Zebrafish queratinócitos explantes para estudar migração celular Collective e reepitelização na cicatrização de feridas cutâneas

Resumo

Ceratócitos Zebrafish migrar em folhas de células a partir de explantes e proporcionam um modelo in vitro para o estudo dos mecanismos de migração celular colectiva no contexto da reparação epitelial. Estes protocolos detalhe uma maneira eficaz para estabelecer culturas de explantes primários para utilização em ensaios de migração de células coletivas.

Resumo

Devido às suas propriedades únicas motilidade, ceratócitos de peixe dissociadas a partir de culturas de explantes têm sido usadas para estudar os mecanismos de migração de célula única. No entanto, quando explantes são estabelecidas, estas células também se movem coletivamente, mantendo muitas das características que tornam indivíduo queratócitos um modelo atraente para estudar a migração: as rápidas taxas de motilidade, extensa lamelas ricos em actina com um cabo de actina perpendicular e velocidade relativamente constante e direcção da migração. No início dos explantes, a rápida interconversão de células que migram individualmente com as que migram colectivamente permite o estudo do papel de adesões célula-célula na determinação do modo de migração, e enfatiza as ligações moleculares entre os dois modos de migração. As células em explantes posteriores perdem a capacidade de migrar rapidamente e coletivamente como um epitelial para mesenquimal ocorre e genes associados com a cicatrização de feridas e inflamação são diferencialmente expressos. Assim, os explantes de ceratócitos pode servir como um modelo in vitro para a re-epitelização que ocorre durante a cicatrização de feridas cutâneas e pode representar um único sistema para estudar os mecanismos de migração celular colectiva no contexto de um programa definido de alterações da expressão do gene. Uma variedade de linhas de peixe-zebra mutantes e transgênicos estão disponíveis, o que permite que explantes de ser estabelecida a partir de peixe com diferentes origens genéticas. Isto permite que o papel de proteínas diferentes dentro destes processos a serem endereçados com exclusividade. Os protocolos descritos aqui descrevem um método simples e eficaz para o estabelecimento destas culturas de explantes para utilização numa variedade de ensaios relacionados com a migração de células colectiva.

Introdução

Estudos da motilidade celular tradicionalmente focada em células que migram individualmente. Queratócitos cultivadas a partir de peixes e explantes de anfíbios têm provado ser um poderoso sistema modelo para estudar os mecanismos de motilidade celular utilizando a modelagem tanto experimental e matemática aproxima ^1-6. O trabalho experimental em células migratórias individualmente é auxiliado pelo movimento de deslizamento rápido, suave das células, mantendo ao mesmo tempo uma forma uniforme, a velocidade ea direcção. No entanto, in vivo, as células frequentemente mover-se em conjunto enquanto se mantém junções célula-célula, particularmente durante o desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas e metástases. Assim, a migração de células coletivo é uma crescente e cada vez mais importante área de pesquisa no campo da migração celular. A migração coletiva dessas células foi recentemente descrito ⁷ e tem muitas características únicas que a tornam um poderoso sistema para estudar a migração de células coletiva em um modelo de cicatrização de feridas.

ove_content "> Quando as escalas são arrancadas de um peixe-zebra adultos anestesiados, algum tecido epitelial permanece presa à parte inferior da escala. Quando o meio de cultura de células são adicionados, estas células epiteliais, ou ceratócitos, migram rapidamente como uma unidade colectiva a partir da escala. O cultura de explante pode ser visto como um modelo de cicatrização do epitélio da ferida, em que as células migram para longe do explante como fariam através da matriz provisória de um leito da ferida para restabelecer um epitélio intacto. Dados recentes sugerem que esta imita a cultura ex vivo de muitos recursos cicatrização de feridas in vivo em peixes-zebra adultos. taxas de encerramento de feridas ⁸ traduzir a uma velocidade de migração semelhante ao observado no sistema ex vivo ^7. Além disso, num modelo in vivo de ferida cura, o tratamento com varfarina sugere que a hemostase tem nenhum efeito sobre a taxa de cura, enquanto que o tratamento com hidrocortisona, para diminuir a resposta imune não atrase reepitelização ⁸ . À medida que o peixe-zebra não sangrar quando a escala é retirado do animal, a hemostase não desempenha um papel importante. Embora tenhamos encontrado células imunes em explantes, que não estudaram os efeitos que possam ter na migração celular coletivo.

