Listeria monocytogenes causa infecções fetais em gestantes e meningite em populações suscetíveis. Subpopulações de bactérias podem colonizar tecido cardíaco, causando miocardite em pacientes e animais de laboratório. Aqui apresentamos um protocolo que descreve como avaliar a invasão de células cardíacas L. monocytogenes in vitro e colonização cardíaca em animais infectados.
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Artigo de método
Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes
Neste artigo
Resumo
Resumo
Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular facultativo gram-positivo que é capaz de causar infecções invasivas graves em pacientes imunocomprometidos, idosos e gestantes. As manifestações mais comuns de listeriose em humanos incluem meningite, encefalite e aborto fetal. Uma sequência significativa, mas muito menos documentada de infecção invasiva de L. monocytogenes envolve o coração. A taxa de mortalidade por doença cardíaca pode ser de até 35% apesar do tratamento, porém muito pouco se sabe sobre a colonização de L. monocytogenes de tecido cardíaco e suas patologias resultantes. Além disso, tornou-se recentemente evidente que as subpopulações de L. monocytogenes têm uma capacidade aumentada de invadir e crescer dentro do tecido cardíaco. Este protocolo descreve em detalhes métodos in vitro e in vivo que podem ser usados para avaliar o cardiotropismo de L. monocytogenes isolados. Métodos são apresentados para a infecção de míbios cardíacos de rato H9c2 na cultura tecidual, bem como para a determinação da colonização bacteriana dos corações dos camundongos infectados. Esses métodos são úteis não apenas para identificar cepas com potencial para colonizar tecido cardíaco em animais infectados, mas também podem facilitar a identificação de produtos genéticos bacterianos que servem para melhorar a invasão de células cardíacas e/ou promover alterações na patologia cardíaca. Esses métodos também preveem a comparação direta do cardiotropismo entre múltiplas cepas de L. monocytogenes.
Introdução
Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular gram-positivo capaz de causar doenças graves em populações suscetíveis, incluindo idosos, gestantes, pessoas com HIV/AIDS e pessoas que recebem quimioterapia1. A infecção nessas populações é frequentemente resultado da ingestão de produtos alimentares contaminados, e a maioria das infecções estão associadas a surtos de alimentos em larga escala2,3. Em humanos e outros mamíferos, L. monocytogenes é capaz de translocar através da fronteira epitelial do intestino delgado, sendo posteriormente transportado para o fígado4,5. Modelos animais sugerem que as bactérias ingeridas se replicam dentro do villi intestinal e transitam para o fígado através da veia portal ou se espalham através dos linfonodos mesentéricos na corrente sanguínea, levando à disseminação hematógena no fígado e ao baço6,7. No fígado e no baço, a bactéria é capaz de mediar a absorção tanto em fagocitos profissionais quanto em células parenchímicas residentes, e rapidamente estabelece infecções dentro desses órgãos. À medida que a carga bacteriana aumenta, inúmeras bactérias são dispersas de volta ao sangue, onde são capazes de colonizar ainda mais tecidos suscetíveis, incluindo o sistema nervoso central e a placenta (onde estão presentes). A colonização desses locais impede manifestações mais comuns de listeriose em humanos, incluindo meningite, encefalite e aborto fetal2.
Subpopulações selecionadas de L. monocytogenes têm sido recentemente mostrados com uma capacidade aprimorada de invadir e replicar dentro do tecido cardíaco8. As manifestações de envolvimento cardíaco são variadas, e vão desde endocardite e pericárite, até miocardite fulminante completa com anormalidades de condução9-13. O número total de casos cardíacos de L. monocytogenes por ano é baixo, mas pode ser subestimado, pois essa faceta de infecção não é geralmente bem reconhecida. A colonização do coração por patógenos muitas vezes requer predisposições hospedeiras, como danos valvulares pré-existentes ou válvulas cardíacas artificiais. Há, no entanto, isolados de L. monocytogenes que foram identificados que são notáveis por sua capacidade de colonizar os corações dos animais infectados na ausência de qualquer dano cardíaco e/ou anormalidades8.
