Geração de adiposo humano Stem Cells através Dedifferentiation de adipócitos maduros em Culturas de teto

Resumo

Os adipócitos maduros podem representar uma fonte abundante de células-tronco por meio da desdiferenciação, o que leva a uma população homogênea de células semelhantes a fibroblastos. A digestão da colagenase é usada para isolar adipócitos maduros da gordura humana. O objetivo do nosso protocolo é obter células de gordura multipotentes e desdiferenciadas a partir de adipócitos humanos maduros.

Resumo

Foi demonstrado que os adipócitos maduros revertem seu fenótipo em células semelhantes a fibroblastos in vitro por meio de uma técnica chamada cultura de teto. Os adipócitos maduros também podem ser isolados do tecido adiposo fresco para caracterização específica do depósito de sua função e propriedades metabólicas. Aqui, descrevemos um protocolo bem estabelecido para isolar adipócitos maduros de tecidos adiposos usando digestão de colagenase e etapas subsequentes para realizar culturas de teto. Resumidamente, os tecidos adiposos são incubados em um tampão Krebs-Ringer-Henseleit contendo colagenase para romper a matriz tecidual. Os adipócitos maduros flutuantes são coletados na superfície superior do tampão. As células maduras são colocadas em um frasco T25 completamente cheio de meio e incubadas de cabeça para baixo por uma semana. Uma abordagem alternativa de cultura em placas de 6 poços permite a caracterização de adipócitos em desdiferenciação. A morfologia dos adipócitos muda drasticamente ao longo do tempo de cultivo. A imunofluorescência pode ser facilmente realizada em lâminas cultivadas em placas de 6 poços, conforme demonstrado pela coloração de imunofluorescência FABP4. A proteína FABP4 está presente em adipócitos maduros, mas regulada negativamente por meio da desdiferenciação das células adiposas. A desdiferenciação de adipócitos maduros pode representar um novo caminho para a terapia celular e engenharia de tecidos.

Introdução

A desdiferenciação in vitro de adipócitos maduros é alcançada por meio de uma técnica chamada cultura de teto¹. Devido à sua tendência natural de flutuar em soluções aquosas, os adipócitos maduros isolados aderem à superfície de um frasco invertido totalmente preenchido com meio de cultura. Ao longo de alguns dias, as células modificam sua morfologia esférica e se tornam células semelhantes a fibroblastos. As células resultantes, chamadas de células de gordura desdiferenciada (DFAT), são multipotentes². Artigos de pesquisa sobre desdiferenciação de adipócitos, especialmente em células humanas, são limitados. No entanto, eles já forneceram informações interessantes sobre multipotência, fenótipo celular e capacidade replicativa das células DFAT². Os adipócitos maduros originários de vários compartimentos de gordura foram desdiferenciados com sucesso, incluindo aqueles originados dos tecidos adiposos visceral e subcutâneo humano^2-4. Além desses depósitos, Kishimoto e colaboradores coletaram amostras de tecido adiposo das bolsas de gordura bucal e adipócitos desdiferenciados em células DFAT⁵. Matsumoto e colaboradores geraram com sucesso células DFAT subcutâneas de pacientes cobrindo uma ampla gama de idades, e a maioria das células teve uma alta taxa proliferativa e menos de 6% de senescência, mesmo após 10 passagens em cultura².

DFAT as células foram rediferenciadas com sucesso em várias linhagens, incluindo linhagens adipogênicas, osteogênicas, condrogênicas e neurogênicas^2,3,6. Essas células expressam vários marcadores de células-tronco embrionárias, como Nanog e os quatro fatores pluripotentes identificados Oct4, c-myc, Klf4 e Sox2³. Eles também expressam marcadores específicos para cada uma das três camadas germinativas⁷. Além disso, as células DFAT são semelhantes às células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (MSC derivadas de BM) com base em sua assinatura epigenética³. Explorando a capacidade das células-tronco das células DFAT, muitos grupos investigaram seu potencial para tratar ou melhorar várias doenças^8,9. Melhorias de condições patológicas, como tecido cardíaco inferrado, lesão medular e disfunção do esfíncter uretral, foram observadas com injeções de células DFAT em modelos de doença em ratos^10-12.