O protocolo aqui apresentado descreve como estabelecer culturas de peixes-zebra de ceratócitos de explante a assegurar a consistência e reprodutibilidade para utilização em diversos ensaios biológicos. Estas culturas de explantes são particularmente atraente modelo in vitro para a migração celular coletivo por várias razões. Primeiro, keratocytes peixe-zebra são células primárias utilizadas dentro das horas de estabelecimento de culturas de explantes. Portanto, estas células não foram submetidos aos morfológicas e as mudanças de expressão de genes associados com a passagem de pilhas ^13/09. Em segundo lugar, este sistema representa um modelo para o estudo de reepitelização de resposta do ferimento ¹⁴ e, como parte da resposta a ferimentos, um epitelial para mesênquima transition processo (EMT) é iniciada como evidenciado pelas alterações na expressão de genes e rearranjos do citoesqueleto ^14,15. Assim, as alterações na expressão de genes de fundo e a motilidade, que ocorrem em células não tratadas foram caracterizados e fornecer um contexto para interpretar alterações com o tratamento. Além disso, o peixe e a ceratócitos de queratinócitos humanos são funcionalmente equivalente; ambos são as células epiteliais primárias das respectivas espécies e desempenham um papel chave na reparação epitelial. Em terceiro lugar, peixe-zebra adulto estão ganhando reconhecimento como um sistema modelo para uma variedade de doenças humanas ^16-18 incluindo melanoma e outros cancros ^19-21, cicatrização de feridas cutâneas ^8,14 e regeneração de tecidos ^22-24.

Vantagens técnicas deste sistema modelo são igualmente convincentes. Um número crescente de linhas de mutantes e transgênicos estão disponíveis sem fins lucrativos, instalações centralizadas. Especificamente, a mutação Projecto de peixe-zebra (ZMP) Do Instituto Wellcome Trust Sanger visa criar um alelo nocaute em todos os codificadores de proteínas gene no genoma do peixe-zebra. Actualmente, eles têm mutado 11.892 genes, aproximadamente 45% do genoma, com 24.088 alelos caracterizadas. Além disso, ZMP aceita propostas e irá gerar knock-out gratuitamente. Métodos recentes em knockdown gene em larva e adulto zebrafish ^25-28 fornecem flexibilidade para estudar a função de genes developmentally importantes para que as abordagens transgênicas são problemáticos ou impraticáveis.

Devido às suas taxas extremamente rápidas de motilidade de ~ 145 mm / h pouco tempo após o estabelecimento de culturas de ^29, os ensaios podem ser concluída rapidamente (geralmente em 24 horas ou menos). Como as experiências podem ser concluídos rapidamente e culturas crescem bem à TA, vários dos problemas técnicos associados com os ensaios de migração de células de mamíferos envolvendo microscopia vídeo são evitados. Além disso, na era de apertar os orçamentos de investigação, zebrafish são fácil e barata mantida.

A estrutura eo comportamento do explante é complexa. Como os peixes não sangram quando a escala é removida, não é provável que muito mais do que as camadas superficiais da epiderme são removidos com a escala. Queratinócitos parecem ser o tipo de célula predominante na explante, quando escalas são inicialmente removida do peixe, como a grande maioria das células parecem mancha com um anticorpo anti-E-caderina ^14. Além disso, não há nenhuma evidência de fibroblastos em cultura inicial, tal como avaliado pela ausência de coloração por imunofluorescência ¹⁴ vimentina. No entanto, com a remoção repetida escala, parece haver numerosos neutrófilos no explante (ver vídeo 1). Foram identificadas estas células como neutrófilos com base em observações morfológicas do tamanho, motilidade rapidamente, e a sua migração para fora da camada de células quando expostos a LPS (dados não mostrados). Além disso, essas células manchar sagacidade brilhantementeh um anticorpo de factor de citosólica de neutrófilos, bem como com uma variedade de anticorpos IgG secundários, o que indica que eles têm FcR abundantes na sua superfície (dados não apresentados). Várias camadas de células estão presentes dentro do explante. A microscopia confocal revela a presença de uma única camada de perto o bordo de ataque para mais do que duas camadas de queratinócitos perto da escala com neutrófilos visíveis acima, abaixo, e entre as folhas de ceratócitos de células.