Aqui são descritos métodos in vitro e in vivo para avaliar a colonização bacteriana do tecido cardíaco dentro de animais infectados usando ensaios de invasão na cultura tecidual, bem como infecções animais vivos. Esses métodos têm se mostrado úteis não apenas para identificar cepas com potencial para colonizar tecido cardíaco em animais infectados, mas também devem ser úteis para a identificação de produtos genéticos bacterianos que servem para melhorar a invasão celular cardíaca e/ou resultar em alterações na patologia cardíaca. Esses métodos facilitam a comparação do cardiotropismo entre múltiplas cepas. Para os métodos aqui descritos, l. monocytogenes 10403S é usado como um representante bem estudado de uma cepa não cardiotrópica e o isolado clínico 07PF0776 é usado como um exemplo representativo de uma cepa cardiotrópica. Essas duas cepas foram escolhidas para fornecer uma comparação para a invasão bacteriana de células cardíacas in vitro e colonização de corações de camundongos infectados in vivo. O isolado 07PF0776 é um isolado clínico recuperado de um abscesso interventricular que causou uma arritmia fatal em um paciente HIV+8. L. os isolados de monocytogenes podem variar em seu potencial de virulência, e dada a propensão para listeria infectar pessoas com imunossupressão e gestantes, as pessoas dentro dessas populações devem ter cuidado ao avaliar diferentes isolados clínicos.
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Protocolo
1. Condições de armazenamento e cultura para cepas de l. monocytogenes
- Prepare a mídia sólida autoclavando o ágar de infusão cérebro-coração (BHI) e despejando a mídia derretida em placas de petri. Deixe as placas secarem durante a noite à temperatura ambiente, depois durante a noite novamente a 37 °C.
- Usando um laço estéril, obtenha uma pequena amostra de L. monocytogenes de estoques congeladores previamente feitos (bactérias suspensas em 20% de glicerol em mídia líquida BHI, armazenadas a -80 °C) ou de uma placa de ágar contendo colônias previamente atingidas para isolamento.
- Usando técnica asséptica, listrar a amostra para o isolamento de uma única colônia. Certifique-se de esterilizar o laço entre as raias cruzadas para evitar o excesso de transporte e garantir o isolamento de colônias individuais da cepa que está sendo avaliada. Incubar a placa durante a noite a 37 °C.
- Usando um laço estéril, remova uma colônia do isolado e inoculado 2 ml de caldo BHI (sem ágar) em um tubo de poliestireno de 14 ml.
- Para ensaios e infecções, incubar a cultura do caldo estaticamente (sem tremer) durante a noite em uma incubadora de 37 °C. Para estocagem de isolados cultivados, incubar a cultura do caldo a 37 °C com agitação a 180-200 rpm durante a noite. As culturas podem ser estocadas adicionando glicerol a uma concentração final de 20% e armazenando tubos selados a -80 °C indefinidamente.
2. Condições de armazenamento e cultivo de células semelhantes a myoblast cardíaco H9c2
- Compre ou obtenha um estoque congelado de células H9c2, bem como o Médio de Águia Modificada (DMEM) da Dubelco contendo alta glicose e piruvato, soro bovino fetal (FBS), L-glutamina (Glutão) e uma mistura penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG). FBS, Glut e PSG devem ser estocados a -20 °C, enquanto o DMEM pode ser armazenado a 4 °C. É útil alíquotar FBS em tubos cônicos de 50 ml antes de congelar.
