Os adipócitos maduros podem representar uma fonte abundante de células-tronco por meio da desdiferenciação, o que leva a uma população homogênea de células semelhantes a fibroblastos. A digestão da colagenase é usada para isolar adipócitos maduros da gordura humana. O objetivo do nosso protocolo é obter células de gordura multipotentes e desdiferenciadas a partir de adipócitos humanos maduros.
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Artigo de método
Geração de adiposo humano Stem Cells através Dedifferentiation de adipócitos maduros em Culturas de teto
Neste artigo
Resumo
Resumo
Foi demonstrado que os adipócitos maduros revertem seu fenótipo em células semelhantes a fibroblastos in vitro por meio de uma técnica chamada cultura de teto. Os adipócitos maduros também podem ser isolados do tecido adiposo fresco para caracterização específica do depósito de sua função e propriedades metabólicas. Aqui, descrevemos um protocolo bem estabelecido para isolar adipócitos maduros de tecidos adiposos usando digestão de colagenase e etapas subsequentes para realizar culturas de teto. Resumidamente, os tecidos adiposos são incubados em um tampão Krebs-Ringer-Henseleit contendo colagenase para romper a matriz tecidual. Os adipócitos maduros flutuantes são coletados na superfície superior do tampão. As células maduras são colocadas em um frasco T25 completamente cheio de meio e incubadas de cabeça para baixo por uma semana. Uma abordagem alternativa de cultura em placas de 6 poços permite a caracterização de adipócitos em desdiferenciação. A morfologia dos adipócitos muda drasticamente ao longo do tempo de cultivo. A imunofluorescência pode ser facilmente realizada em lâminas cultivadas em placas de 6 poços, conforme demonstrado pela coloração de imunofluorescência FABP4. A proteína FABP4 está presente em adipócitos maduros, mas regulada negativamente por meio da desdiferenciação das células adiposas. A desdiferenciação de adipócitos maduros pode representar um novo caminho para a terapia celular e engenharia de tecidos.
Introdução
A desdiferenciação in vitro de adipócitos maduros é alcançada por meio de uma técnica chamada cultura de teto1. Devido à sua tendência natural de flutuar em soluções aquosas, os adipócitos maduros isolados aderem à superfície de um frasco invertido totalmente preenchido com meio de cultura. Ao longo de alguns dias, as células modificam sua morfologia esférica e se tornam células semelhantes a fibroblastos. As células resultantes, chamadas de células de gordura desdiferenciada (DFAT), são multipotentes2. Artigos de pesquisa sobre desdiferenciação de adipócitos, especialmente em células humanas, são limitados. No entanto, eles já fornecera....
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Protocolo
Declaração de Ética: O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da IUCPQ antes de recrutamento de pacientes. Para efeitos deste artigo / vídeo, obtivemos tecidos a partir de 2 pacientes: 1) um paciente do sexo masculino 62 anos de idade, com um IMC de 50,7 kg / m 2 e 2) uma paciente de 35 anos de idade, com um IMC de 57 kg / m 2. Experiências pode ser feito com ambos os compartimentos de gordura, mas têm sido limitadas a um compartimento de gordura para o propósito deste vídeo. Aspectos técnicos do vídeo foram realizadas com o paciente 1 e FABP4 imunofluorescência foi realizada com células indiferenciadas de paciente 2.
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Resultados
As principais alterações morfológicas ocorrer a amadurecer adipócitos durante desdiferenciação (Figura 1). Como mostrado na Figura 2, as células submetidas a desdiferenciação foram coradas com um anticorpo anti-FABP4 para análise de fluorescência. As células com uma morfologia redonda expressa a proteína FABP4 enquanto a maioria das células semelhantes a fibroblastos não o fez. Depois de desdiferenciação, células DFAT pode ser cultivada com os procedimentos padrão para diversas passagen.......
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Discussão
Desdiferenciação de adipócitos maduros com a técnica de cultura de tecto é uma nova abordagem para a obtenção de células estaminais do tecido adiposo a partir de uma pequena amostra de tecido adiposo nativa. Com base em nossa experiência e na de outros dois, um grama de tecido é suficiente para a chapa um balão de 25 cm 2 e obter uma população de células DFAT para que homogeneidade tem sido demonstrado por Poloni e colaboradores 3. Adipócito desdiferenciação parece possível com células d.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá Discovery Grant (371697-2011, AT). Os autores querem agradecer a ajuda dos cirurgiões bariátricos Drs. S. Biron, FS. Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau, bem como Christine Racine e Caroline Gagnon do Banco de Tecidos IUCPQ. Agradecemos ao Sr. Jacques Cadorette, dos serviços audiovisuais da IUCPQ, pela gravação e edição de vídeo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Albumina de soro bovino | Sigma | A7906 | |
| Adenosina | Sigma | A4036 | |
| Ácido ascórbico | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Qualquer marca pode ser usada | ||
| KCl | Qualquer marca pode ser usada | ||
| CaCl2 | Qualquer marca pode ser usada | ||
| MgCl2 | Qualquer marca pode ser usada | ||
| KH2PO4 | Qualquer marca pode ser usada | ||
| HEPES | Qualquer marca pode ser usada | ||
| Glicose | Qualquer marca pode ser usada | ||
| Tipo I colagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, sem fenol vermelho | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Adicione ao meio : 20% de soro de bezerro, gentamicina (50 µ g/ml) e fungizone (2,5 µ g/ml) |
| Soro de bezerro, suplementado com ferro, de bezerros alimentados com fórmula | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 Em bucha de plástico | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
| Nitrogênio líquido | Linde | ||
| Soluton de formalina, tamponado neutro, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Pinças | |||
| estéril | |||
| Seringas de 60 cc | Seringa | ||
| Tubo de | |||
| plástico Krebs-Ringer-Henseleit tampão de estoque (KRH) | Prepare o tampão de estoque da seguinte forma: 25 mM HEPES pH 7,6, 125 mM NaCl, 3,73 mM KCl, 5 mM CaCl2,2H2O, 2,5 mM MgCl2,6H2O, 1 mM K2HPO4. Ajuste o pH para 7,4. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Adicione os seguintes componentes recentemente ao tampão KRH: 4% de albumina de soro bovino, 5 mM de glicose, 0,1 µ M adenosina, 560 µ M ácido ascórbico | ||
| KRH-WB suplementado com colagenase | Adicionar 350 U/ml de colagenase Tipo I | ||
| T25 frasco de cultura de tecidos com tampa não ventilada | Sarsted ou outra marca | ||
| Placa de cultura de tecidos de 6 poços | BD Falcon ou outra marca | ||
| Vidro de cobertura do microscópio 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Copos | estéreis |
Referências
- Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fa....
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Reimpressões e permissões