Em pontos de tempo iniciais, as células sobre a borda do explante polarizar multi-camada, iniciando a migração de queratinócitos de colectiva a partir do explante a taxas iniciais de ~ 145 mm / h. A área coberta pelo explante aumenta rapidamente, levando a célula de difusão, a tensão no interior da folha, e uma diminuição da velocidade de avanço do bordo de ataque. Interconversões rápidos entre as células líder e do seguidor são observadas no bordo de ataque durante a formação e fecho dos orifícios formados espontaneamente dentro da folha ^7. Como oProcesso EMT iniciado com o explante continua, os fragmentos de folhas e as keratocytes perdem sua, motilidade rápida especializada. A expressão genética e alterações morfológicas compatíveis com EMT, cicatrização de feridas, e as respostas inflamatórias ocorrem no prazo de 7 dias de cultura com explantes sendo considerado viável para aproximadamente 10 dias ^14.

Protocolo

Este protocolo está em conformidade com os princípios de bem estar animal AVMA para o cuidado e uso de animais de laboratório e foi aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade de Midwestern.

1. Preparação de Anestesia, Equipamento, & Media

1. Dechlorinate aproximadamente 1,5 L de água da torneira usando um agente comercial dechlorinating (disponível em lojas de animais) ou deixando água parada por 24 horas. Obter três taças 1 L e encher cada uma com 500 ml água sem cloro. Rotular um para a realização de peixe antes de qualquer procedimento e outro para a recuperação. Para o terceiro balão, adicionar 100 ug / ml de tricaina metanossulfonato; isso se torna o copo em que os peixes serão anestesiados.
2. Encher um tabuleiro raso com gelo, aquecer o meio de cultura (RPMI 1640, 10% de FBS (soro fetal bovino), 50 ug / ml de gentamicina, 100 ug / ml de canamicina, 25 mM de HEPES) à TA, e recolher uma pinça de joalheiro limpo. Pinças limpas por immercante as pontas em etanol a 70% e passar através de um bico de Bunsen, permitindo que o etanol para queimar.
3. Decida se o procedimento será realizado sem ampliação, com um, table-top iluminado lupa comercial com 2 - aumento de 10x, ou microscópio de dissecação (totalmente dependente da preferência pessoal).

2. Estabelecer culturas de explantes

1. Pegar o número desejado de peixe e coloque em um copo de exploração. Transferir um único peixe para o copo de anestesia; é melhor para anestesiar peixes individualmente.
2. Monitorar os efeitos da anestesia através da observação da natação e de emalhar movimento do peixe. Como anestesia progride, o movimento de emalhar desacelera e os peixes vão nadar de forma irregular e muitas vezes de cabeça para baixo; considerar peixes anestesiados, logo que o movimento de emalhar cessa. Não deixar o peixe por períodos mais longos no banho de anestesia como isto pode resultar na morte do peixe.
3. Retire o peixe do copo anestesia e transferênciade gelo, colocando o peixe horizontalmente com o rabo virado para a mão que segurava a pinça. Se experimentou com a técnica e se vários peixes são para ser usados ​​para fazer explantes, considerar a colocação próximo de peixe no copo de anestesia neste momento.
4. Para remover as escamas, pinças posição paralela ao peixe com ponta na borda da escala. Deprimir lado plano das pinças ligeiramente para o lado do peixe para fazer com que a escala para elevar a partir do corpo do peixe. Segure escala, com uma pinça, arranque, e lugar (sem inversão) em cultura de tecidos prato. Repetir o procedimento, a remoção de um máximo de 12 escalas de um grande de adultos (6 a partir de cada lado), evitando a região branquial, a linha lateral, e barbatanas.
5. Coloque o peixe no copo de recuperação e monitoramento para garantir que ele se recupera dos efeitos da anestesia. Neste momento, o peixe pode ser transferido de volta para um tanque individual. Permitir que o peixe se recuperar durante pelo menos 21 dias para permitir a regeneração de escala completa.
6. Dependendo dodelineamento experimental, coloque até 20 escalas por 35 milímetros de plástico tecido tratado com placa de cultura ou 4-6 escalas por prato de vidro de fundo. Permitir escalas para aderir ao prato antes da adição suavemente meios, de modo a não retirar escalas a partir do prato.
   NOTA: Com experiência, vários peixes podem ser processados ​​antes que a mídia é adicionado ao primeiro prato.
7. Adicionar 1,2 ml de meio completo (ver 1.2 acima) para cada 35 milímetros prato.
8. Preferencialmente incubar culturas de explantes a 28 ° C em 5% de CO ₂ durante o período de tempo desejado, com ou sem tratamento adicional. Alternativamente, incubar as culturas num palco de microscópio aquecida ou dentro de uma câmara de cultura de células vivas por microscopia de vídeo.