- Em um capô de fluxo laminar, descongele duas alíquotas de FBS. Adicione uma alíquota a uma garrafa de 500 ml de DMEM, fazendo uma mistura de 10% de FBS/DMEM. Para isso, adicione 6 ml de Glut e estocar a solução resultante a 4 °C. Esta solução pode ser rotulada como "DMEM sem antibióticos". (DMEM –Ab)
- A uma segunda garrafa de 500 ml de DMEM, adicione as outras 50 ml de alíquota de FBS. Para esta solução, adicione 6 ml de PSG e estocar a 4 °C. Esta solução pode ser rotulada como "DMEM com antibióticos". (DMEM +Ab)
- Enquanto estiver no capô laminar, remova 10 ml de DMEM +Ab e coloque em um frasco de cultura de tecido de 25 ml.
- Deixando o frasco no capô laminar, remova uma alíquota congelada de células H9c2 do armazenamento em nitrogênio líquido e coloque rapidamente o tubo em um banho de água de 37 °C até que a cultura descongele.
- Pulverize o tubo com 70% de etanol para higienizar e volte para o capô. Trabalhando rapidamente para minimizar o tempo da célula em DMSO concentrado, adicione a alíquota completa das células aos 10 ml de DMEM +Ab. Isso dilui o DMSO suficientemente para viabilidade e adesão celular durante a noite.
- Coloque o frasco em uma incubadora de cultura tecidual a 37 °C, 5% C02e 95% de umidade durante a noite.
- Na manhã seguinte, verifique a camada celular para garantir a adesão. As células provavelmente estarão entre 80-100% confluentes por esta altura.
- Na capa da cultura tecidual, remova a mídia contida dentro do frasco usando o vácuo, deixando apenas as células dentro do frasco.
- Adicione aproximadamente 2 ml de 0,25% Trypsin-EDTA às células e arrase suavemente por aproximadamente 3 segundos.
- Inverta o frasco de tal forma que a solução de trippsina não esteja mais em contato com a monocamadas, e remova a trippsina por vácuo.
- Adicione uma segunda alíquota de 2 ml de trippsina às células, e mova o frasco para um microscópio invertido. Observe as células enquanto balança suavemente o frasco para garantir que a monocamada se disperse.
- Uma vez que a monocamada esteja dispersa, retorne imediatamente ao capô da cultura tecidual e adicione 4 ml de DMEM +Ab à suspensão celular.
- Remova uma porção de 2 ml da suspensão celular e adicione-a a um frasco de cultura de tecido de 50 ml contendo 23 ml de DMEM +Ab. Arrase o frasco suavemente e coloque-o na incubadora de cultura tecidual nas condições listadas na etapa 2.5.
- Verifique as células diariamente até atingirem aproximadamente 80% de confluência (aproximadamente 2,0-4,0 x 105 células por ml). É muito importante que as células não se tornem muito confluentes, pois podem se diferenciar em mótubos musculares esqueléticos quando passam fome de FBS por períodos prolongados detempo 14 e essa diferenciação pode alterar a invasão bacteriana. Monitore as células cuidadosamente e comece com um novo tubo de células se uma cultura se tornar confluente.
- Uma vez que as células atinjam 80% de confluência, elas podem ser passagemdas para outro frasco de 50 ml como apenas descrito, ou preparados para o ensaio de invasão.
3. Preparando células H9c2 para ensaio de invasão
- Na capa da cultura tecidual, remova a mídia de um frasco de 50 ml de células H9c2 que atingiram 80% de confluência usando aspiração a vácuo.
- Adicione 4 ml de solução Trypsin-EDTA de 0,25% à monocamada e remova imediatamente usando aspiração de vácuo.
- Adicione outra porção de 4 ml de 0,25% Trypsin-EDTA ao frasco e mova o frasco para um microscópio invertido para observar a dispersão da monocamada.
- Uma vez que as células tenham se dispersado, retorne ao capô e adicione 4 ml de DMEM –Ab às células. A pipetação da solução para cima e para baixo garante a remoção completa das células da parte inferior do frasco.
- Após a ressuspensão da monocamhadeira, remova toda a suspensão e coloque-a em um tubo cônico de 50 ml.