Além das propriedades das células-tronco das células DFAT, elas podem representar um novo modelo celular para estudos de fisiologia de adipócitos. A linhagem celular 3T3-L1 é frequentemente usada para esse fim, pois essas células se diferenciam em adipócitos aderentes que armazenam lipídios sob estimulação adipogênica¹³. No entanto, essas células se originam do tecido embrionário de camundongo¹³. Além disso, a especificidade do depósito não pode ser investigada com este modelo e pode não refletir totalmente a fisiologia dos adipócitos humanos¹⁴. Outros laboratórios trabalham com células adiposas isoladas de depósitos de gordura murina, mas a distribuição de gordura não é dimórfica em camundongos e a configuração anatômica da cavidade abdominal do roedor impede a extrapolação direta para humanos¹⁵. Para estudar os adipócitos no contexto da fisiopatologia da obesidade humana, a consideração da distribuição da gordura corporal e das diferenças específicas do depósito de gordura tornou-se essencial¹⁶. Algumas limitações das culturas primárias de pré-adipócitos, incluindo quantidades de células obtidas de amostras de biópsia de tecido adiposo e sua senescência após algumas passagens na cultura, criaram a necessidade de modelos alternativos. Perrini e colaboradores investigaram a especificidade do depósito na expressão gênica de células DFAT originárias da gordura visceral e subcutânea e as compararam com células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASC) do mesmo depósito de gordura. Eles demonstraram que as diferenças na expressão e função gênica foram encontradas principalmente entre depósitos do que entre tipos de células, sugerindo que as células DFAT são fisiologicamente próximas do ASC do mesmo depósito. As células DFAT podem representar uma alternativa interessante aos modelos disponíveis para estudos sobre distribuição de gordura na fisiopatologia da obesidade humana. Além disso, a cultura de teto é um método promissor para obter células-tronco adultas para fins de engenharia de tecidos.

Aqui, descrevemos a digestão da colagenase, uma técnica amplamente utilizada para isolar adipócitos maduros das amostras de gordura subcutânea e/ou visceral¹⁷, e as etapas subsequentes para realizar a cultura de teto e desdiferenciar essas células em células multipotentes, semelhantes a fibroblastos.

Protocolo

Declaração de Ética: O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da IUCPQ antes de recrutamento de pacientes. Para efeitos deste artigo / vídeo, obtivemos tecidos a partir de 2 pacientes: 1) um paciente do sexo masculino 62 anos de idade, com um IMC de 50,7 kg / m ² e 2) uma paciente de 35 anos de idade, com um IMC de 57 kg / m ^2. Experiências pode ser feito com ambos os compartimentos de gordura, mas têm sido limitadas a um compartimento de gordura para o propósito deste vídeo. Aspectos técnicos do vídeo foram realizadas com o paciente 1 e FABP4 imunofluorescência foi realizada com células indiferenciadas de paciente 2.

