materiais) e desenvolver usando um desenvolvedor automático (Tabela de Materiais).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para detectar sumoilação de proteínas cinetócoro Ndc80 e Ndc10, estirpes com HF-Smt3 e proteínas cinetócoro marcada com myc (Ndc80 ou Ndc10) foram calculados (Tabela 2), como anteriormente descrito 9,12. HF-Smt3 conjugados foram purificados por afinidade utilizando esferas de Ni-NTA. A análise de Western blot de HF purificado-Smt3 com um anticorpo anti-Flag permitiu a detecção de formas sumoylated de substratos SUMO que estavam ausentes na estirpe de controlo, sem HF-Smt3 (Figura 1A

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Marcadores de epitopo HA, tais como, Myc, Bandeira, e GST são amplamente utilizados para análise bioquímica de proteínas. Construção de estirpes com IC-Smt3 e proteínas cinetócoro Myc-tag, como Ndc10 e Ndc80, facilita a detecção de PTMs como sumoilação e ubiquitinação. HF-Smt3 puxar para baixo ensaio permite a detecção de proteínas cinetócoro sumoylated, Ndc10 e Ndc80 (Figura 1). O protocolo de purificação por afinidade e análise Western blot utilizando anticorpo anti-Flag estabelecer a especificidade d...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Dr. Oliver Kerscher pelo apoio e aconselhamento e aos membros do laboratório Basrai por seu apoio e comentários sobre o artigo. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do National Institutes of Health.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Contas de vidroProdutos BioSpec110791050,5 mm de diâmetro
Produtos BioSpec693Disruptor de 8 células
Ni-NTA superfluxoQiagen30430100 ml
Coquetel de inibidores de proteaseSigma-AldrichP82151 ml
Anti-c-Myc gel de afinidade de agarose antbody produzido em coelhoSigma-AldrichA74701 ml
de anticorpo monoclonal anti-Flag M2 produzido em camundongoSigma-AldrichF1804Anticorpo primário, diluição 1:1.000
anticorpo c-Myc (A-14)Santa Cruz Biotechnologysc-789Anticorpo primário, diluição 1:5.000
Anticorpo de camundongo purificado monoclonal 9E10CovanceMMS-150PAnticorpo primário, diluição 1:5.000
Ubiquitina (P4G7) anticorpo monoclonalCovanceMMS-258RAnticorpo primário, diluição 1:1.000
ECL Rabbit IgG, Ab inteiro ligado a HRPGE Healthcare Life SciencesNA934VAnticorpo secundário, diluição 1:5.000
ECL Mouse IgG, Ab inteiro ligado a HRPGE Healthcare Life SciencesNA931VAnticorpo secundário, diluição 1:5.000
Ensaio de proteína DCBio-Rad500-0116
Membrana de nitroceluloseNovexLC20010,45 mm tamanho de poro
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Géis de ProteínaNovexNP0321BOX1,0 mm, 10 poços
NuPAGE MES SDS Running BufferNovexNP000220x
NuPAGE Transfer BufferNovexNP0006-120x
SuperSignal West Pico Substrato QuimioluminescenteThermo Scientific34078
10x PBS pH7.4GIBCO70011-044
Filme de raio-X sensível a azulDbioDBOF30003
Revelador automáticoKodakM35AX-OMAT
NocodazolSigma-AldrichM140450 mg
MG-132Selleck ChemicalsS261925 mg
Mini batedor de contas de #

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
  2. Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
  3. Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
  4. Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
  5. Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216(2013).
  6. Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
  7. Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
  8. Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
  9. Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
  10. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  11. Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
  12. Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
  13. Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158(2007).
  14. Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
  15. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Detec o de Sumoyla oDetec o de Ubiquitina oNdc10 Ndc80Purifica o com Esferas de N quelM todo de Imunoprecipita oAn lise por Western BlotSaccharomyces cerevisiaeMarca o de Ep topo

Artigos relacionados