- Remova uma porção de 20 ul desta suspensão e conte o número de células por mililitro usando um hemótmetro.
- Uma vez determinada a concentração de células na solução, ajuste a concentração para 2,25 x 104 células/ml adicionando o volume apropriado de solução celular ao DMEM fresco –Ab. O volume total da solução ajustada deve ser de 25 ml.
- Enquanto estiver no capô, esterilize as tampas de vidro mergulhando-as em 90% de etanol e passando brevemente cada deslizamento através de uma chama. Adicione cada tampa a um poço individual de uma placa tratada de cultura de tecido de 24 poços logo após ser esterilizada.
- Depois de todos os poços ter uma mancha de cobertura individual, use um pipet de 25 ml para adicionar 1 ml da solução celular diluída a cada um dos poços da placa, e empurre cada tampa para baixo com uma agulha estéril.
- Verifique cada poço usando um microscópio invertido para garantir que quantidades semelhantes de células estejam em cada poço. Coloque a placa de 24 poços na incubadora de cultura tecidual durante a noite a 37 °C em 5% de CO2 e 95% de umidade.
- Na manhã seguinte, veja cada poço para garantir que as tampas tenham quantidades comparáveis de míbios aderentes e que as tampas não estejam flutuando no poço.
4. Preparando cepas de L. monocytogenes para ensaios de invasão
NOTA: Todo o trabalho laboratorial é realizado de acordo com as diretrizes do CDC Biosafety Nível 2.
- Depois de preparar a placa de 24 poços para ensaio, use um laço esterilizado para remover colônias únicas das cepas a serem examinadas para invasão bacteriana e inocular cada uma em tubos individuais de 14 ml contendo 2 ml de caldo BHI.
- Coloque os tubos inoculados em uma incubadora de 37 °C inclinada a 45° e incuba estaticamente (sem tremer) durante a noite.
- Na manhã seguinte, remova o tubo de cultura da incubadora e do vórtice brevemente para garantir a suspensão uniforme das bactérias.
- Meça a densidade óptica da cultura usando um espectrofotômetro a 600 nm de comprimento de onda. Certifique-se de zerar o espectótmetro usando caldo BHI estéril antes de ler a densidade óptica.
- Para L. monocytogenes,a densidade óptica está diretamente relacionada à concentração de bactérias por ml, de tal forma que uma densidade de 1.000 = 1,0 x 109 UFC por ml.
- Calcule a quantidade de cultura necessária para infectar 2,25 x 104 células com 2,25 x 106 (MOI = 100).
- Remova a quantidade de cultura necessária e coloque-a em um tubo de centrífuga de 1,5 ml.
- Gire a cultura a 19.000 x g por 3 minutos, depois descarte o supernaspeso. Toque na extremidade aberta do tubo contra uma toalha de papel, a fim de remover o excesso de mídia grudado no lábio do tubo.
- Resuspenque as bactérias em 1 ml de PBS e vórtice e vórtice para garantir a mistura suficiente. Esta mistura deve conter aproximadamente 2,25 x 106 UFC por 20 ul (1.125 x 108 UFC/ml).
5. Executando o Ensaio de Invasão
- Um dia antes do ensaio de invasão, prepare 24-bem de placas de células H9c2 como descrito na Seção 3, e também inocular caldo BHI estéril com a estirpe desejada de Listeria como descrito na Seção 4.
- Usando o protocolo na Seção 4, prepare culturas resuspended pbs das cepas a serem avaliadas para invasão. Nota: O título infeccioso pode ser avaliado neste momento, emplacando diluições de cada amostra em mídia sólida e enumerando colônias após a incubação durante a noite.
- Carregue pelo menos 20 ul da solução pbs-bactéria em poços individuais da placa de 24 poços. Observe que pelo menos três poços individuais são necessários para cada cepa, a fim de obter resultados em triplicado, de modo que até 8 cepas podem ser avaliadas em conjunto.