Processamento 1. Amostra

1. Peça cirurgiões para coletar tecido adiposo dos compartimentos de gordura omental e subcutâneas, no momento da cirurgia bariátrica laparoscópica.
2. Rapidamente trazer amostras de tecido adiposo para o laboratório da RT e processar imediatamente.
3. Executar a digestão no laboratório, numa atmosfera não-estéril. Océlulas acabará por ser transferida para a sala de cultura e cultivado em condições estéreis. Para evitar a contaminação, preparar tampão de KRH com água destilada e filtrou-se e seguir por filtração (filtro de 0,22 um) antes da digestão. Tubos cuidadosamente limpos com etanol prévia de transferência na capa de cultura celular para frasco e placa preparação.
4. Coloque o tecido adiposo em um prato pré-pesados ​​e peso recorde. Fixar um pequeno pedaço de cada amostra de tecido (menos de 1 cm ²⁾ em tampão de formalina a 10% à temperatura ambiente durante pelo menos 24 horas antes do bloco de parafina. Utilize esta amostra embutido para experimentos de imunohistoquímica (técnica não apresentado).
5. Coloque outra peça em um tubo de 50 ml e flash por congelação em azoto líquido antes do armazenamento a -80 ° C para estudos posteriores sobre os tecidos adiposos inteiros (por exemplo, a expressão do gene - técnica não mostrado).

2. Collagenase Digestão

1. Coloque o pedaço de tecido adiposo remanescente em 50 ml de um tuser para a digestão.
2. Adicionar 4 ml de KRH-WB suplementados com colagenase (350 U / ml) por grama de amostra no tubo de digestão.
3. Picar o tecido adiposo com uma tesoura.
4. Coloque suspensão de tecido adiposo picada num agitador, 37 ° C, máximo de 90 rpm, durante um período de incubação de 45 minutos (máximo 1 h).

3. Purificação de adipócitos e pré-adipócitos

1. Despeje a solução translúcida com alguns pedaços de gordura através de um nylon 400? M malha em um copo de plástico.
2. Com uma pinça, esfregue a preparação de células na malha de nylon e lavar com 5 ml de KRH-WB.
3. Delicadamente transferir a suspensão de células filtrada para um tubo de 50 ml com o tubo de plástico em que uma seringa de 60 cc e ligado na extremidade de tubos.
4. Deixe a suspensão com adipócitos maduros repouso durante aproximadamente 10 min, permitindo que as células atingissem a parte superior do tampão por flutuação.
5. Lentamente aspirar o tampão na parte inferior do tubo por meio de 60cc Syrinsucção ge.
6. Adicionar 20 ml de KRH-WB para lavar. Repita a partir do passo 3.4 para 2 lavagens adicionais.
7. Recolhe-se o tampão para trazer a suspensão dos adipócitos para um volume final de 5 ou 10 ml, dependendo da quantidade de células. Prosseguir com etapas na seção 5.
8. Recuperar a fracção do estroma vascular do tampão recolhido com a seringa de 60 cc por centrifugação (3000 rpm, TA, 5 min), para posterior cultura de células primária, se desejado (técnica não mostrado).

4. adipócito maduro Contagem de Células

1. Carregar 10 ml de suspensão de adipocitos suavemente agitada em uma câmara de contagem (hemocitómetro). Efectuar a contagem de células em quadruplicado.
2. Calcular o número de células maduras isoladas.

5. maduro adipócito Dedifferentiation em T-25 Flask

1. Encha a 25 ^cm2 de cultura de tecidos frasco a ¾ do volume com DMEM / F12-20% de soro.
2. De acordo com a contagem de células, despeje 500.000 células maduras no balão.
3. Encher o balão completamente através de um tubo de 50 ml com meio e retire o máximo de bolhas possível.
4. Colocar a tampa não ventilado no frasco.
5. Limpar o balão com etanol antes da incubação para evitar a contaminação.
6. Incubar o frasco de cabeça para baixo por uma semana sem tocá-lo para evitar o movimento na cultura que possa interromper a adesão celular.
7. Antes de inverter o frasco a 7 dias de cultura invertido, manipular suavemente o frasco e remover todo o meio no frasco por aspiração, evitando movimentos bruscos.
8. Adicionar 12 ml de DMEM-F12-20 soro% bezerro e cultivar células com técnicas convencionais. Um filtrada, tampa ventilada pode ser adicionado ao frasco.