3. Brightfield e Vídeo Microscopia

1. Pratos de posição com folhas de celulares para o palco microscópio e, inicialmente, focar utilizando a lente objetiva de 4X.
   NOTA: Superior ampliações podem ser usadas, dependendo da experiência. Marcando o local docada folha e / ou a orientação do prato sobre o estágio de célula irá facilitar a tomada de imagens ao longo do tempo com as folhas de, aproximadamente, a mesma orientação.
2. Retirar pratos da incubadora e fotografia em vários momentos, de acordo com cada protocolo experimental e coloque de volta para a incubadora se apenas imagens estáticas são necessários sobre o período de tempo experimental.
3. Durante a realização de microscopia de vídeo, preste atenção ao seguinte:
   1. Posicionar o / camada de células emergindo escala dentro do campo de visão tal que a folha de células migrando permanece no campo de visão para a duração do vídeo.
      NOTA: Este processo pode demorar um pouco de experiência em observar como as células migram de acordo com a escala. Para vídeos de curta duração, esta é uma preocupação menor do que para os vídeos mais longos.
   2. Para prazos mais curtos, incubar a RT. Para prazos mais longos (18 + hr), use uma fase aquecida ou uma câmara de incubação para manter a temperatura, o equilíbrio do pH, e para minimizar a evaporação da cultura medium.

4. Fixação de imunofluorescência Microscopia

1. Preparar e pré-quentes todas as soluções a 28 ° C. Para visualizar keratocytes sob fluorescência, crescer culturas de explantes como descrito acima, utilizando 35 milímetros pratos de cultura de tecidos com fundo de vidro. Alternativamente, usam lâminas de câmara de vidro.
2. Adicionar 0,8 ml de 4% de paraformaldeído em 1,1 x PBS a cada prato. Não retire os meios de cultura em primeiro lugar. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min, em seguida, aspirar para remover a solução.
3. Adicionar 0,8 ml de 4% de paraformaldeído em 1,1 x PBS a cada prato. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min, em seguida, aspirar para remover a solução.
4. A menos que usando ligandos externos ou epitopos externos, permeabilizar as células por adição de 0,5 ml de 0,2% de Triton X-100 em PBS 1X. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min, em seguida, aspirar para remover a solução.
5. Adicionar 0,5 mL de BSA a 1% em PBS 1x e incubar durante 1 hora (à temperatura ambiente) ou O / N (a 4 ° C).
   NOTA: Dependendo das condições experimentais, phalloidin podem ser adicionados neste passo.
6. Após a incubação, aspirado para remover a solução e prosseguir com coloração de anticorpos. Alternativamente, armazenar as placas de cultura pela adição de pelo menos 1 - 2 ml de 1% de BSA em 1 x PBS durante 3 - 4 semanas a 4 ° C.