- Depois de carregar os poços com bactérias, balance suavemente a placa para incentivar a propagação homogênea de cada amostra dentro do poço, e coloque a placa de 24 poços de volta na incubadora para 45 minutos de incubação a 37 °C e 95% de umidade, com 5% de CO2.
- Durante esta incubação, prepare uma alíquota de DMEM – Ab (Seção 2) simplesmente removendo 25 ml de DMEM –Ab e colocando-o em um tubo falcão de 50 ml (ou equivalente).
- Adicione gentamicina ao DMEM de 25 ml –Ab aliquot a uma concentração de 15 ug/ml (7,5 ul de uma solução de estoque de 50 mg/ml). Coloque a solução DMEM –Ab +Gent em um banho d'água de 37 °C durante a incubação de 45 min.
- Aliquot 25 ml de PBS em um tubo falcão de 50 ml e coloque no banho d'água de 37 °C durante a incubação de 45 min.
- Após a conclusão da incubação de 45 minutos, retire a placa de 24 poços e coloque-a no capô. Remova a mídia que contém bactérias de cada poço por aspiração de vácuo, trocando pontas de tubulação de vidro entre diferentes cepas.
- Adicione aproximadamente 1 ml de PBS a cada poço, a fim de lavar bactérias frouxamente aderentes da superfície das células, em seguida, remova o PBS usando aspiração de vácuo.
- Após a remoção completa do PBS, adicione 1 ml de DMEM –Ab +Gent a cada poço. A gentamicina só matará as bactérias que permanecem fora das células, assim, aquelas que são intracelulares permanecerão viáveis.
- Coloque a placa de 24 poços de volta na incubadora e deixe incubar por mais uma hora.
- Durante a incubação de uma hora, prepare tubos de polipropileno de 14 ml adicionando 1 ml de ddH20 estéril a cada tubo. Um tubo será necessário para cada deslizamento de cobertura, por isso, para uma placa de 24 poços, prepare 24 tubos no total.
- Após a incubação de uma hora, retire a placa de 24 poços da incubadora e coloque-a no capô, juntamente com os tubos preparados na etapa 5.12.
- Usando pinças estéreis, remova cada mancha de cobertura de seu poço respectivo e coloque-a imediatamente em um tubo individual. Certifique-se de mergulhar as pinças no etanol e flame-las entre cada tampa, a fim de evitar contaminação.
- Depois que todas as tampas tiverem sido removidas e colocadas em tubos individuais, descarte a placa de 24 poços.
- Volte para o banco e vórtice cada tubo por 5-10 segundos.
- Remova uma porção de cada tubo e coloque cada amostra em um poço individual de uma placa de 96 poços, em seguida, dilua cada amostra em série usando diluições de 1:10 até uma diluição de 1:100.
- Usando placas LB pré-armadas e secas, coloque cada uma das séries de diluição nas placas de ágar. Um tubo multicanal pode ser usado para emplacar 5-10 μl pontos da série de diluição de cada amostra.
- Remova também 20 amostras de μl de cada poço não diluído e coloque esta quantidade diretamente no ágar LB em uma placa separada da série de diluição. (Este volume maior pode ser usado para enumerar cepas mal invasivas).
- Depois de todas as amostras terem sido banhadas à mancha, descarte os tubos de 14 ml contendo as tampas. Parafilme a placa de 96 poços e coloque-a em uma caixa de congelador a -80 °C para replacar, se necessário.
- Deixe as manchas secarem completamente. Este processo é muito acelerado colocando as placas no capô e removendo as tampas.
- Depois que as manchas secarem, coloque as placas em uma incubadora de 37 °C durante a noite.
- Na manhã seguinte, conte o número de colônias em cada ponto da série de diluição para a qual os números das colônias podem ser facilmente avaliados (entre aproximadamente 5 e 50 colônias) (Figura 1),e use a série para calcular o número de bactérias por deslizamento de cobertura para cada cepa avaliada.
