Avaliação experimental de rato Sociabilidade utilizando uma abordagem de processamento de imagem automatizado

Resumo

Este protocolo descreve um método para quantificar a sociabilidade rato. Os ratos são filmadas enquanto se movem e interagem em uma gaiola especial. Processamento de filme permite a quantificação automática de sociabilidade com excelente precisão e confiabilidade.

Resumo

Mouse é o organismo modelo preferido para testar drogas destinadas a aumentar a sociabilidade. Apresenta-se um método para quantificar a sociabilidade rato em que o rato de ensaio é colocado num aparelho normalizado e comportamentos relevantes são avaliadas em três sessões diferentes (chamado sessão I, II, e III).

O aparelho tem três compartimentos (ver Figura 1), os compartimentos da esquerda e da direita contém uma taça invertida, que pode alojar um rato (chamado "rato estímulo").

Na sessão I, o rato de ensaio é colocado na gaiola e a sua mobilidade é caracterizada pelo número de transições entre os compartimentos feitos. Na sessão II, um rato estímulo é colocado sob um dos copos invertidos ea sociabilidade do rato teste é quantificada pelos valores de tempo que passa perto do copo contendo o mouse estímulo fechado contra o copo invertido vazio. Na sessão III, os copos invertidos são removidos de um d ambos os ratos interagir livremente. A sociabilidade do rato teste em sessão III é quantificada pelo número de abordagens sociais que faz em direção ao rato estímulo e pelo número de vezes que ele evita uma abordagem social por parte do rato estímulo.

A avaliação automatizada do filme detecta o nariz do rato de ensaio, o que permite a determinação de todas as medidas de sociabilidade descrito na sessão I e II (na sessão III, abordagens são identificados automaticamente mas classificadas manualmente). Para encontrar o nariz, a imagem de uma gaiola vazia é digitalmente subtraído de cada moldura do filme e a imagem resultante é binarizada para identificar os pixels do rato. A cauda do rato é automaticamente removido e os dois pontos mais distantes do rato restantes são determinados; estes são perto de nariz e base da cauda. Ao analisar o movimento do rato e utilizando os argumentos de continuidade, o nariz é identificado.

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Figura 1. Avaliação da Sociabilidade Durante 3 sessões Sessão I (em cima):.. Aclimatação de rato teste para a gaiola Sessão II (meio):. Teste rato mover-se livremente na gaiola enquanto que o rato estímulo é fechado em um copo invertido Sessão III (parte inferior): Ambos rato teste e rato estímulo estão autorizados a circular livremente e interagir uns com os outros.

Introdução

Sociabilidade prejudicada é um dos domínios principal sintoma em uma variedade de desordens do desenvolvimento neurológico, incluindo transtornos do espectro autista (ASDs) ^1,2. Isso limita severamente a capacidade dos pacientes para desenvolver relacionamentos e afeta muito pacientes, famílias e cuidadores ^2,3.

Num esforço para melhor compreender o mecanismo subjacente a sociabilidade auditivos e desenvolver tratamentos, diversos modelos de ratos têm sido estudados ^1,4-9. Um tal estirpe é o ratinho BALB / c, uma estirpe consanguínea que exibe surpreendentemente baixo sociabilidade, assemelhando-se características observadas em pacientes com ASD5 ^8-12. Por exemplo, o ratinho BALB / c exibe uma menor frequência de abordagens sociais e uma resposta geralmente negativo para abordagens sociais por um rato de estímulo (por exemplo, evitação social) do que a Swiss Webster estirpe comparador ^10.

Para testar se um tratamento proposto é effective no aumento da sociabilidade, são necessárias medidas objetivas. Um quadro é amplamente aceite para analisar a sociabilidade num aparelho normalizado que tem três compartimentos (ver Figura 1).

Os compartimentos esquerda e direita cada conter um copo fio invertido que abriga um rato estímulo socialmente saliente. O rato de teste é lançado para dentro do aparelho durante três intervalos de 10 min (sessões I-III); sessão que avalia a atividade locomotora do rato teste, enquanto as sessões II e III avaliar diferentes aspectos da sociabilidade do rato teste.