5. Protocolo de imunofluorescência

1. Preparar soluções de anticorpos primários e secundários de acordo com as recomendações do fabricante.
   NOTA: Se as recomendações do fabricante não estão disponíveis, uma boa diluição de partida de anticorpos primários (em 1% de BSA em PBS 1x) é de 1: 500 de anticorpos policlonais e 1: 1000 para os anticorpos monoclonais; uma boa diluição de partida para os anticorpos secundários é de 1: 1000. Ajuste estas diluições de estoque original obtida a partir do fabricante mais elevada se o sinal é fraco, mais baixa se o sinal é forte e o fundo é um problema.
2. Aspirar o BSA a 1% em solução de PBS 1x. Adicionar 0,5 ml de solução de anticorpo primário e incubar durante 1 hora (à temperatura ambiente) ou O / N (a 4 ° C).
3. Remover a solução de anticorpo primário, colocar num limpo e marcado com 1,5 ml de tubo de microcentrífuga, e congelar a -20 ° C.
   NOTA: Este permite a reutilização do anticorpo primário, se necessário.
4. Lavar a cápsula 3-5 vezes com PBS 1x, removendo e descartando o PBS após cada lavagem.
5. Adicionar 0,5 ml de solução de anticorpo secundário. Se desejado, adicionar-faloidina fluorescente marcado (a seguir concentração recomendada de qualquer fabricante) durante este passo. Incubar durante 1 hora (à temperatura ambiente) ou O / N (a 4 ° C).
   NOTA: O uso de faloidina marcada com fluorescência permite a visualização dos filamentos de actina; verificou-se que 488-faloidina etiquetada funciona melhor nos queratinócitos de peixe-zebra, mas outros fluoróforos podem ser utilizados.
6. Remova e descarte a solução de anticorpo secundário.
7. Lavar a cápsula 3-5 vezes com PBS 1x, removendo e descartando o PBS após cada lavagem.
   NOTA: O prato pode ser armazenado, coberto de luz, a 4 ° C, se incapaz de view imediatamente; certifique-se de 1x PBS é adicionado ao prato antes de armazenar para assegurar que as células não secam, mas quente até à temperatura ambiente (20 - 30 min), em seguida, remover o PBS imediatamente antes de prosseguir para o próximo passo.
8. Quando estiver pronto para observar, adicionar 2 - 3 gotas de um meio de suporte, com ou sem DAPI, dependendo das necessidades experimentais, no prato e deixar repousar durante 10 min à TA.
   NOTA: Nós usamos um meio de montagem disponível comercialmente, à base de glicerol com DAPI, mas outros meios de montagem podem ser utilizados. 10 min para permitir que o meio de montagem para sentar-se no prato facilita a remoção da lamela de vidro a partir do fundo do prato.
9. Após a incubação, apertar suavemente sobre os lados do prato para soltar e remover a lamela. Adicionar uma queda adicional de meio de montagem sobre uma lâmina de vidro e coloque a lamela, células para baixo, para o slide.
   NOTA: Considere selar a lamela para o slide usando claro unha polonês se a lâmina precisa ser mantido por mais de 1-2 dias.
10. Observe a deslizar sob um microscópio de fluorescência.
    NOTA: A maioria de nossas imagens foram feitas usando uma lente de 40X ou 63X objetivo de imersão em óleo, mas a lente objetiva específica utilizada vai depender do protocolo experimental.

Resultados

Como ilustrado na Figura 1, as folhas de queratinócitos pode ser observado a migração para fora de debaixo da escala dentro de horas, que estabelece a cultura de explantes. Ocasionalmente, um queratinócitos migrar individualmente que rompeu com a folha de migrar coletivamente podem ser observados. Além disso, como o explante foi estabelecida a partir de um peixe que tinha sido previamente arrancado, existem neutrófilos abundantes que migram através da folha. Em períodos mais longos de cultura, os fragme...

Discussão

A etapa mais importante para o sucesso da cultura de ceratócitos explante é permitir que a escala de aderir à placa de cultura para cerca de 2 - 3 minutos antes da adição do meio de cultura. Aproximadamente 75% de escamas irá aderir e crescer folhas (o número de culturas estabelecidas para cada experimento terá de ser ajustado em conformidade). Folhas de queratinócitos não formar em torno de cada escala removido do peixe e colocadas em cultura por vários motivos. Em primeiro lugar, coloração DAPI explantes revela que al...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
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