6. Preparando cepas de L. monocytogenes para infecções de camundongos
- Na noite anterior à infecção, use um laço esterilizado para remover colônias únicas das cepas desejadas e inocular cada uma em tubos individuais de 14 ml contendo 2 ml de caldo BHI.
- Coloque os tubos inoculados em uma incubadora de 37 °C inclinada a 45° e incuba estaticamente (sem tremer) durante a noite.
- Na manhã seguinte, remova o tubo de cultura da incubadora e do vórtice brevemente para garantir uma suspensão uniforme da bactéria.
- Meça a densidade óptica da cultura usando um espectrofotômetro a 600 nm de comprimento de onda. Certifique-se de zerar o espectótmetro usando caldo BHI estéril antes de ler a densidade óptica. (Para L. monocytogenes,a densidade óptica está diretamente relacionada à concentração de bactérias por ml, de modo que uma densidade de 1.000 = 1,0 x 109 UFC por ml)
- Calcule a quantidade de cultura necessária para infectar cada animal. As injeções normalmente contêm 200 μl de PBS com 10.000 UFC de uma cepa individual, o que se traduz em uma concentração desejada de 5,00 x 104 UFC/ml.
- Remova uma alíquota de 5 μl de cada diluição final e espalhe-a diretamente no ágar LB. Incubar durante a noite a 37 °C para confirmar a concentração utilizada para a inoculação.
- Injete cada suspensão da UFC dentro de 1 hora de diluição (veja abaixo).
7. Vacinar L. monocytogenes em camundongos via Injeção de Veia de Cauda e Avaliação da Carga Bacteriana dentro do fígado, baço e coração
Nota: Todo o trabalho animal é realizado de acordo com as diretrizes de Biossegurança nível 2 do CDC. Os camundongos são normalmente ordenados com uma semana de antecedência e enjaulados juntamente com 5 animais por gaiola. Os camundongos podem se adaptar ao novo ambiente de laboratório por quatro dias antes da injeção. Esses experimentos usaram camundongos suíço-webster de 6 a 8 semanas que foram alojados 5 em uma gaiola em um ambiente de barreira e alimentaram uma dieta não restrita.
- Prepare uma gaiola de ratos de cada vez removendo a tampa e as caixas de alimentos/água, e colocando a gaiola sob uma lâmpada de calor por cinco minutos. Este processo permite que as veias da cauda se dilatam, facilitando a realização das injeções.
- Remova um animal e coloque-o em um arreio (ou tubo falcão com a extremidade cortada) a fim de conter o animal durante a injeção.
- Limpe o local da injeção usando uma almofada de álcool e deixe o álcool evaporar. Isso não só limpa o local, mas também dilata ainda mais a veia da cauda.
- Usando uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha calibre 27,5, injete suavemente o mouse com 200 μl da cultura desejada na veia traseira.
- Use uma gaze para parar qualquer sangramento que possa ocorrer como resultado da injeção, e coloque o animal em uma gaiola fresca.
- Repita este processo para os demais animais e cepas. Certifique-se de rotular cada gaiola de animais com a cepa que eles receberam.
- Verifique os animais diariamente, removendo e sacrificando todos os animais que pareçam estar doentes. Se nenhum animal apresentar sinais de doença, permita que as infecções prossigam por 72 horas antes de sacrificar todos os animais.
- Para sacrificar, use a anestesia de CO2 de uma fonte engarrafada até que todas as respirações tenham parado, em seguida, use deslocamento cervical para garantir que o animal está morto.
- Após o sacrifício, mova os animais para uma capa de cultura de tecidos para dissecção.
- Usando um bloco de dissecção, fixe cada perna do animal com agulhas de bitola grande e pulverize o animal com 70% de etanol até que esteja saturado.
- Corte a pele do abdômen e do tórax para trás usando uma incisão em forma de Y que se estende desde a abertura vaginal até o processo xifoide, progredindo então até a axila de cada braço.