Na sessão I, o rato de teste é permitido para se aclimatar ao aparelho. Nesta sessão, o número de transições que o rato de ensaio faz entre os diferentes compartimentos é medido. É importante ressaltar que as medidas de sociabilidade obtido no aparelho de três compartimentos padrão são dependentes de atividade locomotora e atividade locomotora reduzida pode confundir a interpretação de Socidados habilidade.

Na sessão II, o rato teste é movendo-se livremente e um mouse estímulo é colocado sob um dos copos invertidos (contrapeso). Os ratos de estímulo são ratos ICR 4 semanas de idade do sexo masculino não consanguíneos, idade e para os ratinhos de teste pareados por sexo. O estímulo rato é colocado num copo invertido no lado designado como o compartimento social e um copo invertido vazio é colocado no lado designado como o compartimento não social. Na sessão II, a sociabilidade do mouse teste é quantificada por comparação do tempo que passa perto do copo "social" invertido (menos de 2 cm de distância) vs. o tempo que passa perto do copo invertido "não-social", e pelo tempo que gasta no compartimento sociais versus o tempo que gasta no compartimento nonsocial. ratos de comparação Swiss Webster passar muito mais tempo no compartimento social e perto do copo invertido social em comparação aos camundongos BALB / c que mostram nenhuma preferência significativa para o desenvolvimento socialcopo invertido ou do compartimento sociais ^12.

Na sessão III, os ratos de teste e de estímulo estão autorizados a interagir livremente (copos invertidos são removidos). Medidas de sociabilidade, comportamentos estereotipados e transições entre os compartimentos são seguramente obtida na terceira sessão de 10 min de interação livre entre o teste e os ratos de estímulo e analisados. Neste relatório, a sociabilidade do mouse teste é quantificada através de duas medidas: 1) o número de abordagens sociais que faz em direção ao rato estímulo, em que uma abordagem social é definida como avançar (nariz primeiro) para o rato de estímulo para que o nariz é menos de 2 cm de distância do rato estímulo; 2) o número de evitações de abordagens sociais pelo mouse estímulo. O rato teste é considerado estar evitando a abordagem se transforma ou se afasta do rato estímulo, ou se interrompe temporariamente em movimento ( "congelamento comportamento") após o mouse estímulo abordou o mouse teste. BALB /c ratinhos mostram uma diminuição no número de abordagens sociais feitas para o estímulo do rato e um aumento do número de respostas negativas para abordagens sociais por o estímulo rato, em comparação com a estirpe Swiss Webster do comparador ^10.

A avaliação dos filmes de comportamento tem sido tradicionalmente feita manualmente, ou seja, ao assistir o filme com cuidado (possivelmente em velocidade reduzida) e ativando cronómetros para o tempo o mouse passa em um determinado compartimento ou perto de um dos copos invertidos ^10. Este método requer a observação do filme repetidamente e é, portanto, muito demorada. Além disso, a precisão é limitada pelo tempo de reação do avaliador para as medições cronômetro e capacidade de perceber se o mouse está dentro de 2 cm do copo invertido. Em trabalho recente, dois compostos, (D-serina e D-cicloserina) têm se mostrado eficazes no restabelecimento da sociabilidade em camundongos BALB / c ^9,10,12. Sabe-se que ambos os componentes modufinal do receptor de NMDA, que é conhecida por desempenhar um papel fundamental no comportamento social ^2,12. Uma grande variedade de compostos é conhecida por modular a actividade do receptor NMDA numa variedade de formas bem definidas, e o potencial para um grande avanço no tratamento de ASD faz a avaliação acelerada destes compostos uma prioridade e um método automático rápido para avaliação altamente desejável.

Descrito abaixo é um procedimento de análise automática desenvolvido para a avaliação da sociabilidade mouse. Ele usa métodos de processamento de imagem em todos os quadros dos filmes do rato para identificar a posição do mouse ou camundongos. Em sessões I e II, ele detecta ainda mais a posição do nariz e usa-lo para calcular medidas de sociabilidade. Na sessão III, ele detecta automaticamente todas as abordagens, mas é necessária a classificação manual (abordagem social, a evitação social, ou outro).

Protocolo

O protocolo para a facilidade de explicação foi dividida em 2 partes: 1) Procedimento experimental e 2) análise automatizado. Todos os animais foram tratados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório ^15, e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal.

1. Procedimento Experimental

1. Defina-se a gaiola, que é um preto não reflectores de Plexiglas quadro rectangular (52 x 25 x 23 cm ^3), dividido em três compartimentos: social, não sociais, e um compartimento central neutro (Figura 1). Coloque copos fios invertidos em cada um dos compartimentos finais durante as sessões I e II (discutido abaixo) e abrigar o mouse estímulo durante a sessão II.
2. Defina-se a câmara, de tal forma que a gaiola preenche o campo de visão. Uma vez que a iluminação pode interferir com o comportamento do rato, manter uma luminância de não mais do que 3,5 lux dentro da gaiola, vindo de luz indirecta a partir deuma lâmpada incandescente e medidos no chão da gaiola no sentido ascendente. Além disso, use uma fonte de luz infravermelha, que os ratos não podem sentir, mas a câmera pode detectar. Grave todos os filmes em 720 x 480 definição padrão.
3. Grave um único quadro de uma gaiola vazia para processamento de imagens mais tarde (o chamado "quadro de referência") e salvar como uma imagem em tons de cinza.
4. Sessão I: Introduzir rato teste na gaiola e acenar a mão sobre a gaiola, indicando o início de sessão (compare análise automatizada). filme recorde de 10 min. No final de 10 min, coloque o mouse de volta para sua gaiola originais.
5. Sessão II: Coloque o mouse estímulo debaixo de um dos copos invertidos (contrapeso).
6. Use o botão "social esquerda" ou "direita social" para selecionar se o mouse estímulo é na taça invertida à esquerda ou no copo invertido à direita.
   NOTA: O copo invertido com o mouse estímulo é chamado de "cup sociais", enquanto o outrocup o "cálice nonsocial". O compartimento em que a taça social está localizada é chamado o compartimento sociais, o compartimento com o copo de nonsocial é o compartimento não social, e o compartimento do meio é o "compartimento neutro".
7. Introduzir o rato de ensaio para dentro da gaiola. Onda mão sobre a gaiola para indicar o início da sessão. filme recorde de 10 min. Importante, manter os ratos no aparelho de sociabilidade antes de retirar os copos invertidos para começar a Sessão III.
8. Sessão III: Retire os copos invertidos, solte ambos os ratos e permitir que os ratos de teste e de estímulo para interagir livremente uns com os outros. Onda mão sobre a gaiola para indicar o início da sessão. filme recorde de 10 min. No fim de 10 minutos, colocar ambos os ratinhos de volta às suas gaiolas respectivas.

2. Análise Automated

NOTA: Os comandos na seção 2 são emitidos através de uma interface gráfica do usuário (veja a Figura 2), que conTrols nosso software. Aqui nós explicar a transformação passo-a-passo que o nosso software permite; O software também é capaz de efectuar a análise no modo de lote, sem intervenção do utilizador.

1. Para cada filme, execute os seguintes passos de processamento:
   1. Carregar filme (clique no botão Load).
   2. Selecione configuração gaiola, que diz ao programa de análise a localização dos limites de gaiola, os limites dos compartimentos e locais de copa. Selecione uma das quatro configurações salvas ou ajustar manualmente todas as coordenadas.
      NOTA: A configuração normalmente não mudam de uma experiência para a outra e, por conseguinte, pode ser reutilizado.
   3. Para cada quadro do filme, execute os seguintes passos de processamento (2.1.3.1-2.1.3.6).
      1. Converter o quadro em tons de cinza, clicando no botão "escala de cinza".
      2. subtrair digitalmente o quadro de referência em tons de cinza (veja o passo 1.3), clicando no botão "Subtrair". NOTA: O objetivo desta etapa é fazer com que os va pixelslues do quadro muito próximo de zero em todos os lugares, exceto para a posição do mouse.
      3. Binarize a moldura, definindo todos os pixels abaixo de um determinado nível de limiar de preto, todos os pixels acima desse nível para branco (clique no botão "Binarize").
         Nota: A idéia é que uma vez que os pixels do mouse geralmente têm valores mais elevados do que os pixels restantes, os pixels do rato vai se tornar branco e todos os outros pixels preto. O nível de limiar óptimo depende das condições de iluminação e pode ser determinada por avaliação da forma do rato ao longo de um filme. Se o limiar escolhido é muito baixa, o rato parece ser demasiado grande, e os pixels que não pertencem ao rato pode ser de cor branca. Se o limiar for demasiado elevada, o rato torna-se pequena e pode desintegrar-se em pedaços desconectados. Nos filmes gravados, o limiar óptima foi sempre entre 20 e 35 (numa escala de 0 a 255).
      4. Erode ¹³ a imagem e vezes binarizadas, então dilatar ¹³ 2e vezes, então erode vezes novamente e, pressionando o botão "EROD / Dil".
         Nota: A finalidade deste procedimento é a remover a cauda. Para a resolução (720 x 480), que foi usado, E = 3 trabalhado em todas as circunstâncias.
         Nota: O software verifica automaticamente a presença de uma mão na imagem (durante a gravação de filmes, as mãos são agitou através da imagem para indicar o início de uma sessão). Se a mão está presente, haverá muitos invulgarmente pixels brancos, na armação binarizada porque a mão é muito maior do que um rato. A condição para a presença de uma mão é que existem mais do que 10.000 pixels brancos, na armação binarizados. O software determina o início das sessões de I, II, e III, através da detecção do intervalo de quadros em que ocorrem movimentos da mão.
2. Em sessões I e II, continuar da seguinte maneira:
   1. Detectar o maior componente ligado do conjunto de pixels brancos (Clique em "LComp"). Nota: O propósito oF Este passo é eliminar pixels brancos, que não pertencem ao rato, por exemplo, causado pelo movimento do rato na sessão estimulo II. O maior componente ligado é em quase todos os quadros do mouse.
   2. Determinar os dois pixels brancos mais distantes (chamados os "fins" do mouse), clicando em "Pesquisar Ends".
      Nota: O software estabelece a continuidade das duas extremidades, isto é, para cada uma das extremidades do primeiro quadro para o qual uma das extremidades nos quadros subsequentes a que pertencem. A ideia geral é a de que uma vez que os quadros são gravados a alta velocidade, as extremidades não pode viajar para longe de um quadro para o seguinte, de modo que, para a manutenção correcta das extremidades de um quadro para o seguinte é o que minimiza a soma das distâncias que mover as extremidades. Veja a discussão para mais detalhes.
   3. Determinar quais final do rato é o nariz.
      1. Determinar a direção em que um rato se move por observar como o centro de gravidade (COG)mudanças de um quadro para outro (o movimento do centro de gravidade é o movimento da soma de todos os pixels do rato).
         Nota: a roda dentada de um conjunto de pixels P _1, ..., p _n com coordenadas x _1, .., x _n é definido por:
         
         Ratos normalmente avançar (ou seja, no sentido de seu nariz). Em uma secção de várias centenas de quadros, há sempre muito elevada confiança na detecção de cabeça / cauda.
         Nota: O software determina automaticamente para o qual o detectado termina o mouse está se movendo; este efeito é identificado como o nariz e marcada com um circulo vermelho no filme. Quando o nariz detectado é marcada com um círculo vermelho em cada quadro, o utilizador pode verificar a qualidade da detecção.
3. Na sessão III, continuar da seguinte maneira:
   1. Detectar dois maiores componentes de pixels brancos.
      1. Se ambos são de tamanho aceitável para AMouse e seus centros de gravidade (CPV) são compatíveis com as engrenagens do rato do quadro anterior, considere estes dois componentes os dois ratos.
      2. Considere rato tamanhos aceitáveis ​​se não mudou em mais de 20% desde o quadro anterior, e considerar COGs de dois quadros consecutivos como compatível, se a sua diferença não é maior do que a distância que um rato pode viajar no tempo entre quadros (esta distância segue desde a velocidade máxima do rato, que pode ser determinado como parte das preparações de uma série de experiências através da análise do movimento de vários ratinhos individuais (como em sessões I e II).
         Nota: Se os dois maiores componentes são tamanhos não aceitáveis ​​para um rato, ou os CG são muito diferentes das do quadro anterior, o software aumenta automaticamente o limite de binarização até que os dois maiores componentes são de tamanho aceitável e seus COGs são compatíveis com os do quadro anterior.
   2. Clique com o mouse em testeo primeiro quadro. Use a análise em 2.3.1 para identificar tanto teste e rato estímulo em cada quadro da sessão III.
   3. Identificar os quadros em sessão III, no qual a um rato socialmente se aproxima da outra. Nota: O software implementa este passo, verificando automaticamente que a distância entre os ratos é menor do que a distância interacção típica de ratinhos (usamos 2 cm).
   4. Quando o software desempenha um pequeno segmento do filme com a abordagem detectado para o usuário, clique em um botão para indicar se esta abordagem pode ser considerada uma abordagem social por parte do rato teste, evitação social pelo mouse teste, ou nenhum.
      Nota: Passo 2.3.4 pode ser automatizado se é sabido que o mouse é o mouse de teste. Uma vez que esta informação se perde quando os ratos ficam muito próximos uns dos outros (ou subir em cima do outro), e uma vez que ainda não encontrou uma maneira de rotular os ratos de uma forma que pode ser detectado de forma confiável pelo nosso software e faz não afectar o seu comportamento, temos revertido paraclassificação manual para agora.
4. Avaliar filmes processados, filme de carga utilizando o botão Load.
   1. Clique em Iniciar Sessão 1 para exibir o primeiro quadro da sessão 1 (ou Iniciar Sessão 2 para exibir o primeiro quadro da sessão 2).
   2. Clique em Play / Stop para jogar e parar de filmes.
      Nota: Os filmes processados ​​irá exibir rato com cabeça e cauda marcados com círculos de cores diferentes. Todas as medidas de sociabilidade são exibidos na tela e atualizado à medida que o filme é reproduzido.
   3. sociabilidade exportação de dados em formato Excel, clicando em "Export".
   4. Clique em "Dados Compile" para compilar todos os dados de todos os filmes em uma pasta em um único arquivo excel.

Resultados

A Figura 3 mostra um quadro de cor de um filme de comportamento com uma gaiola vazia. O ratinho não foi introduzido na gaiola ainda. A posição dos copos, e não sociais (sociais) e os limites de compartimento estão sobrepostos. O quadro de cor de gaiola vazia é convertido em escala de cinzentos de 8 bits, como mostrado na Figura 4 e usado como um quadro de referência. O quadro de referência é subtraída de todos os outros quadros do filme capturado.

A ...

Discussão

Ao combinar ratos filmagem e análise de filme automática, criamos uma técnica de triagem acessível, confiável de alto rendimento.

A precisão da análise automatizada foi comparada com os resultados da análise manual para mais de 100 filmes. Na maioria esmagadora dos quadros (> 99%) dos quadros, o nariz do rato é identificado com boa precisão. A maior parte dos (poucos) misdetections não têm nenhum efeito sobre as medidas de sociabilidade, de modo que cerca de 80% dos filmes não necessitam ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gaiola de acrílico	Norva Plastics, Norfolk, VA	feito sob medida	As dimensões e o layout descritos no manuscrito, podem ser ajustados de acordo com as necessidades. Use plexiglas não reflexivo para facilitar o processamento de imagem
Copos de arame	Cozinha mais	315	Use um para abrigar o mouse de estímulo, uma câmera de
vídeo	SONY	HDR-PJ790	Pode ser substituída por qualquer câmera com Especificações comparáveis
OpenCV (Biblioteca de processamento de imagens)	Willow Garage	N/A	Qualquer biblioteca moderna de processamento de imagens pode ser usada.