Screening Semi-High Throughput para o Potencial tolerância à seca em alface ( Lactuca sativa) Germoplasma Colecções

Resumo

Este protocolo foi desenvolvido para rastrear uma grande coleção de germoplasma da alface vegetal folhosa (Lactuca sativa L.) quanto à tolerância à seca, a fim de identificar um pequeno pool candidato de alface para uso em estudos fisiológicos, moleculares e genéticos para identificar características subjacentes de tolerância à seca junto com programas de melhoramento.

Resumo

Este protocolo descreve um método pelo qual uma grande coleção de germoplasma de alface vegetal de folhas verdes (Lactuca sativa L.) foi rastreada quanto a prováveis características de tolerância à seca. A disponibilidade de água doce para uso agrícola é uma preocupação crescente nos Estados Unidos, bem como em muitas regiões do mundo. Eventos de seca de curto prazo, juntamente com a intervenção regulatória na regulação da disponibilidade de água, juntamente com a ameaça iminente de mudanças climáticas de longo prazo que podem levar à redução da precipitação em muitas regiões agrícolas importantes, aumentaram a necessidade de acelerar o desenvolvimento de culturas adaptadas para melhorar a eficiência do uso da água, a fim de manter ou expandir a produção nos próximos anos. Este protocolo não pretende ser um guia passo a passo para identificar características de tolerância à seca em nível fisiológico ou molecular na alface, mas sim um método desenvolvido e refinado por meio da triagem de milhares de variedades diferentes de alface. A natureza dessa tela é baseada em parte nas medições simplificadas com foco em apenas três indicadores de estresse hídrico: teor relativo de água nas folhas, murcha e crescimento diferencial das plantas após o estresse hídrico. O objetivo de rastrear rapidamente uma grande coleção de germoplasma é restringir o pool de candidatos a um ponto em que métodos fisiológicos, moleculares e genéticos mais intensivos possam ser aplicados para identificar características específicas tolerantes à seca em laboratório ou campo. Os candidatos também podem ser incorporados diretamente em programas de melhoramento como fonte de características de tolerância à seca.

Introdução

A disponibilidade de água para irrigação tem sido uma preocupação em grande parte dos Estados Unidos e globalmente há décadas, mas a pesquisa sobre a resposta ao estresse hídrico, juntamente com outros estresses abióticos, ficou para trás do trabalho nas áreas de resistência a doenças e insetos, nos níveis industrial, acadêmico e governamental, em grande parte devido à falta de financiamento. A disponibilidade de água para a agricultura tem sido historicamente apenas uma reflexão tardia no nível dos formuladores de políticas. Recentemente, devido a várias secas severas em importantes regiões de produção agrícola nos Estados Unidos e na Austrália, a disponibilidade de água doce^1,2 foi colocada no centro das atenções nos níveis nacional e internacional, levando a muito mais recursos sendo direcionados para pesquisas sobre o desenvolvimento de cultivares tolerantes à seca das principais culturas de grãos. Embora essa mudança de foco para o desenvolvimento de grandes culturas tolerantes à seca seja benéfica, como muitas áreas de pesquisa de plantas, as culturas especializadas foram amplamente deixadas para trás.

Uma seca severa está limitando a produção de hortaliças na Califórnia, a maior região de produção de alface (Lactuca sativa L.) nos Estados Unidos³. Esses padrões climáticos de curto prazo, juntamente com ações legislativas e judiciais, juntamente com as mudanças climáticas de longo prazo^4,5, combinaram-se para reduzir a água disponível para a agricultura em muitas das regiões mais produtivas da Califórnia. A produção de alface na Califórnia representa uma indústria de 1,5 bilhão de dólares, respondendo por quase 80% da produção de alface nos Estados Unidos³. Os vegetais folhosos têm alto teor de água nas folhas e a alface, em particular, tem um sistema radicular raso^6,7 que deixa a cultura vulnerável ao estresse hídrico. Na alface, como em todas as culturas, o desenvolvimento de variedades tolerantes à seca se tornará cada vez mais importante à medida que o suprimento de água doce para irrigação se tornar mais restrito⁸.