6. adipócito maturo desdiferenciação em uma placa de 6 poços

1. Coloque uma lamela sobre o fundo de cada poço de uma placa de 6 poços
2. Adicionar um ½ "bucha de plástico em cima de cada lamela.
3. Encha os poços com 8 ml de 20% de meio de soro de vitelo-DMEM.
4. Coloque uma lamela em cada bucha de plástico.
5. Insira ponta da pipeta entre a lâmina e o tubo para injetar células sob o slide (50.000 células por poço).
6. Incubar as placas numa incubadora de cultura de células padrão, a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante uma semana.
7. Lamela reverso com células ligadas em todos os poços contendo 2 ml de meio suplementado com 20% de soro de bezerro e perseguir cultura.
8. Use lamela com células submetidos desdiferenciação para vários fins, incluindo a imunofluorescência (técnica não mostrado).

Resultados

As principais alterações morfológicas ocorrer a amadurecer adipócitos durante desdiferenciação (Figura 1). Como mostrado na Figura 2, as células submetidas a desdiferenciação foram coradas com um anticorpo anti-FABP4 para análise de fluorescência. As células com uma morfologia redonda expressa a proteína FABP4 enquanto a maioria das células semelhantes a fibroblastos não o fez. Depois de desdiferenciação, células DFAT pode ser cultivada com os procedimentos padrão para diversas passagen...

Discussão

Desdiferenciação de adipócitos maduros com a técnica de cultura de tecto é uma nova abordagem para a obtenção de células estaminais do tecido adiposo a partir de uma pequena amostra de tecido adiposo nativa. Com base em nossa experiência e na de outros ^dois, um grama de tecido é suficiente para a chapa um balão de 25 cm ² e obter uma população de células DFAT para que homogeneidade tem sido demonstrado por Poloni e colaboradores ^3. Adipócito desdiferenciação parece possível com células d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina de soro bovino	Sigma	A7906
Adenosina	Sigma	A4036
Ácido ascórbico	Sigma	A0278
NaCl			Qualquer marca pode ser usada
KCl			Qualquer marca pode ser usada
CaCl2			Qualquer marca pode ser usada
MgCl2			Qualquer marca pode ser usada
KH2PO4			Qualquer marca pode ser usada
HEPES			Qualquer marca pode ser usada
Glicose			Qualquer marca pode ser usada
Tipo I colagenase	Worthington Biochemical Corp	LS-004196
DMEM/F-12, HEPES, sem fenol vermelho	Gibco-Life Technologies	11039-021	Adicione ao meio : 20% de soro de bezerro, gentamicina (50 µ g/ml) e fungizone (2,5 µ g/ml)
Soro de bezerro, suplementado com ferro, de bezerros alimentados com fórmula	Sigma	C8056-500 ml
1/2 Em bucha de plástico	Iberville	2704-CP	SKU:1000120918 (Home Depot)
Nitrogênio líquido	Linde
Soluton de formalina, tamponado neutro, 10%	SIGMA	HT501128
Pinças
			estéril
Seringas de 60 cc	Seringa
Tubo de
plástico Krebs-Ringer-Henseleit tampão de estoque (KRH)			Prepare o tampão de estoque da seguinte forma: 25 mM HEPES pH 7,6, 125 mM NaCl, 3,73 mM KCl, 5 mM CaCl2,2H2O, 2,5 mM MgCl2,6H2O, 1 mM K2HPO4. Ajuste o pH para 7,4.
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)			Adicione os seguintes componentes recentemente ao tampão KRH: 4% de albumina de soro bovino, 5 mM de glicose, 0,1 µ M adenosina, 560 µ M ácido ascórbico
KRH-WB suplementado com colagenase			Adicionar 350 U/ml de colagenase Tipo I
T25 frasco de cultura de tecidos com tampa não ventilada	Sarsted ou outra marca
Placa de cultura de tecidos de 6 poços	BD Falcon ou outra marca
Vidro de cobertura do microscópio 22x22	Fisherbrand	12-542-B
Copos		estéreis

estéreisTesoura BD Tipo I