Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes

Resumo

Listeria monocytogenes causa infecções fetais em gestantes e meningite em populações suscetíveis. Subpopulações de bactérias podem colonizar tecido cardíaco, causando miocardite em pacientes e animais de laboratório. Aqui apresentamos um protocolo que descreve como avaliar a invasão de células cardíacas L. monocytogenes in vitro e colonização cardíaca em animais infectados.

Resumo

Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular facultativo gram-positivo que é capaz de causar infecções invasivas graves em pacientes imunocomprometidos, idosos e gestantes. As manifestações mais comuns de listeriose em humanos incluem meningite, encefalite e aborto fetal. Uma sequência significativa, mas muito menos documentada de infecção invasiva de L. monocytogenes envolve o coração. A taxa de mortalidade por doença cardíaca pode ser de até 35% apesar do tratamento, porém muito pouco se sabe sobre a colonização de L. monocytogenes de tecido cardíaco e suas patologias resultantes. Além disso, tornou-se recentemente evidente que as subpopulações de L. monocytogenes têm uma capacidade aumentada de invadir e crescer dentro do tecido cardíaco. Este protocolo descreve em detalhes métodos in vitro e in vivo que podem ser usados para avaliar o cardiotropismo de L. monocytogenes isolados. Métodos são apresentados para a infecção de míbios cardíacos de rato H9c2 na cultura tecidual, bem como para a determinação da colonização bacteriana dos corações dos camundongos infectados. Esses métodos são úteis não apenas para identificar cepas com potencial para colonizar tecido cardíaco em animais infectados, mas também podem facilitar a identificação de produtos genéticos bacterianos que servem para melhorar a invasão de células cardíacas e/ou promover alterações na patologia cardíaca. Esses métodos também preveem a comparação direta do cardiotropismo entre múltiplas cepas de L. monocytogenes.

Introdução

Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular gram-positivo capaz de causar doenças graves em populações suscetíveis, incluindo idosos, gestantes, pessoas com HIV/AIDS e pessoas que recebem quimioterapia¹. A infecção nessas populações é frequentemente resultado da ingestão de produtos alimentares contaminados, e a maioria das infecções estão associadas a surtos de alimentos em larga escala^2,3. Em humanos e outros mamíferos, L. monocytogenes é capaz de translocar através da fronteira epitelial do intestino delgado, sendo posteriormente transportado para o fígado^4,5. Modelos animais sugerem que as bactérias ingerida....

Protocolo

1. Condições de armazenamento e cultura para cepas de l. monocytogenes

1. Prepare a mídia sólida autoclavando o ágar de infusão cérebro-coração (BHI) e despejando a mídia derretida em placas de petri. Deixe as placas secarem durante a noite à temperatura ambiente, depois durante a noite novamente a 37 °C.
2. Usando um laço estéril, obtenha uma pequena amostra de L. monocytogenes de estoques congeladores previamente feitos (bactérias suspensas em 20% de glicerol em mídia líquida BHI, armazenadas a -80 °C) ou de uma placa de ágar contendo colônias previamente atingidas para isolamento.
3. Usando técnica asséptica, listrar a amostr....

Resultados

Isolados selecionados de L. monocytogenes exibem maior invasão de células cardíacas na cultura celular e em modelos de infecção de camundongos. A Figura 1 mostra um exemplo de como as colônias bacterianas podem aparecer após o revestimento de suspensões na mídia ágar. Este método permite uma avaliação precisa das CFUs dentro de uma amostra sem o uso de um grande número de placas de mídia ágar. A Figura 2 mostra um exemplo de um ensaio baseado em cultura tecidual comparando a cap.......

Discussão

L. monocytogenes é um patógeno humano generalizado e bem caracterizado, capaz de causar uma série de manifestações diferentes da doença¹⁵. A bactéria foi descrita anteriormente por sua capacidade de translocar através de barreiras, como a barreira hematoencefálica e as barreiras placentárias-fetais, a fim de alcançar e colonizar o sistema nervoso central e desenvolver feto, respectivamente. A capacidade in vivo do organismo de colonizar esses tecidos é muitas vezes complementada por uma capac.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
	Difco BHI Broth Base	237200	2 kg de pó de infusão de coração cerebral (sem ágar)
Difco	Agar	214510	2 kg de ágar granulado
Difco	BHI Agar	241810	2 kg de pó de infusão de coração cerebral com ágar 7,5%
in vitro	LB Broth Base	12975-084	2 kg de base de caldo Luria em pó (sem ágar)
	Fisher Glass Lamínulas	12-545-80	12 mm lamínulas de vidro
Falcon	Placa de cultura de tecidos de 24 poços	35-3047	24 poços, placa de cultura de tecidos tratada com plasma
Falcon	14mL Tubo de poliestireno	352051	14 ml Tubos de poliestireno
Falcon	96 poços Placa de fundo em U Falcon de 96 poços	35-3077	Placa de 96 poços não tratada com cultura de tecidos
Corning	0,05% Tripsina, 0,53 mM EDTA (1X)	25-052-CI	Solução estoque de tripsina EDTA para cultura de tecidos
Corning	DMEM (glicose alta, piruvato alto)	15-013-	Mídia DMEM sem FBS, glutamina ou antibióticos
Solução Corning	Pen/Strep/Glut	30-009-CI	Mistura de estoque de penicilina, estreptomicina e L-glutamina para cultura de tecidos
Corning	Gentamicin	30-005-CR	50 mg/ml Estoque, solução de gentamicina para cultura de tecidos
, Cellgro (Corning)	L-glutamina	25005197	estoque, L-glutamina solução sem antibióticos
Denville	75cm^2 Balão	T1225	75 cm2 frasco tratado para cultura de tecidos
Denville	1,5mL tubos de microcentrífuga	2013004	tubos de microcentrífuga de 1,5 ml
ATCC	H9c2 Cardíaco Mioblastos	CRL-1446	Mioblastos cardíacos de rato
Hyclone	Fetal Bovino Soro Bovino Fetal	SH30070.63	Soro Fetal Bovino