Determinando Membrane Topology Protein Usando Fluorescência Protease Protection (FPP)

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a orientação e topologia de proteínas integrais de membrana em células vivas. Este protocolo simples baseia-se na sensibilidade seletiva da protease das quimeras entre a proteína de interesse e a GFP.

Resumo

A topologia e orientação corretas das proteínas integrais de membrana são essenciais para seu funcionamento adequado, mas essa informação não foi estabelecida para muitas proteínas de membrana. Uma técnica simples chamada proteção de protease de fluorescência (FPP) é apresentada, que permite a determinação da topologia da proteína de membrana em células vivas. Essa técnica tem inúmeras vantagens sobre outros métodos para determinar a topologia da proteína, pois não requer a disponibilidade de vários anticorpos contra vários domínios da proteína da membrana, não requer grandes quantidades de proteína e pode ser realizada em células vivas. O método FPP emprega as ações espacialmente confinadas das proteases na degradação de proteínas de membrana marcadas com proteína fluorescente verde (GFP) para determinar sua topologia e orientação de membrana. Essa abordagem simples é aplicável a uma ampla variedade de tipos de células e pode ser usada para determinar a orientação da proteína da membrana em várias organelas subcelulares, como mitocôndrias, Golgi, retículo endoplasmático e componentes do sistema endossômico / de reciclagem. As proteínas de membrana, marcadas nos terminais N ou C com uma fusão GFP, são expressas em uma célula de interesse, que está sujeita à permeabilização seletiva usando o detergente digitonina. A digitonina tem a capacidade de permeabilizar a membrana plasmática, deixando intactas as organelas intracelulares. As porções GFP expostas ao citosol podem ser degradadas seletivamente através da aplicação de protease, enquanto as frações GFP presentes no lúmen das organelas são protegidas da protease e permanecem intactas. O ensaio FPP é simples e os resultados podem ser obtidos rapidamente.

Introdução

As membranas de plasma, bem como as numerosas membranas intracelulares, servem como barreiras que separam dois compartimentos aquosos. No caso da membrana do plasma, a separação é entre o exterior e o interior da célula; para organelos intracelulares é entre o citoplasma e o lúmen de organelos. Por exemplo, a membrana do retículo endoplasmático (ER) separa um ambiente oxidante no interior do lúmen do ER de um ambiente redutor citosólica ^1. As proteínas da membrana são sintetizadas nos ribossomos associados-ER, e alcançar sua topologia final dentro da membrana ER ^2. A aquisição de orientação e topologia de membrana apropriado para proteínas é crítico para a sua função normal. Topologia correcta permite domínios relevantes de proteínas de membrana para interagir com os seus parceiros de ligação, que permite que as modificações pós-traducionais críticos para ocorrer, e, no caso de proteínas de membrana de plasma, permite que a célula interagir com e responder to seu meio ambiente. Para apreciar a função de uma proteína de membrana, é manifesta a necessidade de saber que a proteína é orientada em relação à membrana no interior da qual reside, ou seja, a sua topologia de membrana. Além disso a aquisição de conhecimentos científicos básicos, compreendendo a topologia de uma proteína de membrana e que aspectos da superfície de uma proteína são expostos a ambientes diferentes marcou implicações clínicas, uma vez as proteínas da membrana são a maioria dos alvos farmacológicos ^3. Até recentemente, abordagens para determinar topologia proteína de membrana têm exigido um investimento considerável de tempo e dinheiro ou ter exigido reagentes que são difíceis de encontrar.

Ambas abordagens experimentais e in silico foram empregues para determinar a topologia de membrana de proteínas residentes no interior da membrana plasmática. Desde as primeiras previsões de membrana que mede domínios com base na hidrofobicidade avaliada de indiviaminoácidos dupla ^3, inúmeros algoritmos de previsão estão agora disponíveis na internet, e simplesmente exigem o conhecimento da seqüência de aminoácidos da proteína. No entanto, as hipóteses são muitas vezes central para tais programas de modelagem, premissas que podem levar a atribuições incorretas de topologia de ^4,5. Além disso, embora estas previsões baseadas em computador pode atribuir provisoriamente membrana regiões que abrangem, eles não sempre determinar se o amino ou carboxi de proteínas estão no citoplasma, lumen organela ou exterior da célula. Mesmo com o aumento do poder computacional, e o uso de algoritmos de aprendizado de máquina ^6, esses dados ainda é um modelo, e deve ser validada experimentalmente usando dados adquiridos. Determinação experimental direta de topologia membrana foi realizada por meio de painéis de anticorpos monoclonais com epitopos conhecidos distribuídos em toda a proteína, em que a avaliação da imunorreatividade foi feita antes e após a permeabilização celular. Esteabordagem requer um conjunto de anticorpos, que podem não estar disponíveis para a proteína de interesse.