- Puxe a pele e remova as agulhas de cada perna para manter a dissecção aberta.
- Corte suavemente através do peritônio, expondo os intestinos, estômago, fígado e baço.
- Cortando pela primeira vez a veia hepática e o ligamento coronal na parte superior do fígado, comece a remover o fígado. Ligamentos adicionais a serem removidos são encontrados sob o fígado, conectando-o à primeira seção do intestino delgado, bem como à musculatura das costas.
- Coloque o fígado em 5 ml de ddH20 estéril em um tubo falcão de 50 ml.
- Em seguida, remova o baço isolando-o e cortando suavemente a vasculatura e os ligamentos. O baço será removido mais facilmente do que o fígado. Coloque o baço em um tubo falcão separado contendo 5 ml estérei ddH20.
- Localize o diafragma e corte suavemente ao longo da caixa torácica para visualizar o tórax. Corte o processo xifoide e esterno ao nível do pescoço a fim de abrir o tórax, expondo o coração e os pulmões.
- Usando fórceps, pegue o coração suavemente pelo seu ápice, e levante-o de tal forma que a aorta e os vasos pulmonares estejam em tensão. Corte esses vasos para libertar o coração.
- Coloque o coração em um tubo falcão de 50 ml contendo 5 ml de ddH20 estéril.
- Descarte a carcaça do rato e repita este processo para cada animal, utilizando tubos de falcão limpo contendo 5 ml estéreis ddH20para cada órgão removido.
- Depois de removidos todos os órgãos, limpe a estação de trabalho e volte para o banco.
- Prepare um conjunto de 5 tubos a serem usados para limpar e esterilizar o homogeneizador para cada conjunto de órgãos de cinco camundongos (ou seja, um conjunto de tubos 5 para 5 fígados, 5 tubos para 5 baços e 5 tubos para 5 corações). Quatro de cada um dos tubos devem ser preenchidos com 30 ml de ddH20 estéril, e um deve ser preenchido com 30 ml 90% EtOH.
- Usando um TissueMaster (ou homogeneizador equivalente), mergulhe o homogeneizador (durante a execução) nos tubos preparados na etapa 7.21 da seguinte forma para limpar a sonda:
- Tubo 1 (ddH2O)
5 segundos no tubo 2 (ddH2O)
5 segundos no tubo 3 (EtOH)
5 segundos no tubo 4 (ddH2O)
5 segundos no tubo 5 (ddH2O) - Homogeneize um fígado usando o homogeneizador por pelo menos 2 minutos, ou até que não permaneçam porções visíveis do órgão. Use pinças para remover detritos grandes da sonda.
- Repita o processo de limpeza descrito na etapa 7.22
- Repita o processo de homogeneização dos outros fígados, certificando-se de lavar a sonda entre cada fígado usando o processo descrito na etapa 7.22.
- Depois que todos os fígados estiverem completamente homogeneizados, descarte os tubos de lavagem (1-5) para o fígado.
- Repita o processo de homogeneização/limpeza tanto para o baço quanto para os corações, certificando-se de usar um novo conjunto de tubos de lavagem para cada série de órgãos. Se em algum momento os tubos de lavagem ficarem turvas, descarte-os e substitua por novos tubos para terminar a série.
- Depois de todos os órgãos terem sido homogeneizados, faça um último ciclo de limpeza no homogeneizador e seque-o bem para armazenamento.
- Coloque aproximadamente 200 μl de cada órgão em um poço individual de uma placa de 96 poços.
- Realizar diluições seriais nas amostras do órgão diluindo 1:10 em uma série até uma diluição de 1:10.000 (fígado e baço) ou até uma diluição de 1:1.000 (coração).
- Coloque a placa da série de diluição no ágar LB pré-aquecido. Remova também 20 ul de cada órgão não diluído e placa em placas separadas de ágar LB, a fim de enumerar a UFC de órgãos mal colonizados.