Este protocolo estabelece um método pelo qual uma triagem inicial foi realizada em uma grande coleção de germoplasma de alface para identificar um conjunto de linhagens candidatas potencialmente tolerantes à seca para uso em estudos fisiológicos, moleculares e genéticos para identificar características específicas de tolerância à seca. Esses candidatos também podem ser usados diretamente como fontes de tolerância à seca em programas de melhoramento para melhorar a eficiência do uso da água em cultivares comerciais. Este protocolo foi desenvolvido especificamente para enfrentar os desafios que surgem durante o curso de qualquer tela de uma extensa coleção de germoplasma, especialmente questões de disponibilidade de espaço e mão de obra. Além disso, o protocolo apresentado foi desenvolvido para uso em alface, mas foi adaptado com sucesso para uso na triagem de uma coleção de germoplasma de espinafre (Spinacia oleracea) para potencial tolerância à seca e pode ser modificado simplesmente para rastrear qualquer cultura vegetal folhosa.

Uma consideração importante antes de iniciar uma triagem de tolerância à seca é entender o que é e o que não é esse método. Este protocolo destina-se a representar um método rápido pelo qual um grande pool de germoplasma pode ser rápida e eficientemente reduzido a um número gerenciável de germoplasma candidato para uso em estudos mais focados e completos para identificar características de tolerância individuais. Este protocolo submete as plantas a um estresse hídrico severo induzido rapidamente, em contraste com um estresse hídrico contínuo moderado induzido lentamente mais natural que seria observado em condições de campo. O tipo de resposta induzida dentro da planta durante esses dois tipos de eventos de estresse hídrico (desidratação rápida versus seca natural) não é idêntico⁹, o que pode levar à exclusão de alguns materiais de testes futuros. Esses dois eventos de estresse não são isentos de sobreposição¹⁰ e este protocolo deve servir como uma maneira eficaz de identificar germoplasma potencialmente tolerante à seca contido em uma grande coleção. Este protocolo por si só não deve ser considerado suficiente para identificar com um alto grau de certeza o germoplasma que contém tolerância durável à seca em condições de estresse hídrico de campo, mas representa um passo significativo na triagem rápida de vegetais verdes folhosos para potenciais características de tolerância à seca.

Protocolo

1. Plantio

1. Preencha bandejas plugue (128 cela; 28 x 54 cm, com células 3 centímetros quadrados e 5 cm de profundidade) com mix plugue solo. Para ajudar no preenchimento uniforme de células compactar solo em cada bandeja usando uma bandeja de plugue vazio.
2. Sementes de alface Planta ¼ de polegada de profundidade 2-3 sementes por célula. Planta de todas as linhas experimentais em bandejas replicadas para fornecer tanto uma seca estressado e bandejas de controle para o julgamento de seca.
3. Coloque as bandejas de plug em uma bandeja de base sem buracos.
4. Bandejas de água e cubra com bandeja invertida ou cúpula de plástico. A germinação ocorre normalmente em 48-72 h. Após a germinação retire a tampa e mover bandejas em estufa.
   NOTA: Este protocolo também pode ser realizada em câmaras de crescimento.

2. Crescimento e plantas cuidados

1. Bandejas de água, conforme necessário 1-4 semanas após a germinação, normalmente este é 2-3 vezes por semana, através do preenchimento de bandeja inferior e permitindo que o solo a ficar saturadas (~ 1 hr) raios de se sentar por período prolongados na água, pois isso pode impactar negativamente a saúde das plantas e desenvolvimento radicular e pode afetar a tela de seca.
2. Fertilize bandejas uma vez por semana com um solúvel 20-20-20 fertilizante comercial misturado a uma taxa de 1,5 colher de chá / gal.
3. Bandejas fina para uma planta por celulares 1-2 semanas após a germinação.

3. Início de estresse hídrico

1. Quando as plantas são quatro semanas bandejas separadas em 2 grupos. Assunto um grupo ao estresse hídrico severo. Use as outras bandejas, bem regadas controles. Regue o grupo controle como no passo 2.1 durante todo o experimento. No início do estresse seca suspender fertilizar todas as bandejas para o resto da experiência.
2. O período de seca experimental ocorre ao longo de uma semana. No dia inicial do julgamento de estresse hídrico (Dia 0) preencher todas as bandejas inferiores com água e permitir que o solo nas bandejas de plug para se tornar totalmente saturado, em seguida, drenar a água da bandeja. Saturando o solo imediatamente antes do início do tele período de estresse vai ajudar a minimizar qualquer variação na umidade do solo entre as células individuais nas bandejas de ficha.

4. Realização da tela estresse hídrico básico com parâmetros a serem medidos

NOTA: As seguintes etapas descrevem como coletar as três medidas fisiológicas que serão registrados ao longo de tela a seca enquanto que a Tabela 1 apresenta um cronograma das medidas tomadas em cada dia do período experimental seca-stress.

1. Medir a Folha Relativa conteúdo de água (RWC) nos dias 0, 2, 4 do julgamento.
   1. Clipe de uma planta alface da bandeja e remover 2 folhas.
   2. Perfure 3 discos de cada folha usando uma broca de cortiça # 9 (de ~ 1,6 cm de diâmetro). Combine socos folha como uma amostra.
   3. Pese os discos de folhas, este é o valor do peso fresco (FW) utilizado para o cálculo RWC, em seguida, coloque os discos em uma placa de petri.
   4. Adicione água destilada apenas o suficiente para a placa para todosow todos os discos de folha a flutuar. Isto é para hidratar completamente os discos de folha para reunir pesos túrgidas para análise RWC. Permitir que os discos de folha para flutuar durante 24 horas à temperatura ambiente.
   5. Remover os discos foliares agora totalmente hidratados a partir das placas e secar suavemente a superfície exterior dos discos de folha com toalhas de papel antes da pesagem, os discos. Grave estes pesos como peso bombástico (TW) para o cálculo RWC.
   6. Discos de folha no lugar um laboratório de papel limpe ou disco de papel de filtro numa placa de Petri aberta e seco em estufa a 55 ° C durante 24 horas.
      NOTA: O papel impede que os discos de folha de aderir à placa de Petri durante a secagem.
   7. Pesar discos de folha seca e registre pesos como seca (MS) para o cálculo da RWC.
   8. Calcule RWC usando a fórmula de Weatherley como descrito por Smart e Bingham ^11,12.
      RWC = (FW-DW / TWDw) * 100
      FW = peso fresco, TW = peso bombástico, DW = peso seco
   9. Repita o passo 4.1 para cada germoplasma e tratamento no julgamento.
2. Grave a planta murcha início uma vez por dia no 1º dia do julgamento estresse da seca e termina quando 100% das plantas estão murchas, normalmente 4 ou 5 dias.
3. Fase de recuperação e diferencial de crescimento
   1. No dia 6, concluir o período da seca-stress e as plantas estressadas entrar na fase de recuperação do julgamento. Encha as bandejas inferiores com água e deixe as bandejas sob estresse de molho por 24 horas antes de retomar o plano de rega padrão, passo 2.1, como as bandejas de controle.
   2. Permitir que todas as plantas recuperar durante 10 dias.
   3. Aos 10 dias após a seca-stress colher toda a parte acima do solo de cada planta e registrar o peso fresco.

Resultados

Ao realizar uma tela grande, a fim de segregar uma população experimental pelo traço desejado, no caso de este protocolo de resposta seca-stress, os dados gerados será correspondentemente ser variada de muito susceptível a salientar provável tolerante a secas e todos os pontos entre eles. A Figura 1 contém gráficos que representam o tipo de resultado que pode ser esperado a partir deste protocolo. Cultivares representativos de três tipos de alface (alface romana (cos), alface crespa, e Butterhead) estão...

Discussão

Considerações do número da amostra para a tela.

O número de amostras necessárias deve ser baseada na utilização desejada dos dados a partir deste ecrã. Se os resultados de qualidade de publicação são desejados, recomenda-se colher 3 plantas individuais (3 repetições biológicas) de cada linha e realizar um mínimo de 2 repetições experimentais para dar pontos adequados para a análise estatística de qualidade. Se o resultado desejado é simplesmente para estreitar rapidamente um...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
bandeja de plugue 128	T.O. Plastics Hummert International	11-8595-1	Qualquer marca de bandeja de plugue funcionará, mas use o mesmo estilo de bandejas para todos os testes.
bandeja inferior (Bandeja de exibição)	T.O. Plastics Hummert International	11-3305-1
plug/mistura de plantio (Sunshine Mix #5)	Sunshine Hummert International	10-0467-1	Uma mistura diferente pode precisar ser substituída se este protocolo for adaptado a uma cultura diferente.  A mistura Sunshine # 4 foi usada em testes de espinafre.
fertilizante (20-20-20)	Jack's: Fertilizante solúvel em água profissional Hummert International	07-5915-1	Qualquer fertilizante pode ser usado, ajuste o tipo conforme necessário para adaptar este protocolo às necessidades específicas da cultura.