Uma estratégia alternativa é projectar tais como marcadores de epitopo myc ou de hemaglutinina (HA) em vários locais da proteína, novamente seguido de determinação da imunorreactividade antes e após a permeabilização da membrana. Além de marcas imunogênicas, etiquetas enzimáticas (incluindo fosfatase alcalina, β-galactosidase, β-lactamase ou) e de modificações químicas, como a digitalização de cisteína têm sido empregados para determinar a topologia de proteína de membrana ^7,8. Um método adicional utilizado para mapeamento topológico de proteínas da membrana plasmática depende de uma abordagem um pouco diferente para marcadores de epitopo. Neste método, a sequência de marcador é a sequência de consenso de glicosilação ligada a N NXS / T. Uma vez que a glicosilação ocorre apenas quando uma tal sequência está presente no lúmen da via biossintética, a presença do marcador numa relação luminalum compartimento citosólico é facilmente observado como um deslocamento de massa em géis de SDS-PAGE. Tal abordagem foi aplicada ao canal iónico multispanning CFTR ^9. Enquanto todas essas abordagens têm sido utilizados, é claro que todos eles exigem investimentos consideráveis ​​em biologia molecular para gerar e seqüenciar as construções múltiplas.

Para determinar informações topológicas sobre proteínas transmembrana localizados dentro organelas intracelulares provou ser mais desafiador. A aplicação de tecnologias baseadas fluorescência no entanto, fez com que a determinação da topologia da membrana muito mais simples. A técnica de fluorescência bimolecular complementação (BiFC) baseia-se na interacção entre dois fragmentos não fluorescentes de uma proteína fluorescente, restaurando as propriedades fluorescentes de que a proteína de ^10. Embora inicialmente descritos para determinar as interacções proteína-proteína in vivo ^10, esta abordagem também foi utilizadapara determinar a topologia de proteína de membrana em células de plantas ^11. No entanto, esta abordagem também é demorada, uma vez que requer a geração não só de proteínas de fusão com a proteína de interesse, mas também uma variedade de proteínas de fusão, dirigidos às citosol ou organelos lúmen, e requer o conhecimento de que membranas intracelular da proteína de interesse reside .

Uma abordagem mais simples para determinar a topologia alternativa de proteína de membrana ¹² tem sido descrita. O ensaio de Fluorescência Protease Protecção (FPP) requer a geração de uma proteína de fusão entre o GFP e o gene de interesse. A abordagem é baseada na acessibilidade relativa de proteases não específicas para a porção da GFP; dependendo se GFP é protegido contra a proteólise por residente no lúmen das organelas intracelulares ou está exposta a proteólise por estar presente no citosol. Assim, se a porção da GFP na proteína de interesse está virado para o citoplasma, que será exposto aa actividade da protease e o sinal de fluorescência perdido. Por outro lado, se a porção da GFP na proteína de interesse enfrenta um ambiente "protegidos" de protease (tais como o lúmen de Golgi), então o sinal de fluorescência irão persistir.