- Descarte os tubos falcão contendo os órgãos homogeneizados e enrole as placas de 96 poços contendo a série de diluição com parafilme e coloque-a em uma caixa de congelador a -80 °C.
- Deixe as manchas secarem. Este processo é acelerado colocando as placas no capô e removendo as tampas.
- Depois que as manchas secarem, coloque as placas em uma incubadora de 37 °C durante a noite.
- Conte o número de colônias em cada ponto na manhã seguinte e use a série de diluição para calcular o número total de bactérias por órgão.
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Resultados
Isolados selecionados de L. monocytogenes exibem maior invasão de células cardíacas na cultura celular e em modelos de infecção de camundongos. A Figura 1 mostra um exemplo de como as colônias bacterianas podem aparecer após o revestimento de suspensões na mídia ágar. Este método permite uma avaliação precisa das CFUs dentro de uma amostra sem o uso de um grande número de placas de mídia ágar. A Figura 2 mostra um exemplo de um ensaio baseado em cultura tecidual comparando a cap...
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Discussão
L. monocytogenes é um patógeno humano generalizado e bem caracterizado, capaz de causar uma série de manifestações diferentes da doença15. A bactéria foi descrita anteriormente por sua capacidade de translocar através de barreiras, como a barreira hematoencefálica e as barreiras placentárias-fetais, a fim de alcançar e colonizar o sistema nervoso central e desenvolver feto, respectivamente. A capacidade in vivo do organismo de colonizar esses tecidos é muitas vezes complementada por uma capac...
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Divulgações
Os autores não relatam interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do Serviço Público de Saúde AI41816 e AI099339 (N.E.F.) e pela F31AI094886-01 (P.D.M.) da NIAID. Os conteúdos são de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais das fontes de financiamento.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Difco BHI Broth Base | 237200 | 2 kg de pó de infusão de coração cerebral (sem ágar) | |
| Difco | Agar | 214510 | 2 kg de ágar granulado |
| Difco | BHI Agar | 241810 | 2 kg de pó de infusão de coração cerebral com ágar 7,5% |
| in vitro | LB Broth Base | 12975-084 | 2 kg de base de caldo Luria em pó (sem ágar) |
| Fisher Glass Lamínulas | 12-545-80 | 12 mm lamínulas de vidro | |
| Falcon | Placa de cultura de tecidos de 24 poços | 35-3047 | 24 poços, placa de cultura de tecidos tratada com plasma |
| Falcon | 14mL Tubo de poliestireno | 352051 | 14 ml Tubos de poliestireno |
| Falcon | 96 poços Placa de fundo em U Falcon de 96 poços | 35-3077 | Placa de 96 poços não tratada com cultura de tecidos |
| Corning | 0,05% Tripsina, 0,53 mM EDTA (1X) | 25-052-CI | Solução estoque de tripsina EDTA para cultura de tecidos |
| Corning | DMEM (glicose alta, piruvato alto) | 15-013- | Mídia DMEM sem FBS, glutamina ou antibióticos |
| Solução Corning | Pen/Strep/Glut | 30-009-CI | Mistura de estoque de penicilina, estreptomicina e L-glutamina para cultura de tecidos |
| Corning | Gentamicin | 30-005-CR | 50 mg/ml Estoque, solução de gentamicina para cultura de tecidos |
| , Cellgro (Corning) | L-glutamina | 25005197 | estoque, L-glutamina solução sem antibióticos |
| Denville | 75cm^2 Balão | T1225 | 75 cm2 frasco tratado para cultura de tecidos |
| Denville | 1,5mL tubos de microcentrífuga | 2013004 | tubos de microcentrífuga de 1,5 ml |
| ATCC | H9c2 Cardíaco Mioblastos | CRL-1446 | Mioblastos cardíacos de rato |
| Hyclone | Fetal Bovino Soro Bovino Fetal | SH30070.63 | Soro Fetal Bovino |
Referências
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