Para permitir que as proteases para entrar na célula, mas não entrar compartimentos membranares intracelulares a ligação colesterol digitonina droga é usada. O colesterol é o esterol dominante em vertebrados, e é especificamente enriquecido em membrana plasmática em relação aos compartimentos intracelulares. A toxina glicósido, digitonina, é extraído a partir da planta Digitalis purpurea. Digitonina tem uma afinidade para as membranas ricas de colesterol, onde se leva a membrana selectiva permeabiliztion ^14,16 (Figura 1). Além de permitir a saída de pequenos componentes citosólicos, permeabilização digitonina também permite a entrada de moléculas exógenas, tais como a proteinase K ou tripsina. O protocolo FPP aproveita o fact que a membrana plasmática contém até 80% de colesterol celular ^17, ao passo que outros organelos, tais como o ER, Golgi, endossomas, mitocôndrias, que têm muito baixo teor de colesterol, ¹⁴ permanecem intactos. A incorporação selectiva do colesterol pela membrana de plasma tem sido observada em muitas células eucariotas, permitindo a utilização de permeabilização da membrana do plasma dependentes de digitonina em diversas espécies eucarióticas tais como S. cerevisiae para humano ^14,18. O ensaio de FPP proporciona um meio simples, rápido e relativamente robustos de determinar (a) se uma proteína ligada à membrana é / ou associados livremente difusivel no citosol e (b) que domínio de uma proteína de membrana enfrenta o citosol ou organelos lúmen. No caso de uma proteína da membrana tem múltiplas orientações, o sinal vai surgir a partir da forma dominante e formas menores não serão detectados. Embora possa haver alguma preocupação de que a adição de uma porção de GFP para a proteína de interesse pode afectar a sua função e/ Ou localização subcelular, este é, na verdade, mais teórica do que real. Com efeito, muitos estudos mostraram claramente que o tag de GFP não alterar as propriedades da proteína ^19,20.

Protocolo

1. Geração e Validação de Quimeras proteína fluorescente

1. Acrescente proteína fluorescente verde (GFP) para o grupo amino ou carboxilo da proteína de interesse, utilizando as estratégias de ADN recombinante, convencionais ^13.
   NOTA: Embora tenhamos GFP usado extensivamente, outras variantes, tais como a proteína fluorescente ciano (PCP), proteína fluorescente amarela (YFP), DsRed mCherry e podem ser empregues. Melhorias na fluorophore dobrar eficiência, brilho e fotoestabilidade estão sendo feitas constantemente, e os investigadores devem valer-se das últimas construções geração.
   1. Confirmar sequência de ADN correcta e assegurar que a porção da GFP é em grelha com a proteína de interesse. Execute sequenciamento utilizando estratégias convencionais de DNA recombinante ^21.
      NOTA: Muitas instituições têm instalações de DNA do núcleo, que o investigador é encorajado a contactar para obter informações adicionais.
   2. Para proteínas de membrana passe simples ou duplas, gerarambas as versões de terminal amino e carboxilo das proteínas de fusão ^19.
   3. Para as proteínas de multi-GFP abrangendo inserir dentro de laços extramembrane putativos, assim como os terminais. Tomar cuidado especial quando gerar quimeras transmembranares com a proteína de fusão fluorescente ligado ao terminal amino da proteína alvo como sequências de sinal são muitas vezes clivado por proteólise, uma vez que a proteína tenha passado através do translocon ER.
   4. No caso de sequências de sinal existentes, inserir a proteína de fusão fluorescente distai ao local de clivagem de modo a gerar uma proteína madura contendo uma proteína fluorescente marcado intacta amino-terminal. Empregam estratégias de ADN recombinante padrão para a geração de quimeras ^21.
2. Determinar a presença do sinal fluorescente apropriadamente localizada suficiente na linha celular de interesse.
   1. Observe as células sob microscopia de epifluorescência utilizando a fluorescência intrínseca da GFP sob aprocomi filtro definir condições. Para conjuntos de filtros de GFP que englobam 510-560 nm, confirmar que os filtros de correcção são utilizados para o fluoróforo utilizado.
      NOTA: Um sinal suficiente é alcançada quando a avaliação a olho fornece um sinal forte o suficiente para que a estrutura celular dentro do qual o sinal reside é facilmente resolvido acima do fundo. Além disso, o padrão de coloração da proteína GFP deve ser consistente com a de marcadores para o organelo adequado, e de preferência idêntica à da proteína nativa não marcada.
3. Determinar se uma abordagem transfecção estável ou transitória será utilizado com base na proteína que está sendo avaliada.
   NOTA: Os transfectantes estáveis ​​geralmente pagar menores níveis de expressão do que os sistemas transientes. Embora a expressão transitória produz expressão de nível elevado de proteínas e aumento da intensidade de sinal (~ 5-24 horas após a transfecção, dependendo da proteína), mas também pode levar a artefactos, tais como sobre-expressão da proteína aggregation ou saturação da proteína alvo vias, levando a localização subcelular errônea.

2. transfecção de células e Cultura de Células

NOTA: Uma variedade de células são passíveis de análise FPP, incluindo Hek293, HeLa, COS-7 e células CHO ^14. A descrição a seguir baseia-se na expressão de proteínas de membrana em células Hek293.

1. Crescer as células embrionárias de rim humano (Hek293) como monocamadas aderentes em 6 ml de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado com soro a 5% de bovino fetal (FBS), piruvato de sódio a 1%, e 250 ug / ml de penicilina / estreptomicina a 37 ° C com 5% de CO _2. Realizar todos os trabalhos com células em um fluxo laminar de cultura de tecidos capô. Cultivar células em meio de cultura até ~ 80% confluentes em um frasco T-75.
2. Células transfecção usando qualquer padrão de elevada eficiência, baixo método de transfecção de toxicidade, incluindo lipídeos, tecnologias viral- ou à base de eletroporação para gerar transient ou expressão estável. Tipicamente de 2 ug de DNA de plasmídeo por 1 x 10 ⁶ células proporciona uma boa expressão de proteínas reprodutível. Manter células para 5-48 horas em meio de cultura de tecido apropriado, a 37 ° C em uma incubadora de CO ₂ capaz de cultura de tecidos.
3. Monitorar células para expressão da proteína de fusão GFP-usando microscopia de epifluorescência, utilizando o sinal de fluorescência intrínseca da GFP, utilizando conjuntos de filtros adequados de acordo com o protocolo do fabricante. Sinal de fluorescência geralmente atinge um máximo dentro de 24-72 horas após a transfecção. Use células quando o sinal de fluorescência atinge um nível máximo. Monitorizar os níveis de expressão de proteína por análise de imunotransferência utilizando anticorpos dirigidos quer contra a proteína de interesse ou a porção da GFP.
4. Para células da placa análise experimentais sobre lamelas revestidas. Ver ou sob uma configuração de células vivas ou após fixação e montagem em lâminas de microscopia. Células da placa para atingir 60% -80% de confluência no período de 24-48 h.
   1. Lamelas de revestimento com solução de poli-lisina (0,1 mg / ml), de modo que toda a superfície é coberta. Incubar durante 30 min sob uma luz ultra violeta à temperatura ambiente, seguido de 60 min numa incubadora de cultura de células a 37 ° C. Retire o excesso de poli-lisina e lavar as lamelas em PBS 3 vezes.
   2. Como alternativa, a chapa células em uma tampa de vidro câmaras que consiste em placas de cultura de célula com um fundo de vidro óptico para permitir imagens diretas com os objetivos de imersão em óleo. A verdadeira configuração microscopia depende do equipamento disponível para o investigador, mas deve ser capaz de mudanças rápidas da solução. Dependendo da forma do tipo de célula e de células, as células devem ser cerca de 60-90% confluentes no momento do ensaio FPP.

Setup 3. microscopia de fluorescência

1. Use um objetivo de imersão em óleo de alta abertura numérica (NA) para a coleta de sinal máximo e resolução espacial, como um 60X, 1,42 NA objetivo de imersão em óleo. Use the seguindo lasers para estimular os fluorophores: gás Argon 488 nm (GFP e YFP) e 561 de diodo (RFP, mCherry).
2. Determine a taxa de exposição, ganho e captura ideal de imagens para cada construção. Ajuste intensidade do laser e tempo de exposição para minimizar a fotodegradação (veja o passo 7.1.2).
3. Para os estudos que utilizam múltiplos fluorophores (por exemplo, um marcador solúvel para permeabilização da membrana em conjunto com um marcador de proteína de membrana), escolha os filtros utilizados para minimizar o sinal de cross-talk e maximizar a relação sinal-ruído.

4. Estabelecer as condições ideais para Plasma Membrane Permeabilização

1. Remover o meio de cultura celular a partir de células expressando apenas proteínas fluorescentes solúveis (por exemplo EGFP, DsRed). Lavam-se as células 3 vezes (1 min cada) em tampão de KHM (acetato de potássio 110 mM, 3 mM de MgCl _2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Realizar experiências com células e todos os reagentes à temperatura ambiente.
2. Coloque células Sn lamelas (veja o passo 2.4) em tampão KHM em um palco microscópio de fluorescência e recolher a primeira imagem, que representa o controle do estágio de "não-permeabilizadas '.
3. Para selectivamente permeabilizar a membrana plasmática, adicionar digitonina (30 uM) em tampão de KHM para as células. Perfundir células com tampão (tampão de digitonina +) a um caudal de 5 ml / min durante 10-60 seg.
4. Determinar a concentração óptima de digitonina, aumentando gradualmente a concentração de digitonina. A concentração óptima de digitonina é alcançado quando ocorre perda completa do sinal de fluorescência de EGFP solúvel dentro de 10-60 segundos de aplicação de digitonina. Para muitas células aplicação de 10-50 uM de digitonina é suficiente para permeabilizar a membrana celular.
   1. Para todos os aplicativos usam a menor concentração possível de digitonina. Coletar imagens após Digitonina permeabilização para sinal de fundo permeabilizada.
5. Confirme se a quimera GFP-proteína de interesse é na membranagrados confirmando retenção celular do sinal de fluorescência após a permeabilização digitonina da membrana plasmática ^16.
   1. Expressar uma proteína fluorescente organela específica ^23. Proteínas mitocondriais funcionar bem neste aspecto ^{de 16,} por exemplo, pDsRed2-Mito vector. Determinar as condições óptimas de expressão, tal como descrito na etapa 2.1.
   2. Confirmar que a concentração de digitonina é apropriado para o tipo de célula utilizado, assegurando que a morfologia das organelas intracelulares permanece constante ao longo (até 60 minutos) a exposição prolongada a digitonina.
      NOTA: Use protocolos de microscopia de imunofluorescência utilizando anticorpos padrão contra vários compartimentos celulares, tais como lisossomas (por exemplo, LAMP1), de Golgi (por exemplo, TGN38), retículo endoplasmático (por exemplo, calnexina), endossomas (por exemplo, Rab5), mitocôndria (por exemplo, o citocromo c). Se organela intracelular mudanças morfologia / integridade dramaticamente over 60 min, é provável que a concentração de digitonina era demasiado elevada, e requer uma diminuição na concentração de digitonina e / ou tempo de exposição.
      NOTA: Digitonin é tóxico por inalação e contato com a pele. Use equipamento de proteção individual (EPI).

5. Tratamento de Protease Proteínas Fluorescentes

1. Lavam-se as células em tampão de KHM e, em seguida, adicionar a protease (proteinase K; 50 ug / ml em tampão de KHM) directamente para as células. Perfundir células a uma taxa de fluxo de 5 ml / min utilizando um sistema de perfusão alimentada por gravidade para o banho continuamente preparação.
   1. Armazenar as soluções em seringas de 50 ml e um tubo de polietileno ligado reservatórios independentes para um colector com uma única saída na banheira (taxa de fluxo de 5 ml / min). A posição de uma pipeta de sucção para manter um constante (0,5 ml) e volume do banho atingir troca da solução de comutação manual entre reservatórios de perfusão.
2. Coletar imagens para determinar se o fluorsinal escent persistir ou se degradar. Uma perda de> 90% da intensidade de sinal inicial ao longo de 30-60 seg é consistente com a degradação proteolítica da proteína quimera-GFP (ver Resultados representativos).
3. Se nenhuma degradação do sinal é observado com proteinase K, quando essa perda é antecipada, substituir a solução de proteinase K com tripsina (4-8 mM) em tampão de KHM. Se necessário, utilizar uma mistura de proteinase K e tripsina. Não há necessidade para extinguir a actividade da protease.

6. abordagem alternativa para Plasma Proteínas de Membrana com domínios externos

1. Para as proteínas de membrana de plasma, para realizar o ensaio de proteínas fluorescentes externos quimeras antes de digitonina permeabilização. Lavam-se as células em lamelas em tampão de KHM (5 ml / min x 3 min), e tomar uma imagem para o tratamento de pré-protease e quantificar sinal de fluorescência pré-protease tal como no Passo 7.
2. Expor as células de protease (proteinase K; 50 ug / mL ou tripsina 4-8 mM em tampão de KHM) em tele ausência de digitonina em perfundir as células com meio contendo a protease KHM (taxa de fluxo de 5 ml / min). Coletar imagens da proteína fluorescente, para determinar a rapidez com que o sinal desaparece ou quanto tempo o sinal persiste.
3. Antes de permeabilização de digitonina, extingue toda a actividade de protease, por lavagem das células três vezes (1 min cada) em meios de cultura celular contendo 10% de soro (FBS).
4. Lavam-se as células com tampão de perfusão por KHM (taxa de fluxo de 5 ml / min) durante 2 minutos. Adquirir uma imagem de pré-permeabilização. Permeabilizar a membrana da célula, tal como descrito no Passo 4.
5. Coletar imagens seguintes disso protease como descrito na Etapa 5.

Análise 7. Imagem

1. Usar um microscópio invertido capaz de "célula viva" de gravação, em que a perda de sinal de fluorescência podem ser monitorizadas em tempo real. Para o monitoramento contínuo, empregam parâmetros idênticos (tempo de exposição, ganho de intensidade laser, etc.).
   1. Determine experparâmetros imental observando o sinal de fluorescência da GFP-proteína de interesse em condições de controle (ou seja, KBH tampão sozinho). Ajuste as configurações de tempo de ganho, de intensidade do laser e de exposição sobre o microscópio orientada por computador para garantir que não há perda significativa de intensidade de sinal ao longo de um período de 10-20 min.
      NOTA: A intensidade de sinal não é um valor absoluto, mas baseia-se no sistema de microscópio e configurações disponíveis para cada PI. Monitorar mudanças na intensidade de fluorescência relativa.
2. Alternativamente, o tratamento de células em conjunto pontos temporais em digitonina seguido de protease, e corrigir as células antes da montagem em lamelas de imagiologia. Determinar pontos de tempo empiricamente seguindo os procedimentos nas etapas 4 e 5. Para a investigação inicial, começam em 0, 30, 60, 120 e 300 além sec cargo de digitonina ou protease.
   1. Fix células (20 min) à temperatura ambiente utilizando uma quantidade suficiente de fixador (3,7% de paraformaldeído em PBS) para submergir inteiramente thcélulas e.
   2. Extingue-se paraformaldeído residual lavando as células com PBS contendo 20 mM de glicina (3 x 5 min).
   3. Montagem de lamelas, removendo o excesso de líquido da lamela e invertendo a lamela em meios de montagem 50 mL em uma lâmina para a criação de imagens. Permitir slides para secar durante a noite antes de imagem.
3. Recolhe imagens de microscopia de fluorescência (sob os conjuntos de filtros adequados compatíveis com o fluoróforo ser utilizada), utilizando a função de captação de imagem de vídeo em um computador controlado microscópio de fluorescência.
4. Quantificar intensidades do sinal de fluorescência como uma função da condição de incubação. Obter a média de intensidade de pixel dentro de uma região de interesse (ROI) que inclui uma célula individual.

Resultados

A permeabilização da membrana plasmática

Permeabilização da membrana plasmática eficiente é determinada pela utilização de proteínas fluorescentes solúveis (por exemplo, GFP, DsRed) (Passo 4). Estas proteínas, quando expressa nas células, são livres de se difundir no citosol, e são perdidos quando a membrana plasmática é permeabilizadas utilizando digitonina (Figura 2). Um completo desaparecimento do sinal fluorescente deve ocorrer dentro de 10-60 segundos ...

Discussão

A orientação correta e topologia de proteínas de membrana é essencial para o seu funcionamento adequado. Apesar da importância de compreender topologia proteína de membrana, existem muitas proteínas para as quais os dados são completamente inexistentes. FPP proporciona uma maneira fácil e eficaz de determinar a topologia de proteína de membrana, e uma que pode ser executado pela maioria dos laboratórios. A abordagem FPP oferece vantagens significativas em relação aos métodos anteriores para determinar a topologia de pro...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Digitonina	Calbiochem	300410
Proteinase K	Sigma	P2308
Tripsina	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
Polilisina	Sigma	P4707
Mídia de Montagem	Dako